桑树枝叶的药用功效在《本草纲目》已有较多记载[1-2]，且我国已将桑树枝叶作为治疗消渴症（糖尿病）的中药之一，应用于临床[3]。上个世纪80年代，日本科学家指出，桑树枝叶中的1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是治疗糖尿病的有效物质[4-5]。DNJ的化学结构[6]与葡萄糖相似，是桑树枝叶中的一种哌啶生物碱[7-8]。在自然界中，桑树枝叶中DNJ含量最高[9]。周炎等[10]通过灌胃等量桑枝水提液、二倍量桑枝水提液、盐酸二甲双胍片，高血糖小白鼠的血糖值4周后分别下降了7.63%、15.72%、18.41%，综合相关研究表明，桑叶枝叶中丰富的DNJ是α-葡萄糖苷酶的一种抑制剂[11]，具有降低血糖[12-15]、抑制病毒活性和抑制肿瘤转移等作用[16-18]。
微波提取法、超声波辅助提取法和超临界萃取技术[19-20]等作为新技术已经应用于DNJ的提取，其中胡瑞君等[21]利用微波萃取技术提取桑叶中DNJ，确定最佳提取工艺条件为：微波功率406 W，微波处理时间1.5 min，固液比 1 ∶40（g/mL），提取次数 2 次，DNJ提取率为0.024%。花俊丽等[22]通过超声波辅助提取法确定了提取DNJ的最佳条件为：超声功率125 W，每克桑叶浸提剂用量40 mL，超声温度70℃，超声时间20 min，DNJ的得率为0.091%。由于DNJ分子在紫外、可见光波段内无吸收峰，因此常规的分光光度法无法检测其存在和含量[23]，而常采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法[24-25]、柱前衍生化高效液相色谱法[26-27]、气相法[28]等方法检测DNJ。
研究与开发内生真菌已成为解决某些植物药药源危机的最佳途径之一[29]。现已证明，内生真菌能够参与植物活性成分的合成或对植物的次级代谢产物有转化作用[30]。同时，桑树内生真菌具有丰富的生物多样性[31]且能产生黄酮类物质[32]。本试验通过分离桑树中内生真菌及其发酵试验，培养并鉴定内生真菌，通过FMOCCl柱前衍生化高效液相色谱法对其产生的DNJ进行分析，初步认为有望利用该菌株提高DNJ的产率。
1 材料与方法
1.1 试验材料
桑树健康枝条采摘于浏阳河畔（系统随机抽样）：桑叶粉末由湖南农业大学生物科学技术学院实验室提供；土豆：市售。
1.2 主要仪器设备
CR21G高速冷冻智能离心机：日本日立公司；SWCJ-1B单人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司；DK-8B电热恒温水浴锅、GRX20干热消毒箱、SYC-L1电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；TOMY SS-325湿热灭菌锅：Tomy KOGYO有限公司；AL204电子天平：梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司；PHB-1笔型pH计：上海宇龙仪器有限公司；PYX-250Z-A振荡培养箱：广东韶关科力实验仪器有限公司；1200Series高效液相色谱仪、ZORBAX Eclipse XDB C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）：安捷伦科技有限公司；BCD-216ZDJ海尔冰箱：青岛海尔股份有限公司。
1.3 试剂
DNJ（纯度 99%）：Sigma公司；芴甲氧羰酰氯（9-fluorenylmethyl chloroformate，FMOC-Cl）（纯度 98%）：上海共价化学科技有限公司；95%酒精、葡萄糖（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；四硼酸钠（分析纯）：中国医药（集团）上海化学试剂公司；琼脂粉末：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；100万单位注射用硫酸链霉素：华北制药股份有限公司；甲醇（色谱纯）：SK化工；冰乙酸（分析纯）：天津市博迪化工有限公司。
1.4 培养基
分离与保藏培养基：土豆20%、葡萄糖2%、琼脂1.8%～2.0%，自然pH，121℃灭菌25 min，灭菌后加入100 μg/mL硫酸链霉素。
