香蕉，隶属芭蕉科（Musaceae），富含碳水化合物、矿物质和多种维生素，同时含有酚类、类黄酮等活性成分物质，具有润肠通便、抗氧化等保健功效[1]。香蕉采摘后易熟易坏，需及时加工[2]。香蕉果酒是利用香蕉果汁，经酿酒酵母发酵后而形成的低酒精度饮料酒。香蕉成熟后糖含量较高，适宜酿造果酒，它具有香蕉的特征香味，酒体醇正，基本保留了香蕉中的天然营养成分，具有一定的保健功能[3]。低温发酵过程缓慢，酵母菌能充分发挥产香作用[4]，低温限制了各种化学反应的速度，果酒中的挥发酸含量相对较少[5]，更有利于保留香蕉丰富的风味物质和香蕉浓郁的特征香气。
本试验采用低温发酵的方法，控制发酵温度在（20±3）℃酿造香蕉果酒，跟踪测定香蕉果酒在主发酵期间理化指标和活性成分的含量，通过测定香蕉果酒发酵过程中的香蕉果酒香蕉果酒酒精度、糖度、还原糖、吸光度、pH值、总糖、黄酮、多酚，掌握主要的理化指标和活性成分的变化规律，对香蕉果酒的品质进行评价。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
香牙蕉：市售；安琪酿酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；纤维素酶（10 000 U/g）、果胶酶（500 U/mg）、白砂糖、焦亚硫酸钾（均为食品级）：南宁东恒华道生物科技有限责任公司；柠檬酸、无水亚硝酸钠、没食子酸、芦丁、福林酚、茚三酮、3，5-二硝基水杨酸、磷酸、无水碳酸钠、无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、无水亚硫酸钠、苯酚、硫酸、无水葡萄糖、磷酸二氢钠、酒石酸钾钠、邻苯二甲酸氢钾（均为分析纯）：西陇化工股份有限公司。
1.2 主要仪器设备
T6型新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；WZS32手持阿贝折光仪：上海仪电物理光学仪器股份有限公司；PHS-3C pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；MC-SH2112电磁炉：广东美的生活电器制造有限公司；DL-1电子万用炉：北京市永光明医疗仪器有限公司；HWS-26电热恒温水浴锅：上海齐欣科学有限公司；XH-C涡旋混合器：江苏金怡仪器科技有限公司；电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；3H16RI智能高速离心机：湖南赫西仪器装备有限公司；BCD-645WKPZM电冰箱：合肥美的电冰箱有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 香蕉果酒制备工艺流程
1.3.2 测定方法
按照1.3.1的工艺酿造香蕉果酒，发酵期间每隔24 h取样进行检测。其中pH值和酒精度直接进行检测，其余检测项目则是将发酵液于5℃经8 000 r/min离心15 min后，取上清液进行检测。
1.3.2.1 理化指标检测
酒精度的测定：采用酒精计法。
糖度的测定：用手持阿贝折光仪测定，以可溶性固形物计。
吸光度A的测定：参考黎星辰等[6]的研究方法，取澄清后香蕉果酒的上清液，以蒸馏水作参比，用1 cm厚的比色皿，在波长420 nm处测定吸光度。
pH值的测定：采用pH计测定。
1.3.2.2 还原糖含量的测定
采用 3，5-二硝基水杨酸 （3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法测定[7]。取样液 1 mL，加 1 mL 缓冲溶液和2 mL DNS试剂，混匀后沸水浴5 min，冷却后加蒸馏水定容至25 mL，于540 nm处测吸光度，样品中还原糖的百分含量按下列公式进行计算：
式中：c为样品还原糖的浓度，mg/mL；V为样品体积，mL；m为样品质量，g；1 000为mg换算成g的系数。
1.3.2.3 总糖含量的测定
采用苯酚-硫酸法测定[8]。取样品1 mL于试管中，加蒸馏水至总体积1.0 mL，接着向试管依次加入1.0 mL 5%苯酚溶液、5.0 mL硫酸，静置10 min后涡旋使其充分混合，置于30℃水浴20 min，于490 nm处测吸光度值。样品中总糖的百分含量按下列公式进行计算：
