蓝靛果是一种可食用的野生浆果，果实柔软多汁、风味独特，且有丰富的营养物质[1]。蓝靛果含有花色苷、黄酮类化合物、多酚和大量的维生素等[2]。研究表明，蓝靛果果实中的有机酸、碳水化合物含量分别以柠檬酸、葡萄糖最多，并含有16种氨基酸等[3]。蓝靛果具有较强的抗氧化作用，还有降血脂、抗肥胖、抗脂肪肝、抗辐射和抗癌等作用[4-5]。在抵抗疾病和保持身体健康等方面有重要的作用，有较好的发展前景[6]。
蓝靛果的采收集中，贮藏期短，果实采收后容易出现组织软化、腐败变质等问题，所以鲜食只占市场的一小部分，更多的是被用于制作各种加工品[7-8]。各种小浆果的饮品就是以浆果汁为主要原料生产的[9]。因此，对蓝靛果果汁提取工艺进行优化，对于提高蓝靛果的利用率和价值至关重要。酶处理有助于促进细胞壁中纤维素水解和果胶解聚，提高出汁率[10-12]。
目前，关于蓝靛果的研究报道有很多，大多都是关于栽培，针对蓝靛果的高值化加工方面研究还不多。本试验以蓝靛果作为研究对象，利用所选择的果胶酶和纤维素酶对蓝靛果的出汁率进行响应面优化，研究这些酶对蓝靛果果汁中的生物活性物质（总酚、花色苷、总黄酮等）含量的影响，并对蓝靛果果汁的抗氧化特性进行研究，为企业大规模生产提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
蓝靛果：采自小兴安岭伊春地区的鲜果，挑选无损伤鲜果并在-20℃下储存备用；果胶酶（107000U/g）、纤维素酶（101 900 U/g）：宁夏和氏璧生物技术有限公司；1，10-菲啰啉（1，10-phenanthroline monohydrate，BP）：天津市科密欧化学试剂有限公司；福林-酚试剂、1，1-二苯基-2-三硝基苯（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[（2，2'-azinobis（3-ethylbenzothiaoline-6-sulphonic acid），ABTS]：美国 Sigma 公司；其他常见试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
数显恒温水浴锅（HH-1）：常州赛普实验仪器厂；多功能打浆机（MJ-WJS1222F）：美的集团股份有限公司；电子天平（FA1004）：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；台式高速冷冻离心机（HR/T20M）：湖南赫西仪器装备有限公司；紫外可见分光光度计（UV-5500PC）：上海元析仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 蓝靛果的酶解工艺
取适量的蓝靛果于室温（20℃）下解冻，用打浆机破碎成匀浆，准确称取20 g的蓝靛果浆加入锥形瓶中，再加入一定量的果胶酶和纤维素酶，搅拌均匀，然后将其放入一定温度的水浴锅中酶解一定时间，酶解后5 000 r/min离心15 min，得到蓝靛果的清汁。
1.3.2 酶解优化试验
1.3.2.1 单因素试验
准确称取20 g蓝靛果浆，初步选定果胶酶添加量为0.2%，纤维素酶添加量为0.6%，酶解时间为1.5 h，酶解温度50℃为基础条件，以出汁率为指标，依次研究果胶酶添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、纤维素酶添加量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、酶解时间（1、1.5、2、2.5、3 h）、酶解温度（30、40、50、60、70℃）的条件下，各因素对蓝靛果出汁率的影响，每个试验重复3次。
1.3.2.2 响应面优化试验设计
根据以上单因素试验结果，以蓝靛果的出汁率为响应值，进行响应面分析，得到最优的工艺条件。酶解响应面试验因素及水平见表1。
表1 酶解响应面试验因素及水平
Table1 Enzymatic response surface test factors and levels
水平 因素A果胶酶添加量/% B纤维素酶添加量/% C酶解温度/℃-1 0.20 0.80 40 0 0.25 0.90 45 1 0.30 1.00 50
1.3.2.3 出汁率的测定
取经酶解后的蓝靛果浆20 g于50 mL离心管中，5 000 r/min离心15 min，取上清液，测定上清液的质量，依据公式计算出汁率[13]。