发酵培养基：20%土豆、2%葡萄糖。自然pH，121℃灭菌25 min。
1.5 方法
1.5.1 内生真菌的分离培养和鉴定
参照梁嘉俊的方法[33]分离桑树产生的内生真菌。用自来水冲洗直径约0.5 cm的新鲜健康桑树枝条，晾干后将其切成长度约1.5 cm数小段。在超净工作台上，依照下列过程按无菌操作方法对其进行表面灭菌：首先用75%的酒精漂洗3 min～5 min，无菌水冲洗3次～4次，再用0.1%升汞漂洗15 min，最后用无菌水冲洗5次。将已灭菌处理的桑树枝条在已灭菌的培养皿中沿枝条纵向切成两半（直径0.5 cm左右、长度为1.5 cm左右的半圆柱形），用已灭菌的镊子将其接种于马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基平板上（将纵切面接触培养基），然后将平板置于28℃恒温培养箱中培养，每日观察并检查是否有杂菌污染；待与培养基接触的纵切面边缘有菌丝体长出，将菌丝体转接到新的PDA培养基平板上进行分离纯化；经过多次分离纯化，将菌丝体接种于试管斜面，保存备用。
依照丝状真菌的鉴定方法，根据菌落和孢子形态对菌丝体进行初步鉴定；然后将菌种寄到北京三博远志公司对菌丝体进行精确鉴定。
为了确定桑树枝条表面灭菌的彻底性以及超净工作台内空气的洁净度，试验设计了一个内生真菌培养的对照组和空白组。对照组：直接将灭菌处理的桑树枝条接种在PDA培养基平板上，再置于相同条件下进行培养；空白组：将PDA培养基平板盖揭开并将PDA培养基平板暴露在空气中一段时间后，再采用相同的方法进行培养。如果对照组的桑树枝条周围无任何菌丝体长出，空白组培养基上无菌落长出，则说明超净工作台内空气洁净度较高，桑树枝条表面灭菌彻底，所分离到的菌是桑树枝条内生菌，而不是桑树枝条表面的附生菌。
1.5.2 菌种发酵试验
参照何佳等的方法[34]分离桑树产生的内生真菌。菌种发酵试验分为3组：试验组、对照组以及空白组。试验组：共两组，一组将不加入桑叶粉末的PDA培养基进行灭菌后，接种已鉴定菌种进行摇瓶液体发酵；另一组将按料液比1∶30（g/mL）加入桑叶粉末的PDA培养基进行灭菌后，接种已鉴定菌种进行摇瓶液体发酵；两组培养温度均为28℃，发酵周期为7 d。对照组：将按料液比1∶30（g/mL）加入桑叶粉末PDA培养基进行灭菌后不接种菌种，与试验组在同样条件下发酵处理7 d。空白组：将PDA培养基发酵液灭菌后，与试验组在同样条件下发酵处理7 d。
1.5.3 内生真菌的液体培养物的处理
首先将摇瓶发酵液在10 000 r/min下离心10 min，取上清液于容量瓶中；然后将20 mL 80%乙醇与沉淀混匀，离心10 min，取上清液于容量瓶中；再将20 mL水与沉淀混匀，离心10 min，取上清液于容量瓶中，定容至刻度，备用。
1.5.4 高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）条件
1.5.4.1 标准溶液的配制
精确称取5 mg DNJ标准品于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得浓度为0.5 mg/mL的DNJ样品对照溶液。
1.5.4.2 DNJ衍生化
参考唐静等的方法[35]处理DNJ。取100 μL DNJ样品对照溶液（或140 μL发酵液提取液）于1.5 mL的离心管中，加入0.4 mol/L的硼酸盐缓冲液（pH=8.5）169 μL 与10 mmol/L 的 FMOC-Cl乙腈溶液 250 μL，混匀后于30℃恒温水浴20 min，然后加入1%醋酸溶液66 μL，用水定容，再于 10 000 r/min 离心 3 min（10℃），取上清液过膜，用于HPLC检测。
1.5.4.3 色谱条件
色谱柱：ZORBAXEclipseXDBC18（4.6mm×150mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%冰醋酸（55∶45，体积比），流速：0.8 mL/min，柱温：30℃；检测波长：265 nm。
1.5.5 DNJ目标峰的确定
分别吸取100、150 μL DNJ样品对照溶液，按照1.5.4.2的方法配置出不同浓度DNJ衍生样品对照溶液，同时，配置无DNJ的单独衍生剂样品对照溶液；分别进样DNJ衍生样品对照溶液与衍生剂样品对照溶液，从而确定DNJ目标峰位置。
