乳杆菌是一类革兰氏阳性、无芽孢杆菌，可以发酵糖类（主要指葡萄糖）产生大量乳酸[1]。其具有维持肠道菌群平衡、促进肠道吸收、预防肿瘤、降低胆固醇、增强免疫力和预防衰老的功效。乳杆菌生长过程中产生的有机酸、过氧化氢等次级代谢产物对食品中的腐败菌具有一定抑制作用，因此其代谢产物常被用作食品加工和保藏过程中的天然防腐剂[2-4]。
细菌生物被膜（biofilm）是细菌适应胁迫环境的一种生存方式。食源性病原菌可以黏附于食品接触表面进行生长繁殖而形成生物被膜[5]。食源性病原菌生物被膜不仅会对食品加工设备、加工厂地板和墙壁表面等造成污染，还会导致食品的交叉污染、保质期降低等问题。病原菌形成生物被膜后对抗生素和抑菌剂的抵抗作用加强，较难以被清除 [6]。金黄色葡萄球菌（Stap-hylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）和沙门氏菌（Salmonella）是重要的食源性病原菌。在食品加工过程中，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌不仅能单独形成生物被膜，还能联合形成混合菌生物被膜[7]。
群体感应系统（quorum sensing，QS）是微生物通过分泌整合特定的信号分子，以启动细胞运动和生物被膜形成等行为的一种通讯机制[8]。AI-2信号分子广泛存在于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中，其不仅可介导种间交流，还可介导不同菌属间的相互交流[9-10]。因此，AI-2信号分子介导的群体感应系统在食源性病原菌生物被膜的建立和发展中起着至关重要的作用。
本研究选用从内蒙古传统发酵食品中筛选的5株乳杆菌，通过双层平板法、结晶紫染色法及AI-2分子活性测定，确定其所产抑菌活性物质对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌的单一菌生物被膜和混合菌生物被膜形成的干预作用。旨在寻求一种在食品加工和保藏过程中能有效控制病原菌生物被膜的天然抑菌剂。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
乳杆菌（菌株编号 ALAC-1、ALAC-2、ALAC-3、ALAC-4、ALAC-5）：分离自内蒙古传统发酵食品；大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC 11775-3、沙门氏菌（Salmonella）ATCC 14028、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC 26003-3、哈维弧菌（V.harveyi BB170）：中国普通微生物菌种保藏管理中心。
1.1.2 试剂
NaCl、MgSO4、KOH、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、精氨酸、甘油：分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司；考马斯亮蓝G-250溶液：广东环凯微生物科技公司。
胰蛋白胨大豆肉汤培养基（tryptonesoybroth，TSB）、MRS培养基、水琼脂培养基：北京陆桥生物技术有限公司；AB 培养基：0.3 mol/L NaCl，0.05 mol/L MgSO4，0.2%酸水解酪蛋白，用KOH调节pH值至7.5，121℃高压灭菌20 min，冷却后每100 mL培养基中加入1 mL 1mol/L PBS，1mL 0.1mol/L精氨酸和2 mL 50%甘油。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-2DF（标准型）双人单面净化工作台：苏州安泰空气技术有限公司；Synergy H1全功能微孔板检测仪：美国伯腾仪器有限公司；LDZX全自动高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂；SHB-III循环水真空泵：郑州长城科工贸有限公司；JY系列电子天平：上海浦春计量仪器有限公司；GHP隔水式恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；UV752紫外可见光分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；NU-C200R-E离心机：北京布拉德科技发展有限公司；XH-C漩涡混匀器：常州未来仪器制造有限公司。
