血管内皮细胞作为血管以及心脏内膜的重要组成成分，具有多种重要的生理功能，如调节血管张力、传递血管信息，同时还可以产生和释放多种血管活性物质[1]。研究表明，多种因素均可诱导血管内皮细胞的损伤，如氧化低密度脂蛋白、肿瘤坏死因子-α、氧化应激、同型半胱氨酸等[2-5]。内皮细胞的功能障碍以及结构损伤可能是各种心脑血管疾病，特别是动脉粥样硬化的起始因素之一[6]。因此，防止血管内皮细胞凋亡的发生及进展对于防治动脉粥样硬化及其他多种心脑血管相关疾病均具有非常重要的意义。
草苁蓉（Boschniakia rossica Fedtsch.et Flerov）为列当科草苁蓉属植物，具有极高的药用价值，多糖是其重要的活性成分[7]。研究表明，草苁蓉多糖（Boschniakia rossica polysaccharides，BRPS）具有抗肿瘤、免疫调节、抗炎等多种作用[8-9]。课题组前期研究还表明，草苁蓉多糖可清除血管内皮细胞内自由基，抑制氧化应激所致的内皮细胞凋亡[10]。因此，本研究采用叔丁基过氧化氢（tert-butylhydroperoxide，t-BHP）损伤血管内皮细胞制备人脐静脉血管内皮细胞（humanumbilicalveinendothelialcells，HUVEC）凋亡模型，探讨 BRPS 对 t-BHP 所致的血管内皮细胞凋亡相关蛋白表达的影响，旨在为草苁蓉在心脑血管疾病防治中的应用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
BRPS：延边大学医学院生物化学与分子生物学实验室自制（纯度86.5%），过滤除菌后备用[10-11]。HUVEC细胞：南京凯基生物技术有限公司；DMEM高糖培养基：Biological Industries公司；胎牛血清：美国Gemini公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI）凋亡检测试剂盒：北京庄盟国际生物基因科技有限公司；兔胱天蛋白酶原（pro-cysteine aspastic acid-specific protease，Procaspase）-3 抗体、兔 Procaspase-8抗体、兔Procaspase-9抗体、兔细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）抗体、兔p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38）抗体、兔p-ERK抗体、兔磷酸化c-Jun N末端激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，p-JNK）抗体、小鼠 p-p38抗体、兔 Survivin 抗体、小鼠p53抗体、兔聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]抗体、兔核转录因子-кB（nuclear factor-кB，NF-кB）抗体：美国 CST 公司；兔JNK1/2抗体：美国Abcam公司；小鼠β-actin抗体、兔抗小鼠二抗、羊抗兔二抗：美国Sigma-Aldrich公司；电化学发光（electro-chemi-luminescence，ECL）检测试剂盒：Merck millipore公司。
1.2 仪器与设备
ZCOR-1150二氧化碳培养箱：美国宝特公司；DYCZ-24DN垂直板电泳仪：北京市六一仪器厂；全自动化学发光成像分析系统：美国UVP公司；FACSCanto II流式细胞仪：美国BD公司。
1.3 试验方法
1.3.1 细胞培养及分组
HUVEC细胞用含10%胎牛血清和双抗的DMEM培养基，将HUVEC细胞放置于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下的CO2培养箱中，每1 d～每2 d更换一次新的培养基或者进行传代，取对数生长期的细胞进行分组培养[10-12]。将细胞分为3组，即正常组、t-BHP组（损伤组）和BRPS组，正常组细胞换入无血清培养液；损伤组细胞加入t-BHP溶液，使其终浓度为200 μmol/L，并损伤8 h；BRPS组细胞加入BRPS溶液，使其终浓度达到50 mg/L，放入培养箱继续培养24 h后，再加入200 μmol/L t-BHP诱导损伤8 h。