1.5.6 标准曲线制备
根据单因素试验，分别精确吸取DNJ样品对照溶液 1、3、5、7、9 μL（根据单因素试验设计），按照 1.5.4.2的方法进行衍生化反应，进样测定DNJ含量，做出标准曲线。
1.5.7 稳定性试验
取同一DNJ样品溶液，衍生化后置于4℃冰箱中保存 2、4、6、12、24 h（根据单因素试验设计）后，进样检测并记录出峰的保留时间及峰面积，并以峰面积的自然对数计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。
1.5.8 HPLC检测发酵液中的DNJ
将发酵提取液按照1.5.4.2进行衍生化反应，每次准确吸取20 μL进样检测，用外标法计算DNJ含量。
2 结果与分析
2.1 内生真菌的分离及鉴定结果
桑树枝条内生真菌菌丝生长图见图1。
图1 桑树枝条内生真菌菌丝生长图
Fig.1 The growth of endophyte mycelium in mulberry branch
1为空白组；2为对照组；3为试验组。
桑树枝条内生真菌菌丝外观图见图2。
图2 桑树枝条内生真菌菌丝外观图
Fig.2 The appearance of endophyte mycelium in mulberry branch
1为培养皿正面；2为培养皿底部；3为显微镜下菌丝体（100×）。
由图1和图2可知，试验组桑树枝条一端生成的菌落为内生真菌且为单一菌落。
菌种被寄至北京三博远志公司进行鉴定，其结果如表1所示。
由表1可知，从桑树中分离的内生真菌与Hy－poxylon sp.SUT242具有较高的同源性，其可能属于Hypoxylon的一个种。
表1 内生真菌的鉴定结果
Table 1 Identification results of endophytic fungi
样品名称 扩增序列 参考物种 基因登记号 分类 同源度/%1 I T S H y p o x y l o n s p.S U T 2 4 2 D Q 3 2 2 1 0 7.1 E u k a r y o t a;F u n g i;D i k a r y a;A s c o m y c o t a;P e z i z o m y c o t i n a;S o r d a r i o m y c e t e s;X y l a r i o m y c e t i d a e;X y l a r i a l e s;X y l a r i a c e a e;H y p o x y l o n 8 5
2.2 DNJ目标峰的确定结果
DNJ目标峰确定的HPLC图谱见图3。
图3 DNJ目标峰确定的HPLC图谱
Fig.3 The determinate HPLC chromatogram of DNJ target peak
a、b、c分别为含DNJ 100、DNJ 150 μL对照溶液和不含DNJ的对照溶液色谱图。
通过对比图3中3个色谱图，含150 μL DNJ衍生样品对照溶液在16.5 min左右出现的色谱峰的峰高与峰面积比含100 μL DNJ衍生样品对照溶液在16.5 min左右出现的色谱峰高且大，而27.5 min左右出现的色谱峰较小；不含DNJ的FMOC-Cl样品对照溶液只在27.5 min左右出现一个色谱峰，且峰高和峰面积比含DNJ的两个在27.5 min左右出现的峰高且大，确定此峰为衍生剂峰，从而确定图3中a、b色谱图16.5 min左右出现的色谱峰为目标峰，即所需要的DNJ的色谱峰。
由于本试验采用FMOC-Cl柱前衍生高效液相色谱法，衍生剂FMOC-Cl是荧光物质且在紫外－可见光区域具有吸收，其在HPLC检测中能够被检测出，因此，图3中a、b两个色谱图存在两个色谱峰。
2.3 DNJ标准曲线
图4为DNJ的标准曲线，曲线方程为y=215.14x+103.08，相关系数为R2=0.995 7，表明具有良好的线性关系，符合试验要求。
图4 DNJ标准曲线
Fig.4 The standard curve of DNJ
2.4 稳定性试验结果
稳定性试验结果见表2。
表2 稳定性试验结果
Table 2 Results of stability experiment
注：保留时间RSD太小，忽略不计；峰面积RSD为0.32%。
