苦荞麦，又名万年荞、野兰荞，简称苦荞，学名“鞑靼荞麦”（Fagopyrum tararicum），属蓼料双子叶植物[1]，起源于中国西南地区[2]，在陕西、山西、甘肃、云南、贵州、四川等省份均有栽种，是一种药食同源的农作物。苦荞麦含有淀粉（40.70%～86.41%）[3]、蛋白质（8.51%～18.87%）[4]、膳食纤维（3.4%～5.2%）[5]、微量元素以及抗氧化剂[6]等营养物质，与一般的粮食作物相比有较好的营养价值。苦荞麦富含的18种氨基酸中[7]，赖氨酸、甘氨酸和精氨酸含量相对较高，可以成为其它食品的补充剂[8]。苦荞麦蛋白有降低胆固醇、抗高血压、改善便秘和肥胖[9-11]、抗疲劳、抑菌等生理活性[12-13]。苦荞麦蛋白与豆类作物相似，根据能在不同的溶剂中溶解可分为清蛋白、球蛋白、谷蛋白及醇溶蛋白。不同地区苦荞麦各蛋白组分有所差异，苦荞麦不同部位蛋白所占比例也有差异。大部分研究显示清蛋白和球蛋白含量相对较高[3]，而其余两种蛋白含量则相对较少[8，14]，李红梅等[15]在研究贵州威宁苦荞麦蛋白时得出清蛋白占总蛋白42.65%；有关学者[16]在研究甘肃定西苦荞麦蛋白时得出清蛋白占总蛋白32.20%。苦荞麦中不同蛋白均具有不同程度的降血脂功能，其中降血脂能力依次为清蛋白>球蛋白>谷蛋白[17]。李相沂[18]通过研究苦荞麦不同蛋白组分，分析表明在中性蛋白酶作用下清蛋白的酶解物对血管紧张转化素酶（angiotensin converting enzyme，ACE）有抑制活性，其抑制率可达33.38%，除此之外清蛋白还有较好的功能特性。目前对清蛋白提取条件进行优化的研究多集中在绿豆、芸豆、菜籽粕、米糠等谷物和副产物[19]。苦荞麦蛋白的研究大部分集中在对总蛋白的提取条件进行优化，而对苦荞麦清蛋白提取条件的优化相对较少。
目前对苦荞麦蛋白提取的方法主要有碱法提取、酶法提取、微波辅助提取、等电点法、Osborne分级法。大部分研究者多采用传统的碱溶酸沉法，但是在使用酸碱的过程中，容易引起蛋白质中部分氨基酸发生反应从而生成有毒物质，而且大量使用酸碱也会对环境造成污染。Osborne分级法提取蛋白操作简单、成本低。本文采用响应面法多个影响因素与响应值之间的函数关系，利用Box-Behnken中心组合试验设计，对试验数据进行分析，利用二次回归方程进行拟合，通过数据分析找出最佳工艺条件，为苦荞麦水溶性清蛋白的提取及综合开发利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料和仪器
1.1.1 原料和试剂
苦荞麦：采摘于贵州省威宁县；85%磷酸：成都金山化学试剂有限公司；牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250：北京索莱宝科技有限公司；95%乙醇、石油醚：天津市富宇精细化工有限公司。
1.1.2 主要仪器
冷冻型多功能离心机（Thermo CR3i）：美国赛默飞世尔科技公司；集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101S）：上海邦西仪器科技有限公司；酶标仪（Spectra-Max
190）：MolecularDevices；电子分析天平（FA2004N）：上海菁海仪器有限公司；高速多功能粉碎机（XTP-200G）：浙江永康市红太阳机电有限公司；循环水式多用真空泵（SHB-Ⅲ）：郑州长城科工贸有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 材料的处理
将干燥的苦荞麦种子于多功能粉碎机中粉碎，过80目筛。在苦荞麦粉中以1∶5（g/mL）的比例加入石油醚进行脱脂处理，脱脂期间数次更换石油醚[20-22]将脱脂后的苦荞麦粉过滤收集，于通风橱中风干备用[23]。
1.2.2 苦荞麦粗蛋白质含量测定
苦荞麦粗蛋白质含量测定采用凯氏定氮法，参照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[24]。
1.2.3 蛋白提取率计算方法
蛋白质提取率/%=提取液中蛋白质质量/苦荞麦粉中粗蛋白质质量×100[25]
1.2.4 蛋白含量测定
