皮肤作为人体的第一道屏障，也是人体衰老的最直观表现之一，其老化是一种多因素的变化过程。基因组及激素等内在因素和紫外线、污染等外在因素均会使皮肤组织和相关附属器官发生生理或病理性的老化损伤。此外，组织及细胞内部的氧化和糖化反应也会对细胞及组织造成不同程度的损伤[1]。多余的糖分在体内积累会形成黄棕色、荧光性、不可逆的糖基化终产物（advanced glycation end products，AGEs），而AGEs的过量积累则对真皮层的胞外基质胶原蛋白造成损伤，破坏皮肤结构及弹性[2]。随着年龄增长及自然老化的发生，单位皮肤面积的胶原蛋白含量每年约流失1%，体内的AGEs亦逐年提升1.2%[3]。除生理性因素外，外界刺激因素导致的氧化应激也会通过生成大量的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）与糖化反应产生互作。细胞在正常生理代谢下，可通过自身的抗氧化系统清除过量的ROS以防止氧化损伤的发生，但当ROS的积累超过系统承受限度时，就会诱发氧化应激[4]，使细胞中的脂质、蛋白质和DNA受到不同程度的损伤。体内AGEs过量累积也可诱导ROS产生并消耗超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、维生素C等抗氧化成分，进而影响糖化抑制系统Glo I的能力，促进糖化过程的发生[5]。AGEs的形成导致皮肤细胞弹性降低，同时细胞对外界刺激的反应更强烈，从而产生更多的活性氧自由基。因此，体内糖基化常伴随着氧化应激反应。除皮肤老化外，过量的AGEs也会导致骨质疏松、阿尔兹海默症及动脉硬化等一系列问题[6]。
红藜（Chenopodium formosanum）为苋科藜亚科藜属植物，被誉为“谷物中的红宝石”，富含多酚与黄酮类[7-8]，甜菜红素、甜菜黄素等抗氧化成分，也富含多种必需氨基酸和营养元素，可用作天然的着色剂和抗氧化剂。红藜提取物中主要包含芦丁、山奈酚、甜菜碱等20多种化合物，使其具有抗氧化、促进胶原蛋白生成、减少细胞凋亡、抗炎、抑制黑素瘤细胞生长[9]和保护及修复受损肝脏的作用[10]。荞麦（Fagopyrum esculentum Moench.）为蓼科荞麦属植物，又名三角麦、乌麦[11]，起源于中国西汉，是一种历史悠久的药食同源植物，在《本草纲目》、《齐民要术》等医书古籍上均有记载，具有很高的医用、营养及经济价值[12-13]。荞麦富含蛋白质、脂肪、纤维素等物质，维生素B2的含量可达其他粮食4倍～24倍，且含有其他禾谷类粮食所没有的叶绿素、芦丁[14-15]。因此，荞麦具有增进细胞生长、抗氧化、防止血细胞的凝集、使毛细血管的通透性及脆性下降、降血压、降血脂、改善人体免疫能力、抗癌、抗肿瘤、预防老年痴呆、抗糖化等作用[16-17]。因此，红藜和荞麦均因其所具有的良好抗氧化及抑制炎性反应而被应用于保健食品中。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料与试剂
红藜提取物、荞麦种皮提取物：大江生医股份有限公司；红藜果味饮料：美乐家（中国）日用品有限公司。
人皮肤成纤维细胞（HFF-1）：中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；高糖培养基（DMEM）：美国GIBCO公司；ROS试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司；人晚期糖基化终末产物、糖基化牛血清白蛋白（AGE-BSA）、胶原蛋白Ⅲ试剂盒：武汉华美生物工程有限公司。
受试者依据测试要求选取，临床表现为皮肤干燥、粗糙、肌肤暗黄者，近2年内未做过激光美容或化学焕肤，对护肤类化妆品无既往过敏史，无伦理学禁忌，测试期间受试者不得使用与产品功能相似的化妆品，性别随机，年龄35岁～55岁。自愿签署知情同意书，并要求在测试周期内，避免长时间日晒、户外运动、游泳、旅游等活动。
