川明参又名沙参、明沙参、土明参，主产于四川、湖北等地，其根可入药，常作为滋补物品加入食物以提高营养价值[1-2]。川明参所含化学成分中以多糖含量较高，其含量在20%以上[3]。此外，研究表明，川明参多糖（Chuanmingshen violaceum polysaccharides，CVP） 具有抗氧化、抗病毒、增强免疫、润肺化痰及抗菌等生理活性[4-6]，具有广阔的市场应用前景，因此如何有效提高CVP提取率显得十分重要。
当前CVP的提取多采用热水浸提法或热回流法，此两种方法具有能耗高，耗时长，高温易影响多糖活性等不足[7]，实际操作中常采用其它辅助方法对CVP进行提取优化，但提取效果均不理想[8-10]。近年来酶解和超声波辅助提取法被广泛应用于植物活性成分的提取中，具有专一性强、简便快捷且不影响有效成分活性等优点 [11-13]，而将酶法和超声技术结合应用于CVP的提取尚未见报道。本试验采用超声辅助酶法提取川明参中的多糖成分，并利用响应面法优化多糖提取工艺，为CVP的开发应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
川明参、氢氧化钠、乙酸、无水乙醇、葡萄糖、浓硫酸、苯酚（分析纯）：重庆万州国药集团；纤维素酶（100 000 U/g）：和氏璧生物科技有限公司。
200Y不锈钢中药粉碎机：永康市铂欧五金制品有限公司；KQ-300B超声清洗仪：昆山市超声仪器有限公司；YY/T0657-200离心机：湖南平凡科技有限公司；UV2450紫外可见分光光度计、FT-IR-8400S傅立叶变换红外光谱仪：日本岛津有限公司；YRE2000A旋转蒸发仪：巩义市予华仪器有限责任公司；DZF-6050M电热恒温真空干燥箱：上海博讯实业有限公司；ALPHA1-2/LD-plus冷冻干燥机：德国CHRIST公司；ME204E分析天平：梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 CVP提取工艺
川明参→挑选去杂→干燥→粉碎→过筛→超声辅助酶法提取→过滤→滤液浓缩→醇沉→离心→洗涤沉淀→冷冻干燥→粗多糖
称取一定量川明参粉（质量记为M0）置于250 mL锥形瓶中，按料液比1∶20（g/mL）加入蒸馏水，同时加入一定量纤维素酶，调节混合液pH值，设定超声功率、温度和时间，提取、过滤，滤液浓缩至原体积约1/4，加入3倍体积的无水乙醇沉淀，静置过夜，离心，沉淀依次用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤，再次离心，沉淀经真空冷冻干燥即为川明参粗多糖（质量记为N）。
1.2.2 CVP提取率测定
以葡萄糖为参照绘制标准曲线，采用苯酚-硫酸法测定川明参粗多糖中的多糖含量M1，并按公式计算川明参多糖的提取率。
式中：N为川明参粗多糖的质量，g；M0为川明参粉末的质量，g；M1为川明参粗多糖中的多糖含量，%。
1.2.3 多糖提取单因素试验
在固定料液比 1∶20（g/mL），超声功率 300 W，提取温度60℃，提取时间30 min，pH4的条件下，考查纤维素酶用量分别为 0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g 时的CVP提取率。
在固定料液比 1∶20（g/mL），超声功率 300 W，提取温度60℃，提取时间30 min，纤维素酶用量0.20 g的条件下，考查pH值分别为2、3、4、5、6时的CVP提取率。
在固定料液比 1∶20（g/mL），超声功率 300 W，提取时间30 min，纤维素酶用量0.20 g，pH4的条件下，考查提取温度分别为 35、40、45、50、55 ℃时的 CVP 提取率。
在固定料液比 1∶20（g/mL），超声功率 300 W，提取温度60℃，纤维素酶用量0.20 g，pH4的条件下，考查提取时间分别为 10、20、30、40、50 min 下的 CVP 提取率。
根据各因素的最适取值确定后续响应面试验的水平范围。
1.2.4 多糖提取条件的优化
根据单因素试验，选取酶用量（A）、提取温度（B）、提取时间（C）、pH值（D）4个因素为自变量，以CVP提取率值为响应值（Y），利用Box-Behnken试验设计，确定四因素三水平共29个实验点，其中24个析因点，5个0点。各因素变化区间根据单因素试验确定，每个试验点做3个重复，取平均值。试验因素与水平见表1。
表1 试验因素与水平表
Table 1 The table of level for test factors