采用考马斯亮蓝法G-250测定蛋白含量：以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）为标准品，分别吸取浓度为0.10 g/mL的标准蛋白溶液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL于试管中，用双蒸水补足溶液为1.00 mL。每管加入5.00 mL考马斯亮蓝G-250溶液反应5 min后，在595 nm条件下使用酶标仪测定蛋白吸光度，绘制牛血清白蛋白标准曲线[26]。建立回归方程：y=0.003 9x+0.006 2（R2=0.9973），其中 y 为吸光度，x为蛋白质质量浓度（mg/L），蛋白质标准曲线见图1。
图1 蛋白质标准曲线
Fig.1 Protein standard curve
1.2.5 苦荞麦清蛋白提取工艺
称取5.00 g处理过的苦荞麦粉，按一定的料液比将苦荞麦粉置于双蒸水中搅拌提取，在一定温度和搅拌速度下，搅拌浸提一定时间后，在8 000 r/min的转速下离心20 min，取上层清液测定蛋白含量。
1.2.6 苦荞麦清蛋白提取单因素试验
1.2.6.1 料液比对苦荞麦水溶性清蛋白提取率的单因素试验
取5.00 g苦荞麦粉，在搅拌45 min，35℃的条件下做料液比 1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL）的单因素试验，在转速为8 000 r/min，20 min的条件下离心取上清液测定蛋白含量。
1.2.6.2 时间对苦荞麦水溶性清蛋白提取率的单因素试验
取5.00 g苦荞麦粉，在料液比为1∶10（g/mL），35℃的条件下做搅拌时间为 30、45、60、75、90 min 的单因素试验，在转速为8 000 r/min，20 min的条件下离心取上清液测定蛋白含量。
1.2.6.3 温度对苦荞麦水溶性清蛋白提取率的单因素试验
取 5.00 g苦荞麦粉，在料液比为 1 ∶10（g/mL），搅拌浸提时间为45 min的条件下做温度为30、35、40、45、50℃的单因素试验，在转速为8 000 r/min，20 min的条件下离心取上清液测定蛋白含量。
1.2.7 提取苦荞麦清蛋白响应面试验
本试验选取料液比、搅拌时间、搅拌温度3个影响因素，以清蛋白提取率为响应值，优化提取清蛋白的最佳工艺参数。根据设计结果共17个组合试验，其中12个组合为分析试验，5个组合为中心试验[27]。设计三因素三水平的响应分析试验，每个试验组合重复测定2次，取其平均值作为结果，其因素水平编码表见表1。
表1 Box－Behnken试验设计因素水平表
Table 1 Factors and levels of Box－Behnken design
水平温度/℃-1 1∶15 45 30 0 1∶20 60 35 1 1∶25 75 40因素A料液比/（g/mL）B C时间/min
1.3 数据处理
采用 Origin 9.0软件进行作图和 Design-Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken设计及数据分析和方差分析。
2 结果与讨论
2.1 料液比对苦荞麦清蛋白提取率的影响
料液比对苦荞清蛋白提取率的影响见图2。
图2 料液比对苦荞清蛋白提取率的影响
Fig.2 The influence of solid－liquid ratio on the buckwheat albumin extraction yield
由图2可知在料液比为1∶5（g/mL）时，蛋白提取率最低，可能是溶剂太少且苦荞麦中含有较多的淀粉，溶剂可能被淀粉吸收，提取黏度大，没有足够的溶剂去溶解清蛋白，导致清蛋白溶出困难[28]。随着溶剂体积的增加，蛋白提取率与料液比呈正相关，当料液比为1∶20（g/mL）时，蛋白提取率达到最大值31.06%，溶剂体积的增加有助于清蛋白的溶出。随后蛋白提取率开始下降，可能是蛋白的溶出已达到饱和状态，苦荞麦清蛋白与水结合力降低，随着溶剂体积的增加清蛋白浓度反而减小，清蛋白提取率下降。有研究者[29]对苦荞麦麸皮的清蛋白进行提取，得出最佳工艺参数为：料液比 1∶12（g/mL），提取温度 35℃，提取时间60 min。因清蛋白提取的部位不同，所以最佳料液比有所差异。
2.2 时间对苦荞麦清蛋白提取率的影响