1.1.2 试验仪器
Infinite M200 Pro多功能酶标仪：瑞士TECAN公司；DIRECT HEAT CO2Incubator恒温培养箱：赛默飞世尔科技公司；实时细胞分析系统（real-time cell assay，RTCA）：美国艾森生物科学公司；Corneometer CM 825皮肤水分含量测试仪、GL 200&MPA 10皮肤光泽度测试仪、CL 400&MPA 10皮肤色差测试探头及多探头皮肤测试系统：德国C&K；面部图像分析系统VISIA-CR：美国Canfield；皮肤快速光学成像系统Derma TOP：法国 EO-TECH。
1.2 HFF-1细胞活性氧含量检测
在每个样品组加入适当的DCFH-DA的无血清培养基，放置培养箱避光孵育30 min，使之与HFF-1充分接触，30 min后用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）清洗探针，加入适量培养基进行吸光值检测，检测条件为：激发波长488 nm，发射波长525nm。计算方式：ROS含量/%＝样品组/阴性组×100。并用荧光显微镜对处理后细胞状态进行拍照，用以分析。
1.3 HFF-1细胞抗糖化评价
用含10%小牛血清、1%双抗的DMEM培养基将HFF-1细胞培养于培养瓶中，常规置于37℃、5% CO2培养箱中培养。随机分为阴性对照组（空白）、阳性对照组（100 μg/mL VC）、样品组（不同浓度样品干预）、AGEs组（5mg/mL）、BSA 组（AGEs的对照组，5mg/mL）。AGEs和AGEs-BSA溶液损伤HFF-1细胞24 h，利用安全浓度下测试样品进行修复；根据实时细胞分析系统（real-time cell assay，RTCA）自动生成的细胞生长曲线计算存活率。同时利用通过上述方法造模72 h后的细胞上清液，按照胶原蛋白Ⅲ试剂盒说明书测定胶原蛋白Ⅲ含量，用于后续的分析。
1.4 临床功效评价
受试者完成皮肤本底值采集和问卷填写后，采集使用前的本地数据并领取测试产品，采用饮用样品前后自身对照的临床试验，使用频率为每日一瓶。随后采取使用4周、6周后的面部皮肤数据，且测试期间不得使用与测试产品功能相类似的化妆品。分别对受试者使用前后的眼角皱纹深度、皮肤水分含量、皮肤光泽度、皮肤颜色L*值及b*值进行测量评价并采集正面面部图像，使用SPSS软件对数据进行正态分布计算，使用t检验的方法分析测试产品使用前后皮肤数据的变化，如果数据呈非正态分布，使用秩和检验进行相应统计分析。根据上述统计分析结果做出测试产品是否有效的结论，双侧检验，检验水准α=0.05。
变化率即相对使用前的变化率，计算公式如下：
式中：T0为受试区使用化妆品前皮肤本底值；Tn为受试区使用化妆品后皮肤数值；n为回访时间。
2 结果与分析
2.1 红藜-荞麦提取物修复HFF-1糖化损伤
在体外培养的HFF-1细胞中，加入不同浓度的红藜-荞麦提取物，实时观察48 h后的细胞生长曲线见图1，选取细胞生长数量大于90%时的处理浓度3.125%作为安全浓度用于后续测试。
图1 不同浓度红藜-荞麦提取物作用HFF-1细胞48 h生长曲线
Fig.1 Growth curve of different concentrations of Chenopodium formosanum-Fagopyrum esculentum Moench.extracts acting on HFF-1 cells for 48 h
2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）作为一种氧化应激指示剂，能自由透过细胞膜，本身无荧光，但进入细胞后被细胞酯酶水解生成DCFH，之后与细胞内ROS快速氧化生成强荧光产物（dichlorofluorescein，DCF）。不同浓度红藜-荞麦提取物对活性氧（ROS）的清除能力见图2。