编码水平因素A纤维素酶用量/g B提取温度/℃C提取时间/min D pH值-1 0.20 45 30 3 0 0.25 50 40 4 1 0.30 55 50 5
1.2.5 CVP的红外光谱分析
取干燥的CVP样品1 mg～2 mg，与适量干燥KBr粉末混合，在玛瑙研钵中研磨均匀，经压片后，用傅里叶红外光光谱仪（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）在波数400 cm-1～4 000 cm-1范围扫描并记录光谱[14]。
1.2.6 CVP对DPPH·清除能力的测定
分别取不同质量浓度的样品溶液2 mL于试管中，分别加入8×10-4mol/L的DPPH溶液2 mL，摇匀，待暗处反应0.5 h后，于517 nm波长下测定吸光度A，按公式计算CVP对DPPH·的清除率[15-16]。
式中：A样品为加入CVP样品溶液的吸光度；ADPPH为不加入样品的溶液的吸光度。
1.3 数据处理
运用Microsoft Excel 2018计算平均值与标准差，Design-Expert 8.0.6软件进行响应面试验设计及方差分析，Origin 2018绘制图形。
2 结果与分析
2.1 标准曲线的绘制
苯酚-硫酸法中，葡萄糖标准曲线的回归方程为y＝16.51x-0.160 4，其 R2＝0.999 2，表明葡萄糖浓度与吸光度之间存在良好的线性关系。根据标准曲线方程计算川明参粗多糖中的多糖含量。
2.2 单因素试验
纤维素酶用量、提取温度、提取时间及pH值对川明参多糖提取率的影响如图1所示。
图1 各因素对CVP提取率的影响
Fig.1 Effect of various factors on the extraction rate of CVP
在试验取值范围内，纤维素酶用量（A）、提取温度（B）、提取时间（C）和 pH 值（D）均对 CVP提取率呈先增大后减小的趋势。纤维素酶具有破坏植物细胞壁、分解纤维素，从而加速植物细胞内容物溶出的作用[15]，用量太少不足以破坏川明参的细胞壁使多糖溶出，而多余的酶可能会导致CVP水解；温度的提高有利于多糖的溶出，但温度过高可能会导致酶的失活以及多糖活性的破坏；提取时间的适当延长有利于CVP的有效溶出；pH值可通过对酶活性中心上必需基团的解离水平调节影响酶分子对底物分子的结合和催化，只有在适宜pH值条件下，酶反应速度才能达到最大值。综合考虑，选取纤维素酶用量0.25 g、提取温度50℃、提取时间40 min和pH 4进行响应面优化试验。
2.3 响应面法优化CVP提取工艺
2.3.1 模型的建立与方差分析
根据单因素试验结果，采用Box-Behnken试验设计对CVP提取工艺进行优化，以CVP提取率为评定指标。试验设计方案及结果如表2所示。
表2 响应面试验设计与结果
Table 2 Experimental design and results of response surface
编码 A纤维素酶用量 时间 D pH值 CVP提取率/%1 -1 -1 0 0 47.32 2 1 -1 0 0 47.43 3 -1 1 0 0 48.67 4 1 1 0 0 49.28 5 0 0 -1 -1 47.46 6 0 0 1 -1 46.24 7 0 0 -1 1 47.03 8 0 0 1 1 47.99 9 -1 0 0 -1 47.25 10 1 0 0 -1 47.26 11 -1 0 0 1 47.59 B提取温度C提取
续表2 响应面试验设计与结果
Continue table 2 Experimental design and results of response surface
编码 A纤维素酶用量 时间 D pH值 CVP提取率/%12 1 0 0 1 47.86 13 0 -1 -1 0 47.08 14 0 1 -1 0 48.31 15 0 -1 1 0 48.03 16 0 1 1 0 49.64 17 -1 0 -1 0 48.23 18 1 0 -1 0 46.51 19 -1 0 1 0 48.08 20 1 0 1 0 48.37 21 0 -1 0 -1 47.25 22 0 1 0 -1 47.52 23 0 -1 0 1 48.04 24 0 1 0 1 48.96 25 0 0 0 0 49.28 26 0 0 0 0 49.74 27 0 0 0 0 49.16 28 0 0 0 0 48.97 29 0 0 0 0 48.82 B提取温度C提取