1.3.2 BRPS对t-BHP损伤HUVEC细胞活力的影响
细胞分组及处理按照1.3.1的方法进行，按常规CCK-8法计算细胞存活率。
细胞存活率/%=OD 试验组/OD正常组×100
1.3.3 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡
细胞分组及按照1.3.1的方法处理之后，用0.25%的胰蛋白酶消化细胞并收集于离心管中，低温高速离心机1 500 r/min离心5 min，弃去上清，再加入4℃预冷的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）重悬细胞，1 500 r/min离心5 min再次离心，弃上清，加入300 μL结合缓冲液，用移液器轻轻吹打细胞，使其形成悬浮液，并调整细胞数为1×106cell/mL，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI溶液，移液器吹打混匀，室温避光孵育5 min～15 min，使用流式细胞仪检测，并计算细胞凋亡率。
凋亡率/%=早期凋亡率+晚期凋亡率
1.3.4 Western blotting技术检测凋亡相关蛋白的表达水平
蛋白样品制备：细胞分组及处理方法同1.3.1，用4℃预冷的PBS清洗3遍，加入适量含蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸酶抑制的RIPA裂解液，将培养皿放在冰上裂解细胞30 min，每隔5 min晃匀一次，用细胞刮刀将细胞收集到预冷的离心管中，低温高速离心机4℃、12 000 r/min离心20 min，小心抽取上清液，蛋白定量后，加入5倍上样缓冲液，样品于沸水浴煮沸10 min左右，制备好的蛋白样品于-80℃保存备用。Western blotting实验：取30 μg蛋白样品，进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至聚偏氟乙烯膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，漂洗之后与相应一抗4℃下孵育过夜，漂洗之后加入相应二抗25℃孵育2 h，漂洗，ECL显色、曝光、分析条带。
1.3.5 数据处理和统计学分析
利用SPSS20.0软件，计量资料用x±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果与分析
2.1BRPS对t-BHP诱导HUVEC细胞活力及凋亡的影响
t-BHP可诱发内皮细胞产生过量活性氧自由基，导致细胞损伤甚至凋亡，而CCK-8法和Annexin VFITC/PI双染法分别是检测细胞活力和凋亡最为常用的检测的方法[13]，BRPS对t-BHP诱导的HUVEC细胞活力及凋亡的影响见图1。
图1BRPS对t-BHP诱导的HUVEC细胞活力及凋亡的影响
Fig.1 Effect of BRPS on viability and apoptosis of HUVEC induced by t-BHP
A、B分别为Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞活力和凋亡率图与CCK-8法检测细胞活力和凋亡率柱状图；与正常组比较差异显著（*P＜0.05），与损伤组比较差异显著（#P＜0.05）。
由图1可见，正常组可见少量早期凋亡和中晚期凋亡，损伤组可见大量早期凋亡和中晚期凋亡，BRPS保护后凋亡细胞明显变少。CCK-8法和Annexin VFITC/PI双染法显色结果显示，与正常组比较，损伤组HUVEC细胞活力降低50.6%（P＜0.05），凋亡率升高41.0%（P＜0.05）；与损伤组比较，BRPS组 HUVEC活力升高 16.4%（P＜0.05），凋亡率降低 22.2%（P＜0.05）。
2.2 BRPS对HUVEC细胞Procaspase-3、Procaspase-8、Procaspase-9蛋白表达的影响
半胱天冬酶级联系统在细胞内凋亡信号的诱导、转导、扩增中起重要作用，其激活主要依赖线粒体途径和死亡受体途径，激活后下游Caspase通过切割特异性底物导致细胞凋亡[14]，BRPS对HUVEC细胞Caspase前体蛋白表达的影响见图2。
图2BRPS对HUVEC细胞Caspase前体蛋白表达的影响