检测时间/h保留时间/m i n峰面积/（m A U×m i n）2 1 6.4 9 3 1 2 9 3 5.2 4 1 6.5 9 6 1 1 9 9 9.4 6 1 6.5 2 3 1 2 6 9 2.2 1 2 1 6.6 5 8 1 2 8 0 3.5 2 4 1 6.5 3 9 1 2 7 9 3.0
由表2可知，采用FMOC-Cl柱前衍生化高效液相色谱法检测出的DNJ峰面积的RSD为0.32%，表明FMOC-Cl柱前衍生化后溶液在24 h内是稳定的。
2.5 样品测定结果
试验样品中DNJ含量测定结果见表3。
由表3中可知，空白组中未检测出DNJ含量，对照组中DNJ的平均含量为2.987 μg/mL，试验组中菌种发酵液中未检测出DNJ的含量，菌种和桑叶粉末发酵液中DNJ的平均含量为3.485 μg/mL，较对照组中DNJ含量高。由此可知该菌种自身无法产生DNJ物质，推测其可将桑叶中的相关物质代谢转化为DNJ。试验样品中DNJ含量测定色谱图见图5。
表3 试验样品中DNJ含量测定
Table 3 The contents of DNJ in experimental samples
对照组/（μ g/m L）试验组/（μ g/m L）桑叶粉末发酵液 菌种发酵液 菌种+桑叶粉末发酵液1 0 3.2 9 0 0 3.3 6 7 2 0 2.7 2 1 0 2.7 2 7 3 0 3.2 5 2 0 3.4 0 4 4 0 2.8 1 6 0 3.6 6 5 5 0 2.8 5 2 0 4.2 6 1平均值 0 2.9 8 7 0 3.4 8 5标准差 0 0.2 1 6 0 0.4 5 3编号 空白组/（m g/m L）
图5 试验样品中DNJ含量测定色谱图
Fig.5 The DNJ content determination chromatograms in experimental samples
a为空白组色谱图；b为对照组桑叶粉末色谱图；c为对照组菌种发酵液色谱图；d为试验组发酵液色谱图。
由图5a可知，在16 min～17 min之间未出现DNJ目标峰，这是由于PDA液体培养基中不含DNJ物质；在27 min后出现了两个较高的峰，其原因可能为FMOC-Cl不稳定，在水溶液中水解成在检测条件下存在荧光吸收的FMOC-OH。FMOC-OH出峰的保留时间与衍生剂FMOC-Cl的相近，影响衍生剂FMOC-Cl出峰时间的判断，对试验具有干扰作用。
由图5b可知，在16 min～17 min之间出现DNJ目标峰，但此峰存在拖尾现象，并且整个检测过程中出现许多杂峰，其原因为桑叶粉末中物质种类较多，经发酵处理后，许多物质溶解至发酵液中，且发酵液未经纯化处理。
由图5c可知，在16 min～17 min之间未出现DNJ目标峰，这是由于菌种发酵液中不含DNJ，说明该菌株自身无法产生DNJ。
由图5d可知，在16 min～17 min之间出现了DNJ目标峰，此峰无拖尾现象，但整个检测过程中出现了许多的杂峰，其原因为桑叶粉末中物质种类较多，经过发酵处理后，菌种代谢产生的其他物质，溶解到了发酵液中，且发酵液未经纯化。
3 讨论
试验表明，检测灭菌效果和选择表面灭菌的最佳条件对分离内生真菌具有重要的作用。本试验设计了一个对照组检测灭菌效果，但其不够严密，因为如果杀菌强度未达到杀死组织内全部内生真菌的程度，内生真菌仍旧会长出，这将会误判杀菌强度不足，而表面杀菌强度越强，表皮下灭菌层则越厚，能够分离到的内生真菌越少，生存在更深层、未被杀死的内生真菌需要更长的培养时间穿越杀菌层，生长到植物材料表面。
4 结论
本试验对桑树内生真菌及其对桑叶粉末产生DNJ的效果进行了初步分析，得出初步结论：从桑树枝条中分离出来的内生真菌与Hypoxylon sp.SUT242具有较高的同源性，其可能属于Hypoxylon的一个种；其在PDA培养基中不能自身产生DNJ物质，但能将桑叶中的某些物质转化成DNJ。
目前国际市场对桑叶提取物供不应求[36]，实验室分离检测桑树内生真菌的操作不够成熟。经研究发现，试验可将制备的真菌诱导子加入培养的桑叶愈伤组织中，观察其是否能够诱导愈伤组织产生DNJ物质，或者将制备的桑叶悬浮细胞与内生真菌共同培养，研究其与DNJ积累的关系。桑树内生真菌的分离检测及其与DNJ的积累关系仍有待进一步研究。
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