利用Design-Expert 8.0.6软件进行分析与拟合后得到各因素与川明参多糖提取率（Y）的回归方程为：Y=49.648-0.045A+0.612B+0.311C+0.374D+0.153AB+0.503AC+0.065AD+0.095BC+0.163BD+0.545CD-0.910A2-0.450B2-1.001C2-1.322D2。
采用Design-Expert 8.0.6对模型进行方差分析，结果如表3所示。
表3 回归方程的方差分析及显著性检验
Table 3 Analysis of variance and significance test of regression equation
注：*表示差异显著（P<0.05），**表示差异极显著（P<0.01）。
变异来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 20.799 14 1.486 6.865 2 0.000 5 **A 0.015 1 0.015 0.071 2 0.793 5 B 4.356 1 4.356 20.130 0 0.000 5 **C 1.159 1 1.159 5.357 8 0.036 3 *D 1.680 1 1.680 7.763 6 0.014 6 *AB 0.062 1 0.062 0.288 8 0.599 4 AC 1.010 1 1.010 4.667 5 0.048 6 *AD 0.017 1 0.017 0.078 1 0.784 0 BC 0.036 1 0.036 0.166 8 0.689 1 BD 0.106 1 0.106 0.488 1 0.496 2 CD 1.188 1 1.188 5.490 4 0.034 4 *A2 2.947 1 2.947 13.620 3 0.002 4 **B2 0.297 1 0.297 1.373 8 0.260 7 C2 3.988 1 3.988 18.428 2 0.000 7 **D2 7.836 1 7.836 36.209 3<0.000 1 **剩余项 3.030 14 0.216失拟项 2.533 10 0.253 2.039 6 0.256 7误差项 0.497 4 0.124总回归 23.828 28
模型的P＝0.000 5＜0.01，表明回归模型极显著，可信性高。失拟项P＝0.256 7＞0.05，表明方差失拟项不显著，非试验因素对试验结果影响不大。另外，所选模型的R2为0.908 1，表明该模型能解释90.81%的结果值的变化规律，基本可用于超声辅助酶法提取CVP的分析与预测。同时，一次项 B 和平方项A2、C2、D2对CVP 提取率具有极显著影响（P＜0.01）；一次项C、D和交互项AC、CD对CVP提取率具有显著影响（P＜0.05）。此外，由各因素的F值大小可知，各因素对CVP提取率影响的强弱程度依次为B>D>C>A。
以响应面分析的回归方程为基础，并利用Origin 2018绘制具有显著性差异（AC和CD）的两因素交互作用的响应面分析图，结果如图2所示。
图2 各因素交互作用的响应面与等高线图
Fig.2 Response surface and contour diagram of the interaction of various factors
由图2可知，纤维素酶用量与提取时间、提取时间与pH值之间交互作用显著。响应面的陡峭程度分析发现，提取温度对CVP提取率的影响最大，其次是提取pH值和提取时间，与方差分析结果一致。
2.3.2 最佳提取工艺确定
采用Design-Expert 8.0.6软件预测超声辅助酶法提取川明参多糖的最佳工艺参数。其结果为纤维素酶用量0.26 g，提取温度53.89℃，提取时间42.93 min，酶解pH值为4.20，此条件下CVP的提取率最高，预测值为49.98%。为方便试验，在纤维素酶用量为0.26 g，提取温度为54℃，提取时间为43 min和pH值为4.20的条件下进行验证试验。上述试验条件下得到的川明参多糖的提取率为（49.52±0.53）%，与理论预测值比较接近，说明用该模型可以较好地反映出CVP提取的条件。
2.4 CVP的FT-IR分析
采用傅里叶红外光谱仪对川明参多糖的红外光谱进行分析，其结果如图3所示。
图3 CVP的红外光谱图
Fig.3 Infrared spectroscopy of CVP