式中：m1为查标准曲线得到的样品含糖量，μg；V1为样品定容体积，mL；m2为样品质量，g；V2为比色测定时样品的体积，mL；0.9为葡萄糖换算成葡聚糖的校正系数。
1.3.2.4 总多酚含量的测定
总多酚含量采用福林-酚（Folin-Ciocalteu）法测定[9]。取样品1 mL于试管中，加蒸馏水至总体积10 mL，摇匀后加入5.0 mL10%Folin-Ciocalteu显色剂，摇匀后静置3 min～8 min后再加入4.0 mL 7.5%碳酸钠溶液，摇匀后静置1 h，于765 nm处测吸光度，根据标准曲线回归方程得到样品中总多酚含量。
1.3.2.5 总黄酮含量的测定
总黄酮含量参考赵媛等[10]的研究方法。取样品1 mL于试管中，各管加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液后摇匀，静置6 min后加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀后静置6 min再加入4.0 mL 4%氢氧化钠，各管加入42%乙醇溶液使总体积为10 mL，静置30 min后于510 nm处测吸光度值，根据标准曲线回归方程得到样品中总黄酮含量。
1.3.2.6 氨基酸含量的测定
参照GB 5009.124-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》[11]。
采用日立L-8900高速氨基酸分析仪进行氨基酸的测定。测定条件为：色谱柱：磺酸型阳离子树脂；检测波长：570 nm和440 nm；检测器：可见光检测器；分离柱温：57℃；反应柱温：135℃。
1.3.2.7 有机酸含量的测定
有机酸含量测定采用高效液相色谱法[12]。
色谱柱：CAPECELL PAK MG S5 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：0.5%磷酸二氢铵缓冲溶液；检测波长：200 nm；进样量为 20 μL；柱温：30 ℃，流速：1 mL/min。
1.4 数据处理
试验所得数据采用Origin 9.1软件进行数据处理及绘图，采用Adobe Illustrator CS5软件进行数据图表的修饰。
2 结果与分析
2.1 香蕉果酒发酵过程中酒精度和糖度的变化
香蕉果酒发酵过程中，酵母菌利用糖生成乙醇、多元醇、乙醛和乙酸等物质[13]，糖度是指发酵液中尚未被酵母菌利用的糖分，其中乙醇是酵母代谢的主产物，乙醇含量是衡量发酵是否正常的重要指标。香蕉果酒发酵期间酒精度和糖度的变化见图1。
图1 香蕉果酒发酵期间酒精度和糖度的变化
Fig.1 Changes in alcohol content and sugar content during fermentation of banana wine
由图1可知，香蕉果酒的主发酵周期为11 d，在发酵过程中，随着发酵时间的增加，发酵液的酒精度呈上升趋势，糖度呈下降趋势，均在发酵2 d～7 d有大幅度变化，整体变化幅度相似。在刚接种发酵的1 d～2 d，酵母需要适应环境，并利用发酵罐中充足的氧气进行生长繁殖，并未立刻开始进行发酵，故糖度和酒精度都没有变化。3 d～4 d酵母的代谢活动最活跃，此时糖度的消耗速度最快，糖分被酵母用于生长繁殖和进行酒精发酵，酒精含量急剧上升。从发酵的第5天开始，糖度和酒精变化幅度变小，发酵第9天时，糖度不再下降，此时酒精度达到最高值，后期基本处于平缓状态。发酵后期酵母的代谢活动变慢，这可能是因为糖类被消耗，不能给酵母提供充足的营养物质，发酵液的pH值不再适宜酵母生长；同时随着发酵液中的酒精不断积累，对酵母的毒性增大，酒精浓度过高，容易抑制糖酵解过程中的关键酶的活性，降低酵母消耗葡萄糖的速度，从而影响细胞的生长速率[14]。
2.2 香蕉果酒发酵过程中吸光度的变化
香蕉果酒在发酵过程中容易褐变，测定不同时期发酵液的吸光度，可了解香蕉果酒的褐变程度。香蕉果酒发酵期间吸光度的变化见图2。
