菊粉，俗称菊糖，主要存在于植物中，如菊科、桔梗科、龙胆科、百合科、禾本科的菊芋、菊苣、大理菊、蓟、大蒜、芦笋块茎等[1]，共计36 000多种，分布范围较广，产量较高，该类植物成为中国境内菊粉的主要来源[2]。菊粉作为一种富含低聚果糖的水溶性膳食纤维，相关研究已经证实其具有多种多样的生理学功能[3]，例如降血脂[4]、降血糖[5]、促进矿物质吸收[6]、调节肠道微生物菌群[7]、抗抑郁[8]等。目前，菊粉多用来作为一种食品功能性基料，生产低聚果糖、果糖浆或结晶果糖等，并成功应用在保健食品、饮料、乳制品及医药化工领域，具有很好的开发前景[9]。
疲劳是一种主观不适应的感觉反馈，其最初的定义为细胞中毒造成的一定损伤，随后经过几次不同的概念推演，于1982年将疲劳定义为机体在其生理过程中不能维持其机能在特定水平上和（或）不能维持预定的运动强度的现象[10]。该现象对机体造成的危害相当严重，如若不及时消除或缓解该症状的出现，不但会影响工作事务的推进，严重者更会直接危害人类生命健康。肠道菌群与人类的健康息息相关[11]，肠道菌群失调会导致多种疾病，例如非酒精性脂肪肝炎[12]、炎症性肠病[13]、肥胖[14]、阿尔兹海默症[15]等。近年来有研究表明，疲劳综合征往往伴随着肠道菌群紊乱[16]。另外鼠模型的最新证据表明，运动期间的身体和情绪压力与胃肠道微生物群组成的变化之间存在高度相关性[17]。
对抗疲劳方向的物质的开发，目前主要有人参皂苷[18]、虾青素[19]、荔枝多糖[20]和铁皮石斛[21]等，它们都显示出了良好的抗疲劳作用活性，而且主要成分都含有多糖。菊粉也是一类多糖物质[22]，但是菊粉的研究目前基本集中在菊粉酶等相关领域，对菊粉抗疲劳特性研究很少。本文研究菊粉对小鼠抗疲劳作用及调节肠道菌群作用，为菊粉相关功能性食品应用与开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
含不同剂量菊粉的小鼠日粮型鼠粮：青海省轻工业研究所有限责任公司；SPF级昆明雌性小鼠[6周龄，体重（20±2）g，合格证号 SCXK（京）2016-0006]：北京维通利华实验动物技术有限公司。
磷酸肌酸激酶（creatine kinase，CK）试剂盒、血乳酸（blood lactic acid，BLA）试剂盒、血尿氮素（blood urea nitrogen，BUN）试剂盒：南京建成生物工程研究所有限公司；QIAamp DNA粪便迷你试剂盒：Qiagen公司。
1.2 仪器与设备
SYNERGY H1型多功能酶标仪：美国Biotek公司；MB100-4A型微板恒温振荡孵育器：杭州奥盛（All Sheng）仪器有限公司；D-3750型离心机：美国SIGMA公司；MS 3 B S25x型涡旋振荡器：德国IKA公司；ME204型电子天平：美国Mettler Toledo公司；PCR仪：美国Bio-Rad公司；DYCP-31BN型琼脂糖水平电泳仪：北京六一公司；Miseq测序平台：美国Illumina公司。
1.3 方法
1.3.1 动物分组及给药剂量
将120只健康雌性昆明小鼠随机分为空白对照组（普通日粮型鼠粮）、低剂量组（含5%菊粉日粮型鼠粮）、中剂量组（含10%菊粉日粮型鼠粮）、高剂量组（含20%菊粉日粮型鼠粮），共4个处理组，每组30只。饲养温度为（25±2）℃，湿度50%～60%。连续喂养120 d，饲养期间小鼠自由摄食和饮水。
1.3.2 力竭游泳实验
小鼠喂养至第120天，小鼠称量体重，之后每组随机取10只，末次解药0.5 h之后，按孙靖辉等[23]所述方法，将小鼠放入水深30 cm，水温保持（25±0.5）℃的游泳箱（65 cm×45 cm×40 cm）中游泳，并在每只小鼠尾部附着质量为其体重5%的铅皮，从小鼠入水开始计时，直至小鼠体力耗尽及小鼠头部入水10 s内不能浮出水面。记录每组小鼠力竭游泳的时间。
1.3.3 血清中BUN含量及CK活力测试
小鼠喂养至第120天，小鼠称量体重，之后每组随机取10只，末次解药0.5 h之后，按照赵小宁[24]所采用的方法，将小鼠放在温度为30℃的水中游泳90 min，并捞出进行摘眼球取血处理，将血液收集于2 mL离心管中，室温（25℃左右）静置2 h，3 500 r/min离心10 min，收集上清液，放于-20℃下储存备用。CK活力和BUN含量测试按试剂盒说明进行，结果用SYNERGY H1型多功能酶标仪分别在660 nm与640 nm下测试。
1.3.4 BLA含量测定
小鼠喂养至第120天，小鼠称量体重，之后每组随机取10只，末次解药0.5 h之后，按照刘秀英等[25]所述的方法，将小鼠置于温度为（30±1）℃的游泳箱中游泳60 min后停止，待小鼠恢复15 min后摘眼球采血，收集血液于2mL离心管中，取50μL全血并加入300 μL蛋白沉淀剂（取自BLA试剂盒），混匀后以3 500 r/min速度离心10 min，取上清液，-20℃储存备用，用于BLA含量测定。BLA含量测定按试剂盒说明进行，结果用SYNERGY H1型多功能酶标仪分别在530 nm下进行测试。
1.3.5 肠道菌群分析
1.3.5.1 粪便标本收集