由图3可知，3 400 cm-1附近处的强吸收峰是-OH的伸缩振动，表明CVP中存在分子间和分子内氢键[17]。2 900 cm-1附近的吸收峰是糖类C-H伸缩振动的特征吸收峰[18]。1 640 cm-1附近处的强吸收峰可能是-CHO的-C＝O伸缩振动造成的，表明CVP中可能含有糖醛酸[19]；1 400 cm-1～1 200 cm-1区域内的一组吸收峰是C-H 的变角振动峰[20]；1 200 cm-1～1 000 cm-1区域内的3个吸收峰是由两种-C-O伸缩振动所引起的，其中一种是疏水性C-O-H引起，另一种是由吡喃糖环的-CO-C-所引起[21]；930 cm-1附近处的弱吸收峰可能是吡喃糖环的对称伸缩振动所引起的[22]。840 cm-1左右的吸收峰表明CVP含有α-糖苷键[23]；红外数据表明CVP的单糖残基为α-吡喃糖型。
2.5 CVP的抗氧化活性
粗CVP对DPPH·的清除作用见图4。
图4 粗CVP对DPPH·的清除作用
Fig.4 Scavenging effect of crude CVP on DPPH·
如图4所示。随着CVP质量浓度增大，其对DPPH·清除率也随之升高，表明在一定范围内，CVP的抗氧化活性与其含量呈剂量效应关系，此外，在一定范围内，CVP的DPPH自由基清除能力与VC比较接近，但其DPPH自由基清除能力还是低于VC。
3 结论
单因素试验确定了超声辅助酶法提取CVP工艺纤维素酶用量、提取温度、提取时间及pH值的最适范围，在此基础上，利用响应面法优化CVP的最佳工艺条件。结果表明，各因素对CVP提取率影响大小顺序为提取温度＞提取pH值＞提取时间＞纤维素酶用量，CVP的最佳提取条件纤维素酶用量为0.26 g，提取温度为54℃，提取时间为43 min和pH值为4.20，此条件下CVP的提取率为（49.52±0.53）%，与理论预测值比较接近，说明用该模型可以较好地优选出CVP提取的条件。CVP的红外光谱图显示有多个具有多糖特征的官能团存在，分析表明CVP中可能有吡喃糖残基的存在。通过CVP对DPPH·的清除能力测定，结果表明在设定的质量浓度范围内，CVP具有较明显的抗氧化活性。
[1]陈丹丹,彭成.川产道地药材川明参的研究进展[J].中国药业,2011,20(3):1-2
[2] 袁佳.川明参复合汁饮料加工工艺及稳定性研究[D].雅安:四川农业大学,2014
[3] 雷晓莉,宋芳芳,彭成,等.不同产地川明参药材中多糖含量测定[J].中药与临床,2011,2(1):49-54
[4] Li H F,Ding F,Xiao L Y,et al.Food-derived antioxidant polysaccharides and their pharmacological potential in neurodegenerative diseases[J].Nutrients,2017,9(7):778
[5] Zhao X H,Zhang Y T,Song X,et al.Effect of Chuanminshen violaceum polysaccharides and its sulfated derivatives on immunosuppression induced by cyclophosphamide in mice[J].International Journal of Clinical and Experimental Medicine,2015,8(1):558-568
[6] 董红敏.川明参醇提物与多糖的提取、分析及抗氧化活性研究[D].雅安:四川农业大学,2016
[7] Dong H M,Lin S,Zhang Q,et al.Effect of extraction methods on the properties and antioxidant activities of Chuanminshen violaceum polysaccharides[J].International Journal of Biological Macromolecules,2016,93:179-185
[8] 张梅,雨田,苏筱琳,等.川明参多糖理化性质和免疫活性研究[J].华西药学杂志,2007,22(4):396-398
[9] 董红敏,李素清,牛小勇,等.正交实验优化川明参多糖超声提取工艺[J].食品工业科技,2014,35（8）:306-309