1.3 方法
1.3.1 乳杆菌代谢产物的制备
乳杆菌ALAC-1、ALAC-2、ALAC-3、ALAC-4、ALAC-5活化3代后，将菌悬液以4%的接种量接种于MRS培养基中进行扩大培养，37℃厌氧培养24 h；4 000 r/min离心10 min后取上清液，0.22 μm滤膜过滤后于旋转蒸发仪中（45℃～55℃）浓缩至25倍；加入饱和硫酸铵溶液使浓缩物饱和度达60%，4℃放置过夜。离心（12 000 r/min，20 min，4℃）取沉淀，无菌PBS溶液溶解后得乳杆菌蛋白粗提液[11-12]。
1.3.2 指示菌菌悬液的制备
大肠杆菌ATCC 11775-3、金黄色葡萄球菌CMCC 26003-3、沙门氏菌ATCC 14028于37℃下活化后，无菌PBS梯度稀释至OD600nm=0.1，备用。
1.3.3 Bradford法测定蛋白质含量
以0.1 mg/mL牛血清蛋白为标准溶液，绘制标准曲线。按表1所示加入相应试剂，漩涡振荡混匀后室温（约25℃）静置2 min，以0号管作为空白对照，于595 nm波长下测定吸光值，以牛血清蛋白含量为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线[13]。
表1 标准曲线所有试剂
Table 1 Reagents used in standard curve
管号 标准蛋白质溶液/m L 蒸馏水/m L 考马斯亮蓝G-2 5 0试剂/m L 0 0 1.0 5 1 0.2 0.8 5 2 0.4 0.6 5 3 0.6 0.4 5 4 1.0 0 5
0.1 mL待测样品，加入5 mL考马斯亮蓝G-250，混匀并室温（约为25℃）静置2 min后于波长595 nm下测定吸光值。根据标准曲线，计算样品蛋白质含量。
1.3.4 乳杆菌代谢产物对3株病原菌浮游菌活性的测定
双层平板法测定抑菌性：水琼脂培养基倒板，待板凝固后用镊子将无菌牛津杯置于水琼脂上；无菌生理盐水将3株指示菌梯度稀释至103CFU/mL；1 mL指示菌液加入到25 mL TSB琼脂培养基，摇匀后倒入平皿中，凝固后取出牛津杯；于牛津杯里加入200 μL乳杆菌蛋白粗提液，37℃培养24 h后量取抑菌圈直径[14]。
1.3.5 乳杆菌代谢产物对单一菌和混合菌生物被膜形成的影响
1.3.5.1 乳杆菌代谢产物对单一菌生物被膜形成的影响
200 μL TSB 培养基（含 5 株终浓度为 40、50、60、70、80 μg/mL的乳杆菌蛋白粗提液）加入96孔微量板中，将OD600nm=0.1的3株病原菌菌悬液分别按照体积比1∶100接种于96孔板中，37℃下培养24 h后弃去菌液。每孔加入300 μL磷酸盐缓冲液冲洗3次去除浮游菌；用200 μL无水甲醇固定15 min后弃液，60℃下干燥1 h；加入200 μL 2%结晶紫染液染色20 min，蒸馏水洗去多余染液；干燥后加入300 μL 33%冰醋酸反应10 min，酶标仪测定630 nm下的吸光值[15]。平行试验3次，抑制率计算公式为：
1.3.5.2 乳杆菌代谢产物对混合菌生物被膜形成的影响
OD600nm=0.1的3株病原菌菌悬液按体积比1∶1∶1混合后以1%的接种量接种于96孔板中，乳杆菌蛋白代谢物加量及生物被膜培养测定方法同1.3.5.1。
1.3.6 乳杆菌代谢产物对病原菌群体感应信号分子的影响
1.3.6.1 乳杆菌代谢产物对单一菌AI-2分子释放的影响
将10 μL OD600 nm=0.1的3株病原菌分别接种于1 mL TSB培养基（含终浓度为60 μg/mL乳杆菌代谢产物），37℃培养8 h后离心（12 000 r/min，10 min）取上清液，0.22 μm滤膜过滤后保存于4℃冰箱。AI-2分子的报告菌株V.harveyi BB170于30℃摇床转速200 r/min培养过夜，用新鲜AB培养基以1∶5 000（体积比）稀释V.harveyi BB170培养物。96孔板的每孔中加入10 μL含乳杆菌的过滤液和100 μL稀释后的AB培养液，同时以不加乳杆菌的稀释液上清液做对照。于30℃、200 r/min下培养，酶标仪每隔1 h测一次发光值，直至5 h，平行试验3次。试验结果以相对活性强度表示，即试验组上清液的发光强度与阳性对照组的发光强度之比，当阳性对照组的发光强度达到最大时，设此时的相对活性强度为100%[16]。
