近年来，随着生活质量的提高，自由基和氧化作用对身体的损伤成为医学研究的热点之一，开发具有药理功能的天然色素成为研究的新方向。花色苷（antho cyanins）又称花青素，属多酚类化合物，是由花色苷和多糖经糖苷键结合而成[1]。研究发现，欧洲越橘花色苷作为一种天然抗氧化剂，在抗肿瘤[2]、抑制炎症[3]、降低血脂、增强血管弹性[3-4]等方面均能发挥作用。黑米是我国重要的功能稻资源，价格低廉，且其糙米果皮和种皮内富集有天然花色苷化合物，但其开发应用较少。欧洲越橘花色苷作为重要的抗氧化剂，已被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）列为无需认证的食品添加剂，广泛用于饮料、乳制品、糕点及医药行业[5]。目前对黑米花色苷的研究主要集中在花色苷的提取、分离、纯化及其抗氧化性关系的研究方面[6-9]，而黑米花色苷与欧洲越橘花色苷体内抗氧化水平差异还不清楚。本课题以黑米、欧洲越橘花色苷提取物为主要材料，通过动物体内实验，观察黑米花色苷提取物的抗氧化作用，并比较其与欧洲越橘花色苷在体内抗氧化作用差异及其对小鼠肝功的影响，为开发具有较强生理和药理功能而又价格低廉花色苷产品提供有效的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂与仪器
欧洲越橘花色苷提取物（花色苷含量25%）：南京泽朗医药科技有限公司；黑米花色苷提取物（花色苷含量13.5%）：晨光生物科技集团股份有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、总抗氧化能力（total antioxidant capability，T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransfease，ALT）试剂盒：南京建成生物工程研究所；iMark全自动酶标仪：美国Bio-Rad公司；UV1102型紫外可见分光光度仪：上海天美科学仪器有限公司；日立7170A型全自动生化分析仪：日本Hitachi公司。
1.1.2 实验动物
清洁级雄性昆明鼠大鼠70只，体重20 g左右:购自河北医科大学实验动物中心。
1.2 方法
1.2.1 实验动物分组和给药
小鼠按照体重随机分为：对照组（normal control，NC）、黑米花色苷低剂量组（low dosage of anthocyanins from black rice，LBR）、黑米花色苷中剂量组（middle dosage of anthocyanins from black rice，MBR）、黑米花色苷高剂量组（high dosage of anthocyanins from black rice，HBR）、欧洲越橘花色苷低剂量组（low dosage of anthocyanins from European bilberry，LEB）、欧洲越橘花色苷中剂量组（middle dosage of anthocyanins from European bilberry，MEB）、欧洲越橘花色苷高剂量组（high dosage of anthocyanins from European bilberry，HEB），共计7组，每组10只。通过灌胃方式给小鼠灌服花色苷水溶液，参考周艳华等方法[10]，低剂量组0.5 g/（kgbw·d）、中剂量组1.0 g/（kgbw·d）、高剂量组1.5 g/（kgbw·d），对照组小鼠灌服等量的蒸馏水，给药期间小鼠自由饮水、摄食，连续给药6周。每天观察小鼠毛色、饮食、大小便、活动状况，每天称重并根据体重调整给药剂量。
1.2.2 小鼠血清中抗氧化指标测定
小鼠灌胃结束，空腹12h，眼眶采血，以3 000 r/min、4℃离心10 min，分离血清。血清中SOD、CAT、T-AOC的检测严格按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书进行操作。
1.2.3 小鼠血清ALT、AST测定
由河北工程大学附属医院检验科生化室通过全自动生化分析仪测定。
1.2.4 小鼠肝组织中抗氧化指标测定