[10]Qin Y J,Yuan Q X,Zhang Y X,et al.Enzyme-assisted extraction optimization,characterization and antioxidant activity of polysaccharides from sea cucumber Phyllophorus proteus[J].Molecules,2018,23(3):590
[11]李冬梅,杭方学,陆海勤,等.超声辅助提取枸杞多糖的研究进展[J].食品工业科技,2015,36(20):392-399
[12]Cui F J,Qian L S,Sun W J,et al.Ultrasound-assisted extraction of polysaccharides from Volvariella volvacea:process optimization and structural characterization[J].Molecules,2018,23(7):1706
[13]Zhang X N,Ban Q F,Wang X B,et al.Green and efficient PEG-based ultrasonic-assisted extraction of polysaccharides from tree peony pods and the evaluation of their antioxidant activity in vitro[J].BioMed Research International,2018,2018:1-7
[14]Guo D,Yu K,Sun X Y,et al.Structural characterization and repair mechanism of Gracilaria lemaneiformis sulfated polysaccharides of different molecular weights on damaged renal epithelial cells[J].Oxidative Medicine and Cellular Longevity,2018,2018:1-15
[15]陈立弟.铁皮石斛多糖的提取、抗氧化活性及其多糖/介孔二氧化硅纳米粒的制备研究[D].深圳:深圳大学,2017
[16]罗凯,黄秀芳,周毅峰,等.响应面试验优化复合酶法提取碎米荠多糖工艺及其抗氧化活性[J].食品科学,2017,38(4):237-242
[17]Ren Y,Bai Y P,Zhang Z D,et al.The preparation and structure analysis methods of natural polysaccharides of plants and fungi:a review of recent development[J].Molecules,2019,24(17):3122
[18]Tang H L,Chen C,Wang S K,et al.Biochemical analysis and hypoglycemic activity of a polysaccharide isolated from the fruit of Lycium barbarum L[J].International Journal of Biological Macromolecules,2015,77:235-242
[19]陈石良，马青，谷文英，等.灰树花胞外多糖的性质与结构[J].江南大学学报,2002,21(3):244-248
[20]刘艳芳，薛令坤，吴迪，等.刺芹侧耳下脚料多糖的纯化与结构解析[J].菌物学报,2017,36(4):473-481
[21]Liu W,Wang H Y,Pang X B,et al.Characterization and antioxidant activity of two low-molecular-weight polysaccharides purified from the fruiting bodies of Ganoderma lucidum[J].International Journal of Biological Macromolecules,2010,46(4):451-457
[22]胡海梅.桑椹多糖提取工艺优化、组分分析及降血糖活性鉴定[D].合肥:合肥工业大学,2009
[23]李舒婕,林海桢,施胜英,等.黄精多糖PSP-1-A的分离纯化及结构解析[J].河南中医,2015,35(6):1441-1445