1.3.3 活性物质及抗氧化活性的测定
1.3.3.1 生物活性物质含量的测定
VC含量的测定采用分光光度计法[14]；花色苷含量的测定参照王纯等[15]的pH示差法测定；总酚含量的测定参照王琴等[16]方法测定；总黄酮含量的测定采用NaNO2-Al（NO3）3比色法[17]。
1.3.3.2 体外抗氧化活性的测定
DPPH自由基清除能力的测定参照H.Liang等[18]方法测定；羟自由基（·OH）清除能力的测定参照张丽媛等[19]方法测定；ABTS+·清除能力的测定根据ZHANG Nai-xun 等[20]和 Helena 等[21]方法测定。
2 结果与分析
2.1 酶解优化单因素试验结果
2.1.1 果胶酶添加量对出汁率的影响
果胶酶常应用于果蔬，可以有效地提高果蔬的出汁率，保证产品贮存稳定性和改善其过滤速度等[22]。果胶酶添加量对蓝靛果出汁率的影响结果见图1。
图1 果胶酶添加量对蓝靛果出汁率的影响
Fig.1 Effect of pectinase addition on lonicera edulis juice yield
不同字母代表差异显著（P＜0.05）。
由图1所示，以不添加果胶酶的样品为对照，蓝靛果的出汁率随着果胶酶的增加先快速增大后变得平缓。因为底物浓度一定时，果胶酶添加量越大，底物和酶的反应会越完全，蓝靛果的出汁率会越高。当果胶酶添加量增加到一定量，反应就会饱和，出汁率就增加不明显。当果胶酶添加量超过0.3%后，蓝靛果的出汁率增加趋势较为缓慢，维持在76%左右。使用大量的果胶酶会造成浪费和影响蓝靛果汁的口味等。因此，选择果胶酶的添加量在0.2%～0.3%。
2.1.2 纤维素酶添加量对出汁率的影响
纤维素酶可降解浆果中的纤维素、半纤维素、果胶等，从而提高出汁率[23]。纤维素酶添加量对蓝靛果出汁率的影响见图2。
由图2可知，在纤维素酶酶解过程中，以不添加纤维素酶的样品为对照，增加纤维素酶的添加量，出汁率会不断增大。蓝靛果在纤维素酶添加量达到1.0%时，出汁率达到了77.18%，与对照相比出汁率提高了8.87%。继续增加纤维素酶的用量，蓝靛果的出汁率增加不明显。因为过量的纤维素酶不能与足够的底物相互反应，所以出汁率就会增加不明显。因此，选择纤维素酶的添加量为0.8%～1.0%。
2.1.3 酶解时间对出汁率的影响
图2 纤维素酶添加量对蓝靛果出汁率的影响
Fig.2 Effect of cellulase addition on lonicera edulis juice yield
不同字母代表差异显著（P＜0.05）。
酶会对植物的细胞壁进行水解，促进细胞内的物质释放出来，从而增加出汁率。酶解时间对蓝靛果出汁率的影响见图3。
图3 酶解时间对蓝靛果出汁率的影响
Fig.3 Effect of enzymolysis time on juice yield of lonicera edulis
不同字母代表差异显著（P＜0.05）。
由图3可以看出，以0.5 h为对照，酶解时间越长，出汁率越高。蓝靛果的出汁率在0.5 h～1.5 h内涨幅较快，当酶解时间为1.5 h时，出汁率达到了72.83%。酶解时间超过1.5 h后，出汁率的增加变得缓慢。因为在一定的反应时间内，酶和底物就会反应完全，再增加反应的时间，对蓝靛果的出汁率影响不大。综合考虑，选择酶解时间为1.5 h。
2.1.4 酶解温度对出汁率的影响
酶解温度对蓝靛果出汁率的影响见图4。
由图4可知，以常温20℃为对照，酶解温度在20℃～50℃范围内时，蓝靛果的出汁率随酶解温度的升高而增大。当温度达到50℃时，蓝靛果的出汁率达到最大值73.83%。随后再增加温度，蓝靛果的出汁率降低。这是因为，酶要在一定温度范围内才能发挥其活性的作用，酶解温度过低，底物与酶不能有效的反应，过高的温度则会使酶失活[24]。在酶解过程中，选择40℃～50℃作为酶解的最适温度。
图4 酶解温度对蓝靛果出汁率的影响
Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on juice yield of lonicera edulis
不同字母代表差异显著（P＜0.05）。
2.2 酶解优化响应面试验结果
2.2.1 响应面试验设计及结果
综合单因素试验结果可知，酶解时间超过1.5 h后蓝靛果出汁率增长较小，为节约成本和时间，选定果胶酶添加量（A）、纤维素酶添加量（B）和酶解温度（C）3个因素进行Box－Behnken设计响应面分析试验，得到最佳的酶解优化条件。响应面试验设计及结果见表2。