1.3.6.2 乳杆菌代谢产物对混合菌AI-2分子释放的影响
将OD600nm=0.1的3株病原菌以体积比1∶1∶1混合后，取10 μL接种于1 mL TSB培养基（含终浓度为60 μg/mL乳杆菌代谢产物），37℃培养8 h后离心（12 000 r/min，10 min） 取上清液，0.22 μm 滤膜过滤后保存于4℃冰箱。混合菌AI-2信号分子相对活性强度的测定同1.3.6.1。
2 结果与分析
2.1 蛋白质标准曲线
以0.1 mg/mL牛血清蛋白溶液为标准溶液，以牛血清蛋白含量为横坐标，A595为纵坐标绘制蛋白质标准曲线，结果如图1所示。
图1 蛋白质标准曲线
Fig.1 Protein standard curve
该曲线线性回归方程为：Y=0.005x+0.037 3，R2=0.995 3，表明标准牛血清蛋白溶液浓度在0～100 μg/mL的线性关系良好。
2.2 牛津杯法测定抑菌活性
以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌为指示菌，测定5株乳杆菌的抑菌活性，结果见表2。
表2 5株乳杆菌的抑菌效果
Table 2 Antibacterial activity of five Lactobacillus mm
注：数据表示抑菌圈直径（含牛津杯直径：7.8 mm）。
菌株编号 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 沙门氏菌ALAC-1 25.89±0.39 30.8±0.50 26.64±0.82 ALAC-2 21.49±0.10 26.85±0.23 23.35±0.99 ALAC-3 17.99±0.88 21.19±0.59 19.26±0.74 ALAC-4 19.91±0.40 21.87±0.19 22.07±0.23 ALAC-5 29.47±0.60 32.95±1.19 32.22±0.77
如表2所示，5株乳杆菌蛋白粗提液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌均有抑制作用。其对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最强，沙门氏菌和大肠杆菌次之，且抑菌强度均为ALAC-5＞ALAC-1＞ALAC-2＞ALAC-4＞ALAC-3。
2.3 乳杆菌代谢产物对单一菌和混合菌生物被膜形成的影响
于事先装有 ALAC-1、ALAC-2、ALAC-3、ALAC-4、ALAC-5代谢产物的TSB培养基中分别接种食源性细菌（金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌）及其混合菌，37℃下培养24 h后通过结晶紫染色法测定其生物被膜的形成能力，结果见图2。
图2 乳杆菌代谢产物对病原菌生物被膜形成能力的影响
Fig.2 Effect of Lactobacillus metabolites on biofilm formation ability of pathogenic bacteria
由图 2 可知，ALAC-1、ALAC-2、ALAC-3、ALAC-4和ALAC-5代谢产物均可抑制3株病原菌及其混合菌生物被膜的形成，且生物被膜的形成力随着粗提液蛋白含量的增大而逐渐减弱。ALAC-5代谢产物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及其混合菌的成膜能力抑制率最高，ALAC-4最弱。在未添加乳杆菌代谢产物时，金黄色葡萄球菌生物被膜在630 nm下的吸光度为 0.095±0.005 3，大肠杆菌 0.16±0.004，沙门氏菌0.093±0.002 6，混合菌 0.073±0.001，混合菌生物被膜的OD值明显低于3株病原菌单独形成的生物被膜，这是因为在混合菌生物被膜中，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌间存在竞争作用，使得膜中各菌株数量明显减少。Rüger M等[17]通过对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的混合菌生物被膜研究发现，不同菌株间的拮抗性使得其生长速度及数量明显减弱。Millezi F等[18]研究发现在双菌种生物膜中，大肠杆菌会降低金黄色葡萄球菌的易感性。