小鼠灌胃结束，空腹12 h，脱颈处死小鼠并分离肝脏组织，按质量比1∶9加入预冷的组织匀浆液[0.01 mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸（tris hydroxymethyl aminomethan-hydrochloride，Tris-HCl），0.001 mol/L 乙二胺四乙酸二钠（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na），0.01 mol/L 蔗糖，0.8%NaCl，pH 7.4]，制备肝组织匀浆液，4℃3 500 r/min离心10 min，取组织匀浆上清液，按照二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法测定试剂盒操作步骤测定蛋白质含量。肝组织中SOD、CAT、T-AOC的检测，严格按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书进行操作。
1.3 统计学分析
利用GraphPad Prism5.0软件进行数据分析，结果以
±s表示，组间差异比较采用t检验，P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有极显著性差异。
2 结果与分析
2.1 黑米与欧洲越橘花色苷对小鼠血清AST、ALT的影响
用黑米花色苷及欧洲越橘花色苷提取物对小鼠灌胃6周，采集小鼠血清，检测血清中AST、ALT水平，结果见表1。
表1 黑米与欧洲越橘花色苷对小鼠血清AST、ALT的影响（±s，n=10）
Table 1 The effects of anthocyanins from black rice and European bilberry on AST and ALT in serum of mice（±s，n=10）
注：*代表与NC组相比P＜0.05，差异显著；**代表与NC组相比P＜0.01，差异极显著。
分组 ALT/（U/L） AST/（U/L）NC 47.4±5.05 165.00±10.56 LBR 42.80±0.35 132.34±11.34 MBR 34.13±6.52* 125.00±15.13*HBR 33.35±4.50* 102.25±12.12*LEB 43.81±0.45 122.89±11.50*MEB 37.43±4.62* 117.12±8.13**HEB 30.65±6.74** 103.28±6.12**参考值 30～52 96～200
结果显示：随着花色苷剂量的增加，小鼠血清AST、ALT活力均有所降低；与对照组相比，中、高剂量欧洲越橘及黑米花色苷均能显著降低小鼠血清ALT、AST水平（P＜0.05），且在同等剂量时，黑米与欧洲越橘花色苷对小鼠血清AST、ALT影响无显著差异（P>0.05）。表明黑米及欧洲越橘花色苷均对小鼠肝脏发挥一定的保护作用。
2.2 黑米与欧洲越橘花色苷对小鼠血清T-AOC、SOD和CAT活力的影响
用黑米花色苷及欧洲越橘花色苷提取物对小鼠灌胃6周，采集小鼠血清并检测SOD、CAT和T-AOC活力，结果见图1。
图1 小鼠血清SOD、CAT和T-AOC活力检测（n=10）
Fig.1 Activity detection of SOD，CAT and T-AOC in serum of mice（n=10）
A.各组小鼠血清SOD活力；B.各组小鼠血清CAT活力；C.各组小鼠血清T-AOC活力。*表示与NC组相比P＜0.05，差异显著；**表示与NC组相比P＜0.01，差异极显著；#表示与LBR组相比P＜0.05，差异显著。
结果显示：小鼠血清SOD、CAT和T-AOC活力均随花色苷提取物剂量的增加逐渐上升，且与对照组相比有显著差异（P＜0.05）；在同等剂量情况下，黑米与欧洲越橘花色苷提取物对小鼠血清SOD、CAT活力的影响无显著差异（P>0.05）；但在低剂量时，欧洲越橘花色苷对小鼠肝脏T-AOC活力的提高显著低于黑米花色苷（P<0.05）。表明黑米及欧洲越橘花色苷提取物均能提高小鼠血清抗氧化水平，且在低剂量条件下黑米花色苷提取物总抗氧化作用水平高于欧洲越橘花色苷。
2.3 黑米与欧洲越橘花色苷对小鼠肝脏SOD、GSHPx和MDA的影响
黑米花色苷及欧洲越橘花色苷对小鼠灌胃6周，采集小鼠肝脏并制备匀浆液，检测小鼠肝脏组织中SOD、GSH-Px以及MDA含量，结果见图2。
图2 小鼠肝脏SOD、GSH-Px和MDA活力检测（n=10）