图2 不同浓度红藜-荞麦提取物对HFF-1细胞活性氧清除作用
Fig.2 Scavenging effects of different concentrations of Chenopodium formosanum-Fagopyrum esculentum Moench.extracts on reactive oxygen species（ROS）in HFF-1 cells
A为1.56%红藜-荞麦提取物混合液对ROS清除效果（荧光显微镜40×）；B为阴性对照处理组（荧光显微镜40×）；C为不同浓度红藜-荞麦提取物混合液的ROS清除率。
由图2所知，与阴性对照组相比，1.56%红藜-荞麦提取物反应后荧光面积较小。同时，不同浓度的红藜-荞麦提取物对ROS抑制率均高于阳性对照组（VC溶液，100 μg/mL）。提取物混合液浓度为1.56%时清除率最佳，达60.5%）。结合数据分析证明，红藜-荞麦提取物在体外培养的HFF-1细胞模型中具有高效清除活性氧自由基的能力。
AGEs产物在体内过量累积会导致组织内胶原蛋白变性脆弱，也会使胶原蛋白Ⅲ等成分含量发生变化。因此，本试验使用外源AGEs产物在体外培养HFF-1细胞上建立糖化损伤模型。红藜-荞麦提取物修复AGEs损伤模型下细胞实时生长曲线见图3，不同浓度红藜-荞麦提取物在修复AGEs损伤下的胶原蛋白Ⅲ含量差异对比见图4。
由图4可知，外源AGEs的加入可降低细胞中胶原蛋白Ⅲ的含量。与阴性对照组相比，当混合物浓度大于1.56%时，可修复因AGEs损伤造成的胶原蛋白Ⅲ含量减少，且随样品浓度增加，对胶原蛋白损伤的修复能力增强。
2.2 受试者使用评价
2.2.1 皮肤水分含量及皱纹深度变化
图3 红藜-荞麦提取物修复HFF-1细胞AGEs损伤模型下细胞实时生长曲线
Fig.3 Real-time growth curve of repairing HFF-1 cells under AGEs injury model by mixture of Chenopodium formosanum-Fagopyrum esculentum Moench.extracts
图4 不同浓度红藜-荞麦提取物在修复HFF-1细胞AGEs损伤模型中胶原蛋白Ⅲ含量差异
Fig.4 Collagen III content in different concentrations of Chenopodium formosanum-Fagopyrum esculentum Moench.extracts mixture in repairing HFF-1 cells under AGEs injury model
受到糖化产物和氧化自由基等应激等损伤后，皮肤组织中胶原和弹性蛋白纤维脆弱变性，导致皮肤组织的松弛度增加，出现皱纹等衰老指征，同时皮肤表层水分含量的变化也与其密切相关[18]。本试验选取30名符合要求的受试者，使用以红藜-荞麦提取物为主要原料的抗糖化饮品6周，并追踪测试周期内的皮肤水分、皱纹、光泽度等指标，以观察皮肤状态改善情况。使用饮品前后受试者皮肤中水分含量值的变化由皮肤水分含量变化率表示。当水分含量发生变化时，皮肤的电容值亦发生变化，此值越高，说明产品补水保湿效果越明显。受试者使用饮品前、连续使用4周、6周后，经Corneometer CM 825仪器检测皮肤水分含量、Derma TOP仪器检测眼角皱纹深度，皮肤变化对比见表1。
表1 皮肤水分含量及眼角皱纹深度使用前后对比
Table 1 Skin moisture content and eye wrinkle depth before and after application
使用时间 皮肤水分含量/% 眼角皱纹深度/mm使用前 48.69±2.80 0.025 5±0.001 2连用4周后 51.05±2.52 0.025 0±0.001 4连用6周后 52.28±2.55 0.025 0±0.001 3