当乳杆菌代谢产物中的蛋白含量为80 μg/mL时，ALAC-1、ALAC-5对大肠杆菌生物被膜的抑制率最强，分别为 63.67%、66.39%，菌株 ALAC-2、ALAC-3次之，抑制率分别为61.80%、51.98%，ALAC-4最弱，为49.27%；对沙门氏菌生物被膜抑制率大小为：ALAC-5（74.91%）＞ALAC-1（65.23%）＞ALAC-2（56.99%）＞ALAC-4（45.16%）＞ALAC-3（40.50%），相比大肠杆菌，沙门氏菌对ALAC-5和ALAC-1敏感性较强，对其余4株较弱之；ALAC-5对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制率高达78.95%，其余4株抑制作用同大肠杆菌，即 ALAC-1（69.47%）＞ALAC-2（51.23%）＞ALAC-3（45.61%）＞ALAC-4（36.49%），但 ALAC-2、A LAC-3和ALAC-4对金黄色葡萄球菌的抑制作用低于大肠杆菌和沙门氏菌；混合菌生物被膜抑制率为ALAC-5（51.82%）＞ALAC-1（44.55%）＞ALAC-2（39.10%）＞ALAC-3（32.72%）＞ALAC-4（31.36%），混合菌生物被膜对乳杆菌代谢产物的抗性高于3株单一菌生物被膜，因为混合菌生物被膜中各个菌株分泌胞外多糖等物质的多样性，使得菌株间的黏连作用及相互作用力更强，较难以被外界不利因素所影响，增加了混合菌生物被膜的耐药性[19-20]。
2.4 乳杆菌代谢产物对病原菌AI-2活性的影响
通过报告菌株V.harveyi BB170的生物发光值，测定了5株乳杆菌代谢产物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及其混合菌AI-2信号分子活性的影响，结果如图3所示。
图3 乳杆菌代谢产物对病原菌AI-2活性的影响
Fig.3 Effect of Lactobacillus metabolites on activity of pathogenic AI-2
V.harveyi BB170可调控群体感应信号分子AI-2，菌株上清液中的AI-2分子的含量越高，发光强度越大[21]。由图3可知，5株乳杆菌代谢产物对3株病原菌及其混合菌的AI-2相对活性均有影响，相比空白对照，添加了乳杆菌代谢产物的上清液AI-2分子活性明显降低。添加了ALAC-1、ALAC-5代谢产物的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及其混合菌的AI-2信号分子活性最低，说明这2株乳杆菌对病原菌的抑制作用最强，再次佐证了分离自内蒙古传统发酵食品中的乳杆菌对病原菌的抑制作用。
3 结论
本研究以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌为指示菌，研究了内蒙古传统发酵食品中筛选的乳杆菌 ALAC-1、ALAC-2、ALAC-3、ALAC-4 和 ALAC-5代谢产物对病原菌及其生物被膜的抑制作用，并通过群体感应信号分子AI-2相对活性的检测进一步证实了乳杆菌代谢产物对病原菌的抑制作用。结果表明，5株乳杆菌对单一菌和混合菌生物被膜均有抑制作用，且随着代谢产物中蛋白浓度的增加，生物被膜的形成能力逐渐减弱；ALAC-1和ALAC-5代谢产物对病原菌生物被膜及其AI-2活性抑制效果最好。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌是食品工业中最常见的食源性病原菌，同时也是引起食品污染及腐败的主要污染菌，大量研究表明，这些细菌可形成生物被膜以增加对不良环境条件的抗性，给食品加工生产与人们的生活带来不便。因此本试验从内蒙古传统发酵食品中筛选了具有抑菌作用的乳杆菌，研究其对病原菌及其生物被膜的抑制作用，不仅为食品实际生产提供了一种天然防腐剂，也为之后筛选乳杆菌抑菌基因提供了理论基础。
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