Fig.2 Detection of SOD，GSH-Px and MDA in liver of mice（n=10）
A.各组小鼠肝脏SOD活力；B.各组小鼠肝脏GSH-Px活力；C.各组小鼠肝脏MDA含量。*表示与NC组相比P<0.05，差异显著；**表示与NC组相比P<0.01，差异极显著；#表示与LBR组相比P<0.05，差异显著。
结果显示：与对照组相比，欧洲越橘及黑米花色苷均能显著提高小鼠肝脏SOD和GSH-Px活力；且在低剂量时，黑米花色苷对小鼠肝脏GSH-Px活力的提高显著高于欧洲越橘花色苷组（P<0.05）。与对照组相比，低、中、高剂量黑米及欧洲越橘花色苷均能显著降低小鼠肝脏MDA含量，且在同等剂量时，黑米与欧洲越橘花芭苷对小鼠肝脏MDA的清除能力无显著差异。表明黑米及欧洲越橘花色苷均能提高小鼠肝脏抗氧化水平，且在低剂量时黑米花色苷提取物在肝脏中抗氧化作用水平优于欧洲越橘花色苷。
3 讨论
黑米花色苷主要成分包括锦葵素、天竺葵-3，5-二葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3，5-二葡萄糖苷等，是黑米抗氧化作用的主要成分[11]。不同品种、产地黑米所含花色苷的主要成分会有所差异，此外黑米中含有人体需要的氨基酸、多种维生素、不饱和脂肪酸及微量元素等营养成分，均会影响花色苷提取物的抗氧化性能[12]。
本研究发现黑米与欧洲越橘花色苷均能显著提高小鼠血清抗氧化水平，该结果与石娟等采用高、中、低3种剂量的黑米花青素粗提物及其纯化物灌胃小鼠实验结果一致[13]。本研究证实在同等剂量时黑米与欧洲越橘花色苷对小鼠血清SOD、CAT的影响无显著差异，但在低剂量时黑米花色苷对小鼠血清总抗氧化水平以及肝脏中GSH-Px的提高显著高于欧洲越橘花色苷，该结果尚未见文献报道。研究证明黑米中花色苷主要有矢车菊素-3-葡萄糖苷和芍药定-3-葡萄糖苷，其含量分别为25.7%和1.7%[14]，而欧洲越橘含量最多的花色苷为矢车菊素-3-半乳糖苷，其次为矢车菊素-3-葡萄糖苷，分别占花色苷含量的13.18%和11.83%[15]。由于不同的花色苷增效基数目和位置不同，其抗氧化活性表现出了一定的差异[16]，因而推测黑米与欧洲越橘所含主要花色苷成分的不同也是造成其抗氧化性能差异的主要原因。本项目中测试样品为花色苷粗提物，前期研究发现黑米花色苷提取物与所用欧洲越橘花色苷提取物主要成分为多糖和花色苷，且两者在总糖、蛋白质、脂肪以及花色苷含量等方面均有显著差异[17]，所用花色苷成分复杂，因而不同剂量花色苷提取物造成两者氧化性能差异不同，具体原因有待进一步分析鉴定。
研究资料显示，欧洲越橘花色苷能通过提高机体氧化应激能力，对镉、CCl4诱导的肝损伤及酒精性肝损伤小鼠模型发挥保护作用[18-19]。项目组前期研究结果证实，黑米与欧洲越橘花色苷提取物对小鼠体重及心脏、肝、肾脏等主要脏器指数影响无显著差异[20]，本研究进一步证明，黑米花色苷在一定程度上能降低小鼠血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量，降低程度与同等剂量欧洲越橘相比无显著差异，表明黑米花色苷在一定程度上能保护肝脏功能。田密霞等通过给实验性糖尿病小鼠灌胃蓝莓花色苷4周，发现蓝莓花色苷可显著降低糖尿病小鼠肝脏中的丙二醛含量，谷胱甘肽过氧化物酶活性及总抗氧化能力均显著增加，并保持肝脏细胞的完整性[21]，该结果与本项目实验结果一致。进一步检测肝组织抗氧化指标，结果表明二者均能提高肝脏抗氧化作用水平，但低剂量黑米花色苷对GSHPx的提高优于欧洲越橘。项目组前期体外实验同样发现黑米花色苷对SOD的提高优于欧洲越橘花色苷[17]，该结果进一步提示黑米花色苷可作为一种优良的天然抗氧化剂，能通过提高机体抗氧化作用水平对肝脏发挥保护作用，但关于黑米花色苷对肝脏保护作用的确切机理还需要进一步研究。
4 结论
黑米花色苷作为一种天然抗氧化剂，与欧洲越橘花色苷相比具有较强或相近的抗氧化功能，可以通过提高血清和肝脏组织内抗氧化作用水平，有效地降低小鼠体内转氨酶水平，对肝脏发挥一定的保护作用。因此，黑米花色苷可以作为一种物美价廉的抗氧化剂应用于保肝护肝类保健品的开发。
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