如表1所示，相同测试区域内皮肤水分含量随饮品饮用时间逐渐升高，在饮用饮品6周后高于饮用前，且存在显著性差异（p<0.01）。
受试者使用红藜-荞麦提取物饮品前后，测试部位皮肤水分及眼角皱纹变化见图5。
图5 受试者使用红藜-乔麦提取物饮品前后面部皮肤水分及眼角皱纹变化
Fig.5 Changes in facial skin moisture and wrinkles a round the eyes before and after the subjects used sorghum Chenopodium formosanum- Fagopyrum esculentum Moench. extracts
A为测试区域皮肤水分含量使用前后对比（相对使用前显著性分析，**分别代表p＜0.01）；B为测试区域皮肤水分含量变化率；C为眼角皱纹深度使用前后对比；D为眼角皱纹深度变化率；E为VISIA-CR淡化细纹有效例（受试者编号：012，Standard 2光源模式）；F为Derma TOP淡化眼角细纹有效例（受试者编号：019，彩色图、棕色图、倒模图模式）。
由图5 A、图5B所知，皮肤水分含量的变化率在第4周和第6周时均为正值，且随产品饮用时间增加而升高，连续饮用测试饮品6周后，受试者脸部皮肤水分含量提升了7.37%，提升显著（p＜0.01），测试产品具有提升皮肤水分含量的效果。同时，利用皮肤快速成像分析系统Derma TOP采用条纹投影测量技术对区域眼角皱纹深度进行测试。皱纹深度（绝对值）随时间增加呈降低趋势，在使用产品4周、6周后低于使用前，且眼角皱纹深度（绝对值）的变化率在第4周和第6周时均为负值，且在第6周达到-1.96%。由表1及图5 C、5F可知，连续使用测试产品6周后，受试者眼角皱纹深度改善了1.96%（绝对值），表明该饮品具有淡化眼角皮肤细纹的效果。
2.2.2 皮肤色度及光泽度变化
人的肤色主要由褐色的黑色素、红色氧合血红蛋白、蓝色的还原血红蛋白及黄色的胡萝卜素与胆色素构成，同时也受到皮肤粗糙度、水合程度等因素的综合影响。目前常用分析皮肤色度的CIE-LAB系统中，明度L*代表灰阶，主要受黑色素含量影响，其值与皮肤“亮白”呈正相关；色度b*值反映皮肤的黄色程度，也与皮肤黑素含量和“暗黄”程度呈正相关。使用红藜-荞麦提取物饮品前后，测试区域皮肤颜色明度L*值、色度b*值变化对比见表2及图6。
表2 使用红藜-荞麦提取物饮品前后皮肤颜色L*值、b*值对比
Table 2 Comparison of skin color L*values and b*value before and after using Chenopodium formosanum-Fagopyrum esculentum Moench.extracts
使用时间 L*值 b*值使用前 60.78±0.56 14.31±0.42连用4周后 61.27±0.54 13.08±0.18连用6周后 61.33±0.56 13.01±0.19
图6 受试者使用红藜-荞麦提取物饮品前后面部皮肤L*及b*变化
Fig.6 Changes in facial skin color L*values and b*value before and after the subjects used Chenopodium formosanum-Fagopyrum esculentum Moench.extracts
A为使用第0周、4周、6周测试区域皮肤L*值对比；B为使用第4周、6周测试区域皮肤L*变化率；C为使用第0周、4周、6周测试区域皮肤b*值对比（相对使用前显著性分析，**代表p<0.01）；D为使用第4周、6周测试区域皮肤b*变化率；E为改善肤色有效例（受试者编号：012，VISIA-CR Standard 2光源模式）。