表2 响应面试验设计及结果
Table 2 Box-Benhnken design and results
试验号 A B C 蓝靛果出汁率/%1 -1 1 0 77.48 2 0 1 1 81.93 3 83.93 4 1-1 0 79.15 0 0 0 5-1 81.40 6 0 0 0 84.80 0 1 7-1 0 1 81.75 8-1 0 -1 81.15 9 1 0-1 81.45 10 0 -1 -1 80.55 11 -1 -1 0 80.70 12 0 0 0 85.35 13 1 1 0 83.48 14 0 0 0 85.40 15 1 0 1 83.35 16 0 -1 1 80.73 17 0 0 0 84.28
2.2.2 方差分析及互交作用
用Design－Expert 8.0对数据进行拟合分析，得到回归方程为：蓝靛果的出汁率/%＝84.75+0.79A+0.39B+0.40C+1.89AB+0.32AC+0.087BC-1.89A2-2.66B2-0.94C2。回归模型方差分析见表3。
表3 回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression model
注：**差异极显著（0.000 1＜P＜0.01）；*差异显著（0.01＜P＜0.05）。
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值模型 75.47 9 8.39 19.43 0.000 4**A 5.04 1 5.04 11.68 0.011 2*B 1.24 1 1.24 2.87 0.133 9 C 1.28 1 1.28 2.97 0.128 8 AB 14.25 1 14.25 33.01 0.000 7**AC 0.42 1 0.42 0.98 0.355 5 BC 0.031 1 0.031 0.071 0.797 6 A2 15.00 1 15.00 34.75 0.000 6**B2 29.85 1 29.85 69.14 0.000 1**C2 3.70 1 3.70 8.57 0.022 1*残差 3.02 7 0.43失拟误差 1.33 3 0.44 1.05 0.462 5纯误差 1.69 4 0.42总和 78.49 16 R2＝0.961 5 RAdj＝0.912 0
从表3中可以看出，回归模型的显著性很高（P＝0.000 4＜0.01），缺乏拟合用于验证模型的充分性且不显著（P＝0.462 5>0.05），表明该模型的试验数据可靠，R2＝0.961 5接近1，表明此模型拟合较好，试验误差小，可用此模型对酶解的蓝靛果出汁率进行分析和预测。根据F值可知，各个因素对蓝靛果出汁率的影响大小顺序为：果胶酶（A）>酶解温度（C）>纤维素酶（B）。
响应曲面图和等高线图是回归方程的图形化表示，说明独立变量对响应变量的主要交互作用[25]。各因素交互作用对蓝靛果出汁率影响的等高线图和响应面图见图5。
图5显示了蓝靛果出汁率与各因素之间的关系，由图5a可以看出，随着酶用量的增加，蓝靛果出汁率先增加后减少，且果胶酶对蓝靛果出汁率的影响要大于纤维素酶；由图5b可以看出，果胶酶对蓝靛果出汁率的影响要远大于酶解温度；由图5c可以看出，酶解温度和纤维素酶用量对蓝靛果出汁率的影响不明显，且酶解温度对蓝靛果出汁率的影响要大于纤维素酶。这与表3中方差分析的结果一致。
图5 各因素交互作用对蓝靛果出汁率影响的等高线图和响应面图
Fig.5 Contour map and response surface diagram of the interaction of various factors on juice yield of lonicera edulis
a.果胶酶与纤维素酶添加量对蓝靛果出汁率的影响；b.果胶酶添加量与酶解温度对蓝靛果出汁率的影响；c.纤维素酶添加量与酶解温度对蓝靛果出汁率的影响。
2.2.3 最佳条件的确定和回归模型的验证
根据响应面的回归模型，确定蓝靛果出汁率的最佳条件为：果胶酶添加量0.27%、纤维素酶添加量0.92%、酶解温度46.40℃，此时预测的蓝靛果的出汁率为86.98%。为便于实际操作，选择果胶酶添加量为0.27%、纤维素酶添加量为0.92%、酶解温度为47℃。在这个工艺条件下，得到蓝靛果的出汁率为85.67%，与预测值的差异为1.31%，表明此回归模型可以较好地预测蓝靛果的出汁率。
