泡菜具有悠久的历史，不同国家、不同地区制作泡菜的工艺有差异，但大部分采用脆度较高的蔬菜，添加食盐、香辛料，在避光、隔绝空气的条件下，室温条件自然发酵，不同地区的泡菜中也就具备不同种类和功能的益生菌，比如干酪乳杆菌[1-2]、乳酸链球菌[3]、植物乳杆菌等[4-5]。因此，从泡菜中筛选具有一定生理功能的益生菌也成为近年来的研究热点。全永亮[6]从山东烟台家庭自制的泡菜中分离得到1株分泌抑菌物质的乳酸菌菌株。刘苏萌等[7-8]从泡菜中分离出降解亚硝酸盐的乳杆菌属以及降解胆固醇的链球菌属。Li F等[9]从泡菜中分离出具有缓解便秘的植物乳杆菌等。
重金属铅被人体吸入后几乎都是形成不溶性的磷酸三铅，沉积于骨骼中，还有少量在肝、肾和血液中[10]。铅对人体的肝、肾、脑组织等产生毒作用，并且干扰免疫系统的功能。清除重金属的方法中物理法效果不佳，化学法存在残留，具有安全隐患，生物法是高效、环保、安全的[11]。益生菌作为生物吸附剂应用于生物法去除重金属是值得研究的，因此，筛选能够降解铅的益生菌也成为近年来研究的热点，江南大学陈卫教授的研究团队就筛选得到植物乳杆菌CCFM8661在体外对铅离子具有优良的吸附和耐受能力[12]。
本研究旨在以南充的本地特色泡菜为材料，设置降解铅的能力大小为筛选因子，平板涂布法筛选出能够降解铅的乳酸菌，并且对其进行耐受铅的能力大小以及产酸的测定、体外模拟肠道环境进行的耐酸和耐胆盐能力的测定，筛选出一株目标菌，并对其进行生化和分子鉴定，为重金属铅的生物降解法提供参考。
1 材料与仪器
1.1 材料
泡菜：南充市高坪区江东农贸市场及小龙镇农贸市场。
MRS培养基（1 L）：蛋白胨 10.0 g、牛肉浸粉 5.0 g、酵母浸粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、磷酸二氢钾2.0 g、柠檬酸三铵2.0 g、乙酸钠5.0 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g、吐温80 1 mL、蒸馏水1 L，pH值调至6.2，固体培养基另加18.0 g琼脂，121℃灭菌25 min。
1.2 主要试剂
铅单元素标液（Pb2+，1 000 μg/mL）：中国计量科学院标准物质中心；细菌基因组DNA提取试剂盒：北京百泰克生物技术有限公司；溴甲酚紫：上海迈坤化工有限公司；牛胆盐：上海博微生物科技有限公司；乙酸钠、硫酸镁：天津市致远化学试剂有限公司。以上试剂均为分析纯。
1.3 仪器
SHP-180生化培养箱：金坛市杰瑞尔电器有限公司；TGL-16台式高速冷冻离心机：四川蜀科仪器有限公司；UPY-111-102优普超纯水制造系统：四川优普超纯科技有限公司；722N紫外-可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；AAnalyst 400原子吸收分光光度计：美国Perkin Eimer公司。
2 方法
2.1 原料预处理
将市购的泡菜在无菌条件切碎，在无菌条件下混合泡菜汁液并在组织捣碎机中打成浆液，取10 g泡菜浆液，备用。
2.2 平板初筛
采用平板涂布法，用含有1%的无菌生理盐水稀释梯度泡菜浆液至100倍，分别吸取每个稀释度样品100 μL，在含有0.1%溴甲酚紫的MRS固体培养基上进行涂布，在36℃下倒置恒温培养48 h，待其长出单菌落，进行划线分离，连续分离纯化3次，将所得菌株进行编号，进行革兰氏染色以及接触酶试验，初步判断是否为乳酸菌。
2.3 降解铅能力的复筛
2.3.1 铅浓度的测定
参照国标GB 5009.12-2017《食品安全国家标准食品中铅的测定》火焰原子吸收法[13]，配制铅标准系列，浓度分别为 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 μg/mL，经原子吸收分光光度计在283.3 nm波长处进行吸光度测定，并绘制标准曲线。
样品中铅浓度的测定，取5 mL样品加入浓硝酸进行消解至无色，再用超纯水定容至50 mL，利用原子吸收分光光度计在283.3 nm波长处进行吸光度测定。
2.3.2 降解铅的能力复筛
将平板初筛得到的单菌落挑取至25 mL MRS液体培养基中，36℃恒温静置培养36 h，在600 nm波长处测定OD值，并将所有菌液稀释至相同浓度。以3%接种量接入30 mL含10 μg/mL铅的MRS培养液，24 h后用火焰原子吸收分光光度法测定铅的含量。根据初始加入的10 μg/mL的量计算重金属铅的降解率。以不接种菌的培养基（含等量铅）为对照。
2.3.3 耐受铅的能力的测定
将复筛的单菌落活化，接种到铅浓度分别为10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg/mL MRS 液体培养基，36℃静置培养24 h，测定活菌数。相同条件下，将活化的菌接种至不含铅的MRS液体培养基为对照，以活菌数的百分比来表示耐受铅的能力大小。
铅的耐受能力/%=添加铅的活菌数/对照的活菌数×100
2.4 产酸能力的测定
将二次活化的菌株接种2%到MRS液体培养基中，36℃静置培养24 h，每隔4 h测量菌液的pH值[14]。
2.5 耐酸及耐胆盐能力的测定
为了在体外模拟小肠环境，对筛选的菌株进行耐酸和耐胆盐试验，参照Liong和郭翔等方法[15-16]。