图2 香蕉果酒发酵期间吸光度的变化
Fig.2 Changes in absorbance values during the fermentation of banana wine
由图2可知，在发酵的前4 d，吸光度呈上升趋势，发酵第2天吸光度急剧上升，第4天吸光度是发酵过程中的最高值，高达0.24，之后整体呈缓慢下降趋势。前4 d吸光度上升的原因可能是因为酵母经过短暂的调整期后，进入指数期，酵母利用发酵液中充足的营养物质开始生长繁殖，酵母数量急剧增加。4 d～11 d，吸光度降低的原因可能是营养物质被消耗，不足以提供给予酵母用于生长繁殖，前4 d积累产生的乙醇、乙酸等物质开始抑制酵母的生命活动，酵母的生存空间也变小，酵母进入衰亡期，酵母数量大幅度减少；由于有机酸对酶促褐变有抑制作用，有可能是代谢的副产物如乙酸的含量增加，抑制果酒酶促褐变；也可能是由于各类反应结束，发酵液中大部分悬浮物质开始逐渐沉淀到发酵罐底部，果酒变得澄清透明。
2.3 香蕉果酒发酵过程中pH值的变化
香蕉果酒的发酵过程中，发酵液的pH值可以反映环境的酸度，即游离氢离子浓度的多少，酸性环境能有效抑制杂菌的生长，减少香蕉果酒发酵过程中被杂菌污染的可能[15]。
香蕉果酒发酵期间pH值的变化见图3。
图3 香蕉果酒发酵期间pH值的变化
Fig.3 Changes in pH during the fermentation of banana wine
由图3可知，香蕉果酒在发酵期间发酵液的pH值先降低后缓慢升高，到后期趋于稳定。引起pH值变化的原因较多，例如虽然酿酒酵母在发酵期间生成的产物主要是酒精，但葡萄糖还可以通过戊糖磷酸途径产生乳酸和柠檬酸等有机酸[16]，某些杂菌生产繁殖也会带来少量的乳酸和醋酸；少量二氧化碳气体溶解在发酵液中也会使得其pH值降低[17]。在发酵过程中，发酵液的pH值变化幅度较小，这是因为香蕉果酒可作为一种缓冲溶液，保持着较好的酸性环境，减少杂菌污染的可能性。
将图3和图1对比分析发现，当酵母活动最旺盛时（3 d～4 d），发酵液的pH值达到最小值，这和谢小花等[17]的研究结果相似。这可能是因为酵母在主发酵过程中积累了乙酸，酵母生命活动越旺盛，乙酸含量也就越高。乙酸是由乙醇氧化生成的产物，是酵母产生的主要酸性物质，给果酒风味带来负面的影响，其含量可以作为衡量原材料是否干净卫生、发酵过程清洁度是否达标的重要指标之一[18]。由于乙酸可以作为诱导物引起细胞程序性死亡，导致酵母的生命活动受到抑制，且它本身也可以吸附和絮凝部分酸性物质[19]，所以pH值略有波动，小幅度上升后最终趋于稳定。
2.4 香蕉果酒发酵过程中还原糖含量的变化
糖分是酒精发酵重要的控制参数，是酒精发酵重要的营养物质，其含量决定了果酒的酒精度且影响果酒的口感，通过检测发酵过程中还原糖的含量的变化可以判断发酵过程是否正常。香蕉果酒发酵期间还原糖的变化见图4。
图4 香蕉果酒发酵期间还原糖含量的变化
Fig.4 Changes in reducing sugar content during fermentation of banana wine
由图4可知，香蕉果酒还原糖在发酵的1 d～2 d呈上升趋势，可能是因为白砂糖在酵母中的蔗糖酶作用下，转化形成了葡萄糖和果糖，之后还原糖开始下降，在第3天下降速度最快，表明了此时酵母生命活动最剧烈，耗糖能力最强，发酵液中进行剧烈的各类化学反应。到第8天，还原糖变化幅度变小，逐渐趋于稳定，这是因为发酵液中的大部分糖分已被酵母消耗，且酵母前8 d发酵产生的代谢产物抑制了酵母的代谢动力，分解糖分的能力下降。
2.5 香蕉果酒发酵过程中总糖含量的变化
香蕉果酒发酵期间总糖的变化见图5。
图5 香蕉果酒发酵期间总糖含量的变化
Fig.5 Changes in total sugar content during fermentation of banana wine
总糖对果酒口感风味、色泽和稳定性等性质起着至关重要的作用[19]。在发酵的第2天总糖含量最高，这是因为发酵的第1天加入的白砂糖在发酵液中分解产生了单糖类化合物。之后总糖含量开始下降，在第3天变化最剧烈，由18.59 g/100 g降到了9.70 g/100 g，下降率达47.82%，之后下降速度缓慢，从发酵的第8天开始，总糖含量趋于稳定，香蕉果酒发酵结束时，总糖含量为3.33 g/100 g。总糖在第3天开始逐渐下降，可能是因为总糖和香蕉果酒中的蛋白质、单宁等物质形成不溶性的复合物。