第120天收集一次粪便标本至1.5 mL无菌2 mL离心管中，每份约200 mg，随后立即液氮速冻并置于-80℃冰箱中保存备用。
1.3.5.2 样品处理及测序
采用试剂盒QIAamp DNA粪便迷你试剂盒提取小鼠粪便标本中的基因组DNA，对16S rRNA的V3-V4区域进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增并纯化，建库完成后使用Agilent 2100 Bioanalyzer对文库的片段范围及浓度进行检测。检测合格的文库根据插入片段大小，选择HiSeq平台进行测序。
1.3.5.3 生物信息学分析
测序所获得数据经过滤，通过reads之间的overlap关系将reads拼接成Tags；将Tags聚类成操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）并与数据库比对、物种注释；基于OTU和注释结果进行样品物种复杂度分析，组间物种差异分析。
1.4 数据分析
数据以平均值（
）+标准差（SD）表示，利用 DPS数据处理软件采用T检验和Duncan′s新复极差法对数据进行处理分析，采用Graphpad 8软件进行作图，p＜0.05表明具有显著性差异。
2 结果与分析
2.1 不同剂量菊粉对小鼠负重游泳能力的影响
菊粉剂量对小鼠负重游泳时间的影响见图1。
图1 菊粉剂量对小鼠负重游泳时间的影响
Fig.1 Effect of inulin dose on weight-bearing swimming time
不同字母表示p＜0.05，差异显著。
小鼠游泳时间长短代表着机体抗疲劳能力的强弱[26]。由图1可知，添加不同剂量菊粉喂养小鼠120 d后，服用菊粉组小鼠均显著高于空白对照组，说明添加菊粉喂养小鼠可以显著延长小鼠的游泳时间，提升机体的抗疲劳能力。其中，中剂量组较低剂量组提升0.9倍，增强幅度大于高剂量组与中剂量组的差异，表明随着剂量的增加，小鼠的游泳时间增长速率减缓。
2.2 不同剂量菊粉对CK的影响
菊粉剂量对CK活性的影响见图2。
图2 菊粉剂量对肌酸激酶活性的影响
Fig.2 Effect of inulin dose on serum creatine kinase activity
不同字母表示p<0.05，差异显著。
CK作为机体磷酸原供能系统代谢的关键酶之一，不论低或者高强度的运动都会造成其含量的增高，因此血清中CK活性是评定机体训练负荷的代表性指标[27]。由图2可知，不同处理组小鼠经过相同的运动负荷后，CK活性由大到小依次为空白对照组>低剂量组>中剂量组>高剂量组；并且空白对照组与其他处理组均成显著性差异（p<0.05），处理组整体呈现出明显的抑制效果，说明菊粉对小鼠运动后的CK活性的升高具有显著的抑制作用。3个剂量组之间随着剂量的升高，CK活性逐渐下降，且中剂量组与低、高剂量组没有明显差异（p>0.05）。
2.3 不同剂量菊粉对小鼠BLA含量的影响
菊粉剂量对小鼠血乳酸含量的影响见图3。
图3 菊粉剂量对小鼠血乳酸含量的影响
Fig.3 Effect of inulin dose on blood lactic acid content in blood
不同字母表示p<0.05，差异显著。
BLA是糖代谢的中间产物，其浓度的高低间接反映着组织供氧、供血情况和糖代谢等指标。在动物正常的生理过程中，丙酮酸通过乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）作用不断地产生BLA，直至BLA产生速率大于其去除速率，浓度得以增加。由图3可知，小鼠剧烈游泳后，BLA的浓度随着菊粉剂量的增大而降低，说明菊粉对小鼠运动后的BLA浓度的上升具有抑制作用；并且中、高剂量均对其抑制作用达显著性水平（p<0.05），而低剂量处理组效果不显著（p>0.05），表明BLA浓度对菊粉剂量呈现一定的剂量依赖性（p<0.05）。
2.4 不同剂量菊粉对小鼠血浆中BUN含量的影响
菊粉剂量对小鼠运动后BUN的影响见图4。
图4 菊粉剂量对小鼠运动后BUN的影响
Fig.4 Effect of inulin dose on BUN after exercise
不同字母表示p<0.05，差异显著。
正常情况下，BUN在机体始终保持着动态平衡的状态，当机体进行激烈的运动时会增加体内蛋白质的分解程度，导致血中BUN含量会升高，因此机体内BUN含量是衡量机体运动负荷的主要指标[28-29]。由图4可知，空白组、低剂量组、中剂量组和高剂量组的BUN含量分别为 15.10、14.11、13.51、11.97 mmol/L。其中，中、高剂量组与空白对照组相比分别下降10%（p<0.05）和21%（p<0.05）水平，说明中高剂量菊粉可以显著抑制剧烈运动导致的BUN含量升高。
2.5 不同剂量菊粉对小鼠肠道菌群的影响
菊粉剂量对小鼠肠道菌群相对丰度的影响见图5。
图5 菊粉剂量对小鼠肠道菌群相对丰度的影响
Fig.5 Effect of inulin dose on relative abundance of intestinal flora in mice