2.3 酶解对蓝靛果汁品质的影响
采用优化后的最佳酶解工艺对蓝靛果进行酶解，测定酶解后蓝靛果汁中各活性物质的含量，对照组为自然解冻下未加酶的蓝靛果汁。酶解前后蓝靛果汁中活性物质含量的变化结果见图6。
由图6可知，复合酶解后，蓝靛果汁中的活性物质含量都有一定的增加。复合酶解后，蓝靛果汁中的活性物质含量与对照组相比有显著增加，VC含量可达5.11 mg/mL、花色苷含量为3.13 mg/mL、总酚含量为3.11 mg/mL、总黄酮含量达到6.97 mg/mL。通过对比单一酶解和复合酶解后蓝靛果汁中活性物质含量，可以得出，复合酶解工艺有利于蓝靛果汁中活性物质的溶出。
图6 酶解前后蓝靛果汁中活性物质含量的变化
Fig.6 Changes of active substances in lonicera edulis juice before and after enzymolysis
字母不同表示差异显著（P<0.05）。
2.4 蓝靛果汁体外抗氧化能力
2.4.1 DPPH自由基清除能力
蓝靛果汁对DPPH自由基的清除能力见图7。
图7 蓝靛果汁对DPPH自由基的清除能力
Fig.7 Scavenging activity of lonicera edulis juice on DPPH free radical
由图7可知，酶解前后的蓝靛果汁和VC对照组对DPPH自由基能较好地清除，在所选的质量浓度范围内，清除率随质量浓度增加而增强。酶解前后的蓝靛果汁对自由基的清除活性有一定差异，VC的清除能力要优于蓝靛果汁，蓝靛果汁的清除能力酶解后要优于酶解前，酶解前后的IC50值分别为0.551 mg/mL和0.285 mg/mL。当质量浓度为1.8 mg/mL时，酶解前后的蓝靛果汁对DPPH自由基的清除率可达80.56%和88.13%。
2.4.2 ·OH清除能力
·OH是最活泼的活性氧自由基，是有毒的氧化代谢副产物，可以改变细胞的功能和结构等[26]。蓝靛果汁对·OH的清除能力见图8。
图8 蓝靛果汁对·OH的清除能力
Fig.8 Scavenging activity of lonicera edulis juice on·OH
由图8可知，以VC为对照，酶解前后的蓝靛果汁对·OH的清除率随质量浓度增加而增大，且清除率均低于VC。酶解前后的IC50值分别为8.66 mg/mL和6.37 mg/mL。当质量浓度为12 mg/mL时，酶解前后的蓝靛果汁对·OH的清除率可达61.40%和74.12%。蓝靛果汁对·OH有较好的清除作用。
2.4.3 ABTS+·清除能力
蓝靛果汁对ABTS+自由基的清除能力见图9。
图9 蓝靛果汁对ABTS+自由基的清除能力
Fig.9 Scavenging activity of lonicera edulis juice on ABTS+free radical
由图9可以看出，VC和酶解前后的蓝靛果汁对ABTS+·的清除能力随质量浓度增加而增大，蓝靛果汁有较强的清除能力，且低于VC。酶解前的蓝靛果汁在质量浓度为60 mg/mL时，对ABTS+·的清除率可达92.90%。酶解后的蓝靛果汁对ABTS+·的清除能力要优于酶解前，酶解后的蓝靛果汁在质量浓度为40mg/mL时，ABTS+·的清除能力基本达到平衡，清除率高达94%左右。酶解前后的IC50值分别为17.15 mg/mL和11.62 mg/mL。
3 结论
利用响应面设计试验对蓝靛果的酶解条件进行优化。得到的最佳条件为：果胶酶添加量0.27%、纤维素酶添加量0.92%、酶解温度为47℃。在此工艺条件下，蓝靛果的出汁率为85.67%。酶解对蓝靛果汁中的VC、花色苷、总酚和总黄酮都有积极的影响，其中对VC含量和总黄酮含量的影响较为显著。通过对DPPH·、·OH、ABTS+·的清除能力来评价蓝靛果汁的抗氧化活性，酶解对蓝靛果汁的抗氧化能力有显著提升，IC50值减小。酶解后的蓝靛果汁具有较高的清除率，当质量浓度为1.8 mg/mL时，蓝靛果汁对DPPH自由基的清除率为88.13%；当质量浓度为12 mg/mL时，蓝靛果汁对·OH的清除率为74.12%；蓝靛果汁在质量浓度为60mg/mL时，ABTS+·的清除率达到最大为94.67%。利用酶解法提高蓝靛果的出汁率，增加其生物活性物质的溶出，提高其抗氧化活性，这有利于蓝靛果高值化研究和功能性产品的开发。
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