2.6 香蕉果酒发酵过程中总多酚含量的变化
香蕉果酒发酵过程中总多酚含量与发酵时间的关系如图6所示。
图6 香蕉果酒发酵期间总多酚含量的变化
Fig.6 Changes in total phenolic content during fermentation of banana wine
随着香蕉果酒发酵时间的增加，总多酚整体呈现先下降后上升并趋于稳定的趋势，发酵结束时，香蕉果酒的总多酚含量为0.122 g/L，比香蕉原汁提高了1.1倍。总多酚在前期下降可能是因为刚开始进行发酵时，发酵罐中存在的氧气与多酚发生了氧化反应，也有可能是部分多酚和单宁类物质发生了聚合反应[20]。之后总多酚含量上升则有可能是随着发酵进行，酒精度不断积累，有利于多酚浸溶在发酵液中。在第4天总多酚含量略有上升，可能是某些单体酚类化合物含量增加引起的。引起多酚类化合物含量下降的原因有很多，其机理大多数是通过多酚化合物中的多元氢键和疏水键与总糖、蛋白质和生物碱等结合[21]。
2.7 香蕉果酒发酵过程中总黄酮含量的变化
黄酮类物质包括黄酮、异黄酮、二氢黄酮、查尔酮和黄酮醇、二氢黄酮醇等化合物，具有抗癌、抗氧化、抗衰老等功效作用，其含量的高低体现了发酵果酒的营养和保健价值。香蕉果酒发酵期间总黄酮含量的变化见图7。
图7 香蕉果酒发酵期间总黄酮含量的变化
Fig.7 Changes in total flavonoid content during the fermentation of banana wine
由图7可知，在香蕉果酒发酵期间，总黄酮含量变化幅度较小，其含量均在0.083 1 g/L至0.116 6 g/L间。由于黄酮的稳定性较差，易受自然光、pH值、还原剂等因素影响，且在主发酵期间，发酵液中的酶促反应、非酶促褐变和氧化反应都有可能对总黄酮含量有较大的影响，黄酮类物质在发酵罐缺氧环境后，氧化反应可能已经停止了，发酵液中更可能进行可逆的聚合或缩合反应[22]，使得总黄酮含量在后期波动较大。
2.8 香蕉果酒发酵过程中氨基酸含量的变化
氨基酸是果酒中重要的营养与呈味物质[23]。本次试验共检测出17种氨基酸（种类及含量见表1），包括除色氨酸外的其它所有必需氨基酸。
表1 香蕉果酒中氨基酸含量测定
Table 1 The evaluation of amino acid content in banana wine
氨基酸种类氨基酸含量/（mg/L）发酵第1天 发酵第3天 发酵第6天 发酵第9天门冬氨酸 29.1 25.8 24.2 25.8苏氨酸 48.5 43.3 38.4 41.6丝氨酸 19.8 17.6 19.4 16.3谷氨酸 0.00 4.39 5.19 6.01脯氨酸 6.44 6.21 8.90 8.32甘氨酸 8.38 8.40 8.27 8.54丙氨酸 8.44 9.16 9.33 9.80胱氨酸 2.55 2.63 2.63 2.52缬氨酸 11.8 9.26 8.22 8.54蛋氨酸 0.16 0.00 0.00 1.30异亮氨酸 2.82 1.80 1.65 0.99亮氨酸 29.4 18.4 14.7 14.7酪氨酸 2.31 1.73 1.39 0.32苯丙氨酸 3.25 2.51 1.37 1.31赖氨酸 23.0 15.4 10.9 10.9组氨酸 107 105 101 106精氨酸 27.2 20.1 8.48 10.4总量 330 292 259 273
酵母菌在发酵过程中代谢消耗氨基酸，例如酵母在发酵过程中代谢氨基酸产生高级醇[24]，适量的高级醇能赋予果酒特有的醇香[25]。香蕉果酒中主要的氨基酸为组氨酸，在果酒中的含量最高为106 mg/L。
随着果酒发酵的进行，香蕉果酒中氨基酸含量均呈下降趋势，含量最高的是组氨酸，占总氨基酸量的36.31%，另外几种含量较高的氨基酸是苏氨酸（14.89%）、门冬氨酸（9.09%）、亮氨酸（6.69%）、丝氨酸（6.63%）、精氨酸（5.73%）、赖氨酸（5.22%）。