菊粉在调节肠道菌群、改善肠道功能方面有重要作用[30]。不过，不同国家对菊粉的摄入量标准并不统一，并且最新的研究报道指出，高剂量菊粉的摄入可能会引发因菌群失调导致的肝病风险[31-32]，因此菊粉的摄入量需要严格的规范标准[33]。由图5可知，随着菊粉摄入剂量的加大，拟杆菌科、双歧杆菌科在菌群中的比例显著升高，而乳酸菌含量有所降低。此外，其中值得注意的是高剂量菊粉饲养下的小鼠肠道内拟杆菌科、肠杆菌科出现大量增殖，导致对个体潜在危害的发生，而中剂量下肠道菌群保持着对个体最佳的物种多样性。
3 结论
本研究通过负重游泳实验、剧烈运动后疲劳相关生化指标测试以及肠道菌群丰度测试研究了菊粉的抗疲劳作用及调节肠道菌群作用。得出结论如下：菊粉能够使小鼠增强耐力，降低疲劳相关生化指标CK活性、BUN和BLA含量。同时，菊粉也表现出了可以调节肠道菌群丰度的活性，但是高剂量菊粉进食会导致菌群失调及有害菌的增长。综上所述，菊粉可能具有抗疲劳和调节肠道菌群丰度的作用且服用剂量不宜太高。
[1] 何新华.菊芋菊粉分离纯化过程和果糖生产的工艺研究 [D].南京:南京农业大学,2009
[2]MENSINK M A,FRIJLINK H W,van der VOORT MAARSCHALK K,et al.Inulin,a flexible oligosaccharide.II:Review of its pharmaceutical applications[J].Carbohydrate Polymers,2015,134:418-428
[3]KIETSIRIROJE N,KWANKAEW J,KITPAKORNSANTI S,et al.Effect of phytosterols and inulin-enriched soymilk on LDL-cholesterol in Thai subjects:a double-blinded randomized controlled trial[J].Lipids in Health and Disease,2015,14(1):146-158
[4] NING C,WANG X,GAO S,et al.Chicory inulin ameliorates type 2 diabetes mellitus and suppresses JNK and MAPK pathways in vivo and in vitro[J].Molecular Nutrition&Food Research,2017,61(8):e1600673
[5]COUDRAY C,FEILLET C C E,MAZUR A,et al.Dietary inulin intake and age can affect intestinal absorption of zinc and copper in rats[J].Journal of Nutrition,2006,136(1):117-122
[6]REIMER R A,WILLIS H J,TUNNICLIFFE J M,et al.Inulin-type fructans and whey protein both modulate appetite but only fructans alter gut microbiota in adults with overweight/obesity:A randomized controlled trial[J].Molecular Nutrition&Food Research,2017,61(11):1700484-1700487
[7]KALANTARI H,ASADMASJEDI N,ABYAZ M R,et al.Protective effect of inulin on methotrexate-induced liver toxicity in mice[J].Biomedicine&Pharmacotherapy,2019,110:943-950
[8]GUESS N D,DORNHORST A,OLIVER N,et al.a Randomized controlled trial:the effect of inulin on weight management and ectopic fat in subjects with prediabetes[J].Nutrition&metabolism,2015,12(1):36-45
[9]饶志娟,郑建仙,贾呈祥.功能性食品基料——菊粉的研究进展[J].中国甜菜糖业,2002(4):26-30
[10]陈慧,马璇,曹丽行,等.抗运动疲劳机制及食源性活性成分研究进展[J].食品科学，2020,41(11):247-258
[11]SHEN T D.Diet and gut microbiota in health and disease[J].Nestle Nutr Inst Workshop Ser,2017,88:117-126