Fig.2 Effect of BRPS on protein expression of procaspases in HUVEC
A、B分别为BRPS对HUVEC细胞Procaspase-3、Procaspase-8、Procaspase-9蛋白表达影响的Western blotting图与柱状图；与正常组比较差异显著（*P＜0.05），与损伤组比较差异显著（#P＜0.05）。
由图2可见，与正常组比较，损伤组HUVEC细胞中 Procaspase-3、Procaspase-8、Procaspase-9 蛋白表达降低（P＜0.05）；与损伤组比较，BRPS 组 Procaspase-3、Procaspase-8、Procaspase-9蛋白表达升高（P＜0.05）。
2.3BRPS对HUVEC细胞PARP蛋白表达的影响
PARP为Caspase-3的特异性底物，Caspase-3激活可促使其发生剪切，促使细胞凋亡[14]，BRPS对HUVEC细胞PARP蛋白表达以及切割产物Cleaved-PARP水平的影响见图3。
由图3可见，与正常组比较，损伤组PARP蛋白表达水平降低（P＜0.05），Cleaved-PARP蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与损伤组比较，BRPS组 PARP 蛋白表达水平升高（P＜0.05），Cleaved-PARP蛋白表达水平降低（P＜0.05）。
图3BRPS对HUVEC细胞PARP蛋白表达的影响
Fig.3 Effect of BRPS on protein expression of PARPs in HUVEC
A、B分别为BRPS对HUVEC细胞PARP蛋白表达影响的Western blotting图与柱状图；与正常组比较差异显著（*P＜0.05），与损伤组比较差异显著（#P＜0.05）。
2.4 BRPS对HUVEC细胞Survivin蛋白表达的影响
Survivin是凋亡抑制因子家族中最小的成员，在细胞凋亡中发挥重要作用[15]，BRPS对HUVEC细胞Survivin蛋白表达的影响见图4。
图4BRPS对HUVEC细胞Survivin蛋白表达的影响
Fig.4 Effect of BRPS on protein expression of survivin in HUVEC
A、B分别为BRPS对HUVEC细胞Survivin蛋白表达影响的Western blotting图与柱状图；与正常组比较差异显著（*P＜0.05），与损伤组比较差异显著（#P＜0.05）。
由图4可见，与正常组比较，损伤组Survivin蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与损伤组比较，BRPS组Survivin蛋白表达水平升高（P＜0.05）。
2.5 BRPS对HUVEC细胞p53蛋白表达的影响
p53是肿瘤抑制蛋白，参与细胞周期控制、凋亡和应激反应等过程。p53激活通过线粒体途径介导细胞凋亡，促进细胞色素c从线粒体释放，Caspase-9激活，然后激活Caspase-3、6和7，最终引起细胞凋亡[16]，BRPS对HUVEC细胞p53蛋白表达的影响见图5。
图5BRPS对HUVEC细胞p53蛋白表达的影响
Fig.5 Effect of BRPS on protein expression of p53 in HUVEC
A、B分别为BRPS对HUVEC细胞p53蛋白表达影响的Western blotting图与柱状图；与正常组比较差异显著（*P＜0.05），与损伤组比较差异显著（#P＜0.05）。
由图5可见，与正常组比较，损伤组p53蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与损伤组比较，BRPS组 p53蛋白表达水平降低（P＜0.05）。
2.6 BRPS对HUVEC细胞核NF-кB蛋白表达的影响
NF-кB与细胞凋亡、应激反应、炎症等过程密切相关，并且具有抗凋亡和抑凋亡的双向作用[17]，BRPS对HUVEC细胞核NF-кB蛋白表达的影响见图6。
图6BRPS对HUVEC细胞核NF-κB蛋白表达的影响
Fig.6 Effect of BRPS on protein expression of nuclear NF-кB in HUVEC