2.9 香蕉果酒发酵过程中有机酸含量的变化
果酒中有机酸部分来源于果实（如酒石酸、苹果酸、柠檬酸等），部分来源于酒精发酵、乙酸或苹果酸-乳酸发酵（如乳酸、乙酸、琥珀酸等）。果酒中有机酸含量不仅对果酒风味、口味和色泽的平衡有重要作用，而且也影响果酒中各类物质的化学平衡、pH值，最终对果酒的品质产生影响[8]。
在香蕉果酒中，共检测到7种有机酸（见表2）。
表2 香蕉果酒中有机酸含量测定
Table 2 The evaluation of organic acid content in banana wine
发酵时间/d有机酸含量/（g/L）醋酸 草酸 酒石酸 柠檬酸 苹果酸 乳酸 琥珀酸1 0.78 1.70 2.82 4.88 7.54 1.71 0.82 2 0.62 1.82 2.93 5.01 7.77 1.69 1.06 3 1.37 1.29 2.60 4.49 5.27 1.62 1.09 4 2.30 0.89 2.06 3.62 4.47 0.40 0.60 5 0.00 1.26 2.55 1.57 5.18 5.80 1.00 6 0.00 1.26 2.53 1.96 5.25 6.60 2.22 7 0.00 1.51 2.78 2.71 5.55 7.81 2.70 8 0.00 1.20 2.48 2.37 5.23 7.28 1.35 9 0.00 1.19 2.48 2.39 5.20 4.96 1.56 10 0.00 1.51 2.85 2.88 5.63 5.17 1.98 11 0.00 1.49 2.81 2.88 5.52 5.22 2.04 12 0.00 1.52 2.82 2.90 5.50 6.20 2.12
其中苹果酸、柠檬酸、乳酸含量较高，是香蕉果酒发酵过程中主要的有机酸，发酵结束后，果酒中苹果酸含量达到5.50 g/L，占总有机酸含量的26.10%；乳酸含量达6.20 g/L，占总有机酸含量的29.42%；柠檬酸含量为2.90 g/L，占总有机酸含量的13.76%。醋酸的变化较为明显在前期较为明显的上升之后在第4天开始迅速下降，直至含量为0；草酸是一种最简单的二元羧酸，在植物体内广泛存在，在果酒发酵过程中，草酸含量呈现缓慢下降趋势，后期趋于稳定，一般情况下在啤酒中草酸含量要求小于15 mg/L[26]，香蕉酒中草酸浓度偏高，原因有可能与原料有关系，也有可能是设备没有清洗干净；酒石酸含量先下降再上升，之后保持稳定；柠檬酸具有清爽的口感[27]，在前发酵过程中呈现先下降后缓慢上升并趋于稳定状态；柠檬酸在酒精发酵过程中产生，继酒精发酵后的苹果酸-乳酸发酵中，苹果酸可被转化成酒精或乳酸[28]，苹果酸含量在显著下降后保持平稳状态；随着发酵进行，乳酸含量先减少后显著增加，可能是由于菌株通过己糖-磷酸途径将生成的5-磷酸-核酮糖裂解为3-磷酸甘油醛，再通过糖酵解途径（embden-eyerhof-parnas pathway，EMP）生成丙酮酸并还原成乳酸；琥珀酸是主要来自糖分子的发酵作用，是酒精发酵正常发酵产物，所以琥珀酸含量在发酵过程中显著上升[29]。
3 结论
本试验以香蕉为原料，在低温（20±3）℃的条件下发酵得到香蕉果酒，通过测定发酵过程中酒精度、糖度、吸光度、pH值、还原糖、总多酚和总黄酮等变化情况，分析其在发酵过程中的变化规律，评价香蕉果酒的质量。结果表明，在发酵过程中香蕉果酒的主要成分的变化存在一定的规律，发酵11 d的香蕉果酒最终达到12.11%vol的酒精度，糖度、还原糖含量随着酒精度的上升而减少；在发酵前4 d，发酵液的吸光度呈上升趋势，吸光度达到0.24后出现下降趋势，在还原糖下降速度最快时，pH值也出现了最小值4.2；总糖含量在发酵的第2天开始逐渐下降，在第3天变化最剧烈；在果酒发酵期间，总黄酮含量变化幅度较小；总多酚含量整体呈现先下降后上升至后期趋于稳定的趋势；氨基酸含量均呈下降趋势，含量最高的是组氨酸（106 mg/L）；有机酸中苹果酸、柠檬酸、乳酸含量较高，变化较明显。
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