由表2及图6 A～B可知，受试者使用产品后，测试区域皮肤颜色L*值随使用时间逐渐升高，尤其在使用饮品4周、6周后高于使用前；皮肤颜色L*值的变化率在第4周和第6周时均为正值，且随饮品使用时间增加而升高，第6周达到0.90%。说明，连续使用测试饮品6周后，受试者脸部皮肤颜色L*值提升了0.90%，测试产品具有提升皮肤亮度（白度）的效果。同时，由表2及图6 C、图6 D可知，测试区域皮肤颜色b*值随产品使用时间逐渐降低，在使用饮品4周、6周后低于使用前，且存在显著性差异（p<0.01）；皮肤颜色b*值的变化率在第4周和第6周时均为负值，且随饮品使用时间增加而降低，第6周达到-9.08%；说明，连续使用测试饮品6周后，受试者脸部皮肤颜色b*值改善了9.08%（绝对值），改善显著（p<0.01），测试饮品具有改善皮肤暗黄的效果。受试者使用红藜-荞麦提取物饮品前后，第0、4、6周测试区域皮肤光泽度变化对比见图7。
图7 受试者使用红藜-荞麦提取物饮品前后面部皮肤光泽度变化
Fig.7 Changes in facial skin gloss before and after the subjects used Chenopodium formosanum-Fagopyrum esculentum Moench.extracts
A为使用第0周、4周、6周测试区域皮肤光泽度对比；B为使用第0周、4周、6周测试区域皮肤光泽度变化率；C为皮肤光泽度有效例（受试者编号：012，VISIA-CR Standard 2光源模式）。
皮肤的光泽度在一定程度上可以侧面反映皮肤的健康状态。通过对受试者使用饮品前后的皮肤光泽度数值进行追踪，发现受试者饮用饮品后，测试区域皮肤光泽度呈升高趋势。由图7可知，连续使用测试产品6周后，受试者脸部皮肤光泽度提升了3.05%，证明测试饮品具有提升皮肤光泽度的效果。
3 讨论与结论
压力、紫外线、环境污染及不健康的生活方式等不良因素均会对机体产生刺激并诱发组织或细胞内出现氧化应激及糖化反应，进而导致皮肤衰老[18]。糖化反应中过量的AGEs积累会导致皮肤中的胶原蛋白受到攻击和破坏，皮肤弹性下降；抑制透明质酸的合成、降低皮肤锁水能力；促进皮肤细胞凋亡，加剧皮肤老化，皮肤外观上出现表面不均、皱纹增多加深等[19]。此外，随着生理年龄增加，人体代谢减缓以及常年不健康生活的方式，使得体内糖化终产物量逐渐增加，细胞防御能力下降，同时伴随着氧化应激和炎症反应的发生。AGEs的形成和积累的同时，也使得皮肤细胞屏障功能降低，对外界刺激反应更强烈，从而产生更多的自由基。大量的自由基积累会使细胞中的脂质、蛋白质和DNA受到进一步的损伤。细胞在正常生理状态下，可通过自身的代谢系统清除过量的ROS以防止氧化损伤的发生，但AGEs超出细胞抗氧化系统承受限度则会持续消耗已有的抗氧化成分，促进糖化过程和氧化应激反应的发生。
本试验所使用的红藜-荞麦提取物在HFF-1细胞糖化产物损伤模型中表现出良好的抗氧化、抗糖化及糖化修复效果。而以红藜-荞麦提取物为主要原料的抗糖化饮品，通过受试者连续使用6周后，面部皮肤水分含量、皮肤光泽度及皮肤颜色L*值均有提升，皮肤颜色b*值、眼角皱纹深度也得到改善，说明该饮品不仅可提升皮肤水分含量、皮肤光泽度及皮肤亮度（白度），还具有改善脸部皮肤暗黄及淡化眼角细纹的功效。
继抗氧化后，抗糖化已经成为保健品行业新的关注点和风口之一，在相关产品研发的热度推动下，还需要发掘更多的天然、健康的绿色原料。我国应用历史悠久的传统药食两用类植物中拥有众多具有优秀功效潜力的原料资源，化妆品和保健食品行业可从中选择具有抗氧化或减少糖化产物AGEs生成的植物提取物，并对其作用机理及具体功效进行深入研究，为功效宣称提供坚实的科学依据和理论支持。
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