A、B分别为BRPS对HUVEC细胞核NF-кB蛋白表达影响的Western blotting图与柱状图；与正常组比较差异显著（*P＜0.05），与损伤组比较差异显著（#P＜0.05）。
由图6可见，与正常组比较，损伤组细胞核NF-кB蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与损伤组比较，BRPS组细胞核NF-кB蛋白表达水平降低（P＜0.05），提示NF-кB可能参与BRPS抗HUVEC细胞凋亡作用的调控。
2.7BRPS对HUVEC细胞ERK信号通路的影响
ERK是与细胞增殖、分化、凋亡等密切相关的信号通路[18]，BRPS对HUVEC细胞ERK蛋白表达及其磷酸化蛋白p-ERK水平的影响见图7。
图7BRPS对HUVEC细胞ERK蛋白表达的影响
Fig.7 Effect of BRPS on protein express of ERKs in HUVEC
A、B分别为BRPS对HUVEC细胞ERK信号通路影响的Western blotting图与柱状图；与正常组比较差异显著（*P＜0.05）。
由图7可见，与正常组比较，损伤组p-ERK/ERK相对比值升高（P＜0.05）；与损伤组比较，BRPS组p-ERK/ERK相对比值无显著变化（P＞0.05），提示ERK磷酸化可能与BRPS的HUVEC细胞凋亡抑制作用无关。
2.8 BRPS对HUVEC细胞p38信号通路的影响
p38信号通路在细胞凋亡、炎症、应激反应等过程中具有重要作用，H2O2等多种因素均可诱导p38信号通路激活[19]，BRPS对HUVEC细胞p38蛋白表达及其磷酸化蛋白p-p38水平的影响见图8。
由图8可见，与正常组比较，损伤组p-p38/p38相对比值升高（P＜0.05）；与损伤组比较，BRPS组 p-p38/p38相对比值降低（P＜0.05），提示p38磷酸化可能与BRPS抗HUVEC细胞凋亡作用的调控有关。
图8BRPS对HUVEC细胞p38蛋白表达的影响
Fig.8 Effect of BRPS on protein expression of p38 in HUVEC
A、B分别为BRPS对HUVEC细胞p38信号通路影响的Western blotting图与柱状图；与正常组比较差异显著（*P＜0.05），与损伤组比较差异显著（#P＜0.05）。
2.9BRPS对HUVEC细胞JNK信号通路的影响
JNK信号通路在外源性死亡受体途径和内在的线粒体凋亡途径中起关键作用，JNK信号通路通过特异性转录因子的反式激活上调促凋亡基因如p53等或调节线粒体凋亡蛋白的活性而诱导细胞凋亡[19-20]，BRPS对HUVEC细胞JNK蛋白表达及其磷酸化蛋白p-JNK水平的影响见图9。
图9BRPS对HUVEC细胞JNK蛋白表达的影响
Fig.9 Effect of BRPS on protein expression of JNKs in HUVEC
A、B分别为BRPS对HUVEC细胞JNK信号通路影响的Western blotting图与柱状图；与正常组比较差异显著（*P＜0.05），与损伤组比较差异显著（#P＜0.05）。
由图9可见，与正常组比较，损伤组p-JNK/JNK相对比值升高（P＜0.05）；与损伤组比较，BRPS组p-JNK/JNK相对比值降低（P＜0.05），提示JNK磷酸化可能与BRPS抗HUVEC细胞凋亡作用的调控有关。
3 结论
本研究结果显示，t-BHP增高HUVEC细胞凋亡，下调 Procaspase-3、Procaspase-8、Procaspase-9 蛋白表达，增强其底物蛋白PARP的切割使Cleaved-PARP蛋白增多。同时，下调凋亡抑制蛋白Survivin的表达，上调p53蛋白表达，升高JNK、p38及NF-кB蛋白的激活水平。而BRPS降低HUVEC细胞凋亡，增高Procaspase-3、Procaspase-8、Procaspase-9 蛋白表达，减少PARP的切割，上调Survivin表达，下调p53蛋白表达，并降低JNK、p38以及NF-кB蛋白的激活水平。综上所述，BRPS抑制t-BHP引起的血管内皮细胞凋亡，调控凋亡相关蛋白Survivin及p53蛋白的表达，其机制可能与JNK、p38及NF-кB的调控有关，但具体调控机制还需进一步研究。
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