时间对苦荞清蛋白提取率的影响见图3。
图3 时间对苦荞清蛋白提取率的影响
Fig.3 The influence of time on the buckwheat albumin extraction yield
从图3可知当提取时间从30 min增加到60 min时，蛋白提取率与时间呈正相关，在提取时间为60 min时，清蛋白溶出达到饱和状态，蛋白提取率达到最大22.91%。随着提取时间的继续增加蛋白质可能发生分解和变性，或是其它成分与蛋白质发生了结合，导致蛋白含量下降[30]。杨海霞[31]在提取内蒙甜荞清蛋白时，提取时间为30 min时达到最佳，有研究者[18]在料液比为1∶10（g/mL），温度为40℃，提取时间为3 h的条件下甜荞清蛋白得率为（4.95±2.23）g/100 g，可能本试验用的是苦荞，因品种不同所以最佳提取时间有所差异。
2.3 温度对苦荞麦清蛋白提取率的影响
温度对苦荞清蛋白提取率的影响见图4。
从图4可以看出30℃～35℃之间随着温度增加蛋白提取率增加，可能是刚开始温度的增加有助于分子的扩散运动，从而利于蛋白质溶出[32]，蛋白提取率上升，35℃时达到最大值。35℃以后蛋白提取率与温度成负相关，温度越高蛋白提取率反而下降，可能是清蛋白是热不稳定、对温度较敏感的蛋白质[33]，过高的温度对维持蛋白质空间结构造成破坏，导致清蛋白溶出少，且过高的温度会影响蛋白质的营养价值，所以清蛋白提取温度为35℃。陈晓萌[30]在提取大红芸豆清蛋白时，研究发现在40℃时蛋白提取率最大，过高的温度则引起蛋白质变性，提取率反而降低。姚海霞[19]在提取竹豆清蛋白时，45℃时清蛋白提取率达到最大，在55℃时蛋白提取率显著下降，可能是蛋白已经发生变性。因选取的原料有差异，所以清蛋白的最佳提取温度有所差异。
图4 温度对苦荞清蛋白提取率的影响
Fig.4 The influence of temperature on the buckwheat albumin extraction yield
2.4 响应面试验设计及结果
根据提取苦荞麦清蛋白单因素试验结果，由Design-Expert 8.0.6软件设计出的试验方案及结果见表2。
表2 响应面试验设计及结果
Table 2 The response surface design of experimental results
试验号 A B C 蛋白提取率/%1 0 -1 -1 29.33 2 0 0 0 35.68 3-1 0 1 29.24 4 1 0 1 29.19 5-1 -1 0 28.87 6 0 0 0 35.18 7 1 1 0 27.11 8 0 0 0 37.27 9 0 0 0 36.00 10 -1 0 -1 30.62 11 0 -1 1 29.64 12 0 1 -1 28.22 13 1 -1 0 29.20 14 -1 1 0 30.88 15 0 1 1 29.34 16 1 0 -1 28.21 17 0 0 0 36.47
2.5 回归方程及方差分析
通过表2的试验数据，采用Design-Expert 8.0.6软件进行拟合，得如下回归方程：蛋白提取率=36.12-0.74A-0.19B+0.13C-1.03AB+0.59AC+0.20BC-3.46A2-3.64B2-3.34C2。
响应面数据的方差分析结果见表3，结果显示该模型p值小于0.000 1，表明回归模型极显著。失拟检验是一种用来判断回归模型是否可以接受的检验，本试验失拟误差p=0.765>0.05，表明该模型与试验拟合误差不显著，数据较准确，该模型可以使用。本试验决定系数R2=0.9822，表明有98.22%的数据可以用此方程解释；校正系数R2adj=0.987 2，表明该试验结果有98.72%受控制因素的影响，未控制因素对试验结果造成的影响很小[32]。变异系数C.V.%=2.20%，C.V.%值越小，试验越可靠，精确度越高，可对苦荞麦清蛋白的提取工艺做初步分析和预测，试验实际值与预测值几乎一致。由各因素的p值可知，对苦荞麦清蛋白提取率影响顺序依次为：料液比（A）>搅拌时间（B）>搅拌温度（C）；各因素之间交互作用对苦荞麦清蛋白提取率影响顺序依次为：料液比与时间（AB）>料液比与温度（AC）>时间与温度（BC）。