[12]de FARIA GHETTI F,OLIVEIRA D G,de OLIVEIRA J M,et al.Influence of gut microbiota on the development and progression of nonalcoholic steatohepatitis[J].European Journal of Nutrition,2018,57(3):861-876
[13]赵圆圆,朱云,高树娟,等.胆汁酸与肠道微生物相互影响及其在疾病中的作用[J].医学综述,2020(14):2743-2747
[14]熊家瑶,李志勇.高脂饮食下肠道菌群导致肥胖的机制及其干预的研究进展[J].医学综述,2020,26(14):2738-2742
[15]JIANG C,LI G,HUANG P,et al.The gut microbiota and Alzheimer′s disease[J].Journal of Alzheimer's Disease,2017,58(1):1-15
[16]李超然,刘德柱,杨燕,等.针灸对慢性疲劳综合征及肠道菌群的作用研究[J].针灸临床杂志,2018,34(7):89-92
[17]CLARK A,MACH N.Exercise-induced stress behavior,gut-microbiota-brain axis and diet:a systematic review for athletes[J].Journal of the International Society of Sports Nutrition,2016,13(1):43-63
[18]王学芳,任红贤,封颖璐.人参皂苷单体的抗疲劳作用研究进展[J].解放军医药杂志,2019,31(12):114-116
[19]王茵,刘淑集,苏永昌,等.天然虾青素的抗疲劳及抗氧化作用研究[J].西南大学学报(自然科学版),2015,37(9):42-48
[20]宋伟峰,苏俊芳,罗淑媛.荔枝多糖抗疲劳作用的实验研究[J].中药材,2012,35(9):1485-1487
[21]谢唐贵,陈敬民,蓝保强,等.铁皮石斛抗疲劳作用的谱效关系研究[J].广西科学,2019,26(5):569-576
[22]赵孟良,任延靖.菊粉及其调节宿主肠道菌群机制的研究进展[J].食品与发酵工业,2020,46(7):271-276
[23]孙靖辉,李薇,李正祎,等.复方五味子口服液的制备及抗疲劳功能评价[J].吉林医药学院学报,2020,41(4):247-250
[24]赵小宁.牛大力抗疲劳药效筛选及其作用机理研究[D].广州:广州中医药大学,2015
[25]刘秀英,胡怡秀,臧雪冰,等.以山茱萸为主要成分的某口服液对小鼠免疫功能和运动耐力的影响[J].实用预防医学,2000(6):424-426
[26]BO B.Research on the influence of anti-fatigue effect and movement ability of blueberry polysaccharides on aged mice[J].Open Biomed Eng J,2015,9:314-317
[27]袁青.血清肌酸激酶的运动训练负荷监控作用研究述评[J].体育学刊,2007(6):40-43
[28]徐起麟.血尿素氮在运动训练监控中的作用简述[J].当代体育科技,2014,4(14):9-10
[29]YANG Y.Application of serum CK and BUN determination in monitoring pre-competition training of badminton athletes[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2007,27(1):114-116
[30]张泽生,刘亚萍,李雨蒙,等.菊粉的研究与开发[J].中国食品添加剂,2017(10):183-188
[31]SINGH V,YEOH B S,CHASSAING B,et al.Dysregulated Microbial Fermentation of Soluble Fiber Induces Cholestatic Liver Cancer[J].Cell,2018,175(3):679-694
[32]JIA B,WANG R,ZHANG J,et al.Commentary:Dysregulated microbial fermentation of soluble fiber induces cholestatic liver cancer[J].Front Cell Infect Microbiol,2019,9:155-156
[33]RIQUELME E,ZHANG Y,ZHANG L,et al.Tumor Microbiome Diversity and Composition Influence Pancreatic Cancer Outcomes[J].Cell,2019,178(4):795-806