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：* 差异显著，p<0.05；** 差异极显著，p<0.01。
方差来源 平方和 自由度 方差 F值 p值 显著性回归模型 181.88 9 20.21 42.83 <0.0001 **A-料液比 4.33 1 4.33 9.18 0.0191 *B-时间 0.28 1 0.28 0.59 0.4681 C-温度 0.13 1 0.13 0.28 0.611 AB 4.21 1 4.21 8.93 0.0203 *AC 1.4 1 1.4 2.96 0.129 BC 0.16 1 0.16 0.35 0.5735 A2 50.49 1 50.49 107.01 <0.0001 **B2 55.85 1 55.85 118.36 <0.0001 **C2 47.01 1 47.01 99.63 <0.000 1 **残差 3.3 7 0.47失拟项 0.75 3 0.25 0.39 0.765 不显著纯误差 2.55 4 0.64合计 185.19 16
2.6 响应面结果分析
料液比与时间交互作用对苦荞清蛋白提取率的影响见图5。
图5 料液比与时间交互作用对苦荞清蛋白提取率的影响
Fig.5 Effect of material-liquid ratio interaction with time on the buckwheat albumin extraction rate
由图5的响应面图可知当料液比不变时，随着时间的增加，蛋白提取率呈现先上升后下降的趋势；当时间一定时，随着溶剂体积的增加，蛋白提取率呈现先上升后下降的趋势，在响应面的最顶处出现最大响应值。等高线图呈椭圆形，颜色逐渐加深，料液比和时间（AB）交互作用显著，在图5的等高线图中最小椭圆的中心点位置有响应面最大值。
料液比与温度交互作用对苦荞清蛋白提取率的影响见图6。
图6 料液比与温度交互作用对苦荞清蛋白提取率的影响
Fig.6 Effect of interaction between feed-liquid ratio and temperature on the buckwheat albumin extraction rate
由图6的响应面图可知当其中一个变量不变时，蛋白提取率均呈现先上升后下降的趋势，在响应面的最顶处出现最大响应值。在图6的等高线图中最小椭圆的中心点位置有响应面最大值，料液比与温度（AC）的交互作用次于（AB）。
时间与温度交互作用对苦荞清蛋白蛋白提取率的影响见图7。
图7 时间与温度交互作用对苦荞清蛋白蛋白提取率的影响
Fig.7 Effect of time and temperature interaction on the buckwheat albumin extraction rate
由图7的响应面图可知，当温度不变时，随着时间的增加，蛋白提取率先增加后减小；当时间不变时，随着温度的增加，蛋白提取率呈先上升后下降的趋势。在图7的等高线图中，等高线椭圆不明显，接近圆形，温度与时间两因素之间的交互作用对响应值的影响不显著，与方差分析结果一致。
2.7 验证试验
据所建立的数学模型进行参数最优分析，得到最佳预测工艺条件为：料液比1∶19.48（g/mL）、时间59.84 min、温度35.05℃，在此条件下得出的蛋白提取率为36.16%。考虑实际操作把条件更改为料液比1 ∶20（g/mL）、时间 60 min、温度 35℃，在此条件下，得出蛋白提取率为35.86%，与预测值36.16%接近，说明该模型能较好地预测实际蛋白提取率。
3 结论
本研究结果表明，在单因素试验基础上，采用三因素三水平的响应面分析方法，以料液比、搅拌时间、搅拌温度为试验因素，以清蛋白提取率为响应值。试验中苦荞麦水溶性清蛋白的最佳提取工艺条件为料液比 1 ∶20（g/mL），搅拌时间 60 min，搅拌温度 35 ℃，在此条件下蛋白提取率为35.86%。苦荞麦蛋白是调节人体生理功能的良好食品，食品界与医药界都有相关研究，且日益受到人们的关注。本研究结果为解决苦荞麦在食品和医药界的应用提供思路，为高效制备苦荞麦清蛋白提供一定的依据。
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