2.6 筛选菌株的生化鉴定
对筛选出降解铅的能力较强的乳酸菌进行形态学观察及生化鉴定[17]。
2.7 16SrDNA分子鉴定
将筛选出的乳酸菌提取基因组DNA，具体方法参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书。以提取的基因组DNA为模板，设计通用引物进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，再将扩增产物进行测序。测序完成后，进行序列的同源性比对，再结合生化鉴定结果进一步确定菌种。
2.8 数据处理
本文采用Microsoft Excel 2016和IBM SPSS Statis－tics 19进行结果处理及统计分析。
3 结果与分析
3.1 平板初筛
平板初筛3次，划线分离获得纯的菌株44株，编号分别为PC1～PC44，革兰氏染色结果显示所有菌株都是革兰氏阳性（G+），短杆状或中长杆状，接触酶试验初步判定所有菌株都是乳酸菌。
3.2 降解铅的能力的菌株复筛
3.2.1 铅的标准曲线
在283.3 nm波长处，利用火焰原子分光光度法测定配好的铅的标准系列，以铅的标准浓度作为横坐标，吸光度作为纵坐标绘制标准曲线，见图1。
图1 铅的标准曲线
Fig.1 Lead standard curve
绘制标准曲线的回归方程为y=0.014 1x-0.000 1，拟合度R2=0.999 8，其中y为283.3 nm波长下的吸光值，x为铅的浓度（μg/mL）。
3.2.2 降解铅的能力的复筛结果
将初筛所得44株菌根据2.3.2所述的方法进行复筛，比较分析各株乳酸菌降解铅的能力，选择降解率在8%以上的进行分析，如表1所示。
表1 乳酸菌对铅的降解率
Table 1 The degradation rate of lead by lactic acid bacterias
注：小写字母指同个指标下数据间显著性差异（p＜0.05），n=3。
菌株编号 铅的降解率/% 菌株编号 铅的降解率/%P C 1 9.4 5±0.2 0 ab P C 3 1 2 2.3 8±0.8 8 d P C 2 1 0.2 4±1.0 1 bc P C 3 5 1 1.4 5±0.7 7 c P C 1 1 8.3 7±0.2 6 a P C 3 7 1 0.3 3±0.0 8 bc P C 1 2 2 7.6 7±0.6 9 e P C 3 8 1 0.2 0±0.2 5 bc P C 3 0 9.2 3±0.0 3 ab
表1显示出筛选出来对铅的降解率在8%以上的9株乳酸菌各自的降解率，其中PC12具有最高的降解能力，达到27.67%，其次是菌株PC31，具有22.38%的降解率。降解率在10%以上的6株乳酸菌分别为：PC2、PC12、PC31、PC35、PC37、PC38，由此可见，复筛的乳酸菌都有降解重金属铅的能力。
3.2.3 耐受铅的能力的测定结果
将复筛的降解铅的能力最强的PC12和PC31进行耐受铅的能力的测定，以不同铅浓度为横坐标，以活菌数的百分比为纵坐标来表示耐受铅的能力大小，如图2所示。
图2 PC12和PC31菌株耐受铅能力
Fig.2 The tolerance of strain PC12 and PC31 to lead
由图2可见，筛选出降解铅的能力较强的两株乳酸菌PC12和PC31都能耐受高浓度的铅，其中PC12在含有相同铅浓度的MRS培养基中活菌数更多，耐受能力相比PC31略强。
3.3 产酸能力的测定结果
将筛选所得降解铅的能力最强的PC12和PC31进行产酸能力的测定，其结果如图3。
图3 PC12和PC31菌株的产酸能力
Fig.3 The acid production capacity of PC12 and PC31
由图3可以看出，复筛的PC12和PC31两株乳酸菌在0～12 h期间的pH值下降较为明显，PC12从初始的6.20下降到4.36，PC31从初始的6.20下降到4.53，这时菌株处于对数生长期，产酸速度较快。PC12和PC31在12 h至16 h期间，pH值下降缓慢，16 h之后，PC12和PC31的pH值基本稳定在3.95～4.15，菌株处于生长的稳定期，产酸能力较慢。总体来看，菌株PC12相比PC31产酸能力略强。
3.4 耐酸和耐胆盐能力
3.4.1 筛选菌株的耐酸性
将筛选的两株乳酸菌接种在pH 2和pH 3的酸性环境中，36℃静置培养24 h，根据乳酸菌的存活率测定出耐酸能力的强弱，PC12和PC31两株菌的耐酸性强弱见表2。
表2 PC12和PC31的耐酸能力
Table 2 The acid resistance of PC12 and PC31
菌株编号 存活率/%p H 2 p H 3 P C 1 2 7 6.5 0±0.6 5 8 7.8 7±0.3 7 P C 3 1 7 1.3 7±0.4 5 8 3.3 7±0.5 6
由表2可以看出，从泡菜中筛选所得的两株乳酸菌PC12和PC31在强酸性环境中依然可以较好生存，其中PC12相比PC31在强酸性的环境存活率略高，这与PC12产酸能力略强存在一定的关系。PC12和PC31菌株分别在pH2环境中的存活率低于pH3环境，在一定程度上，酸性越强也会抑制乳酸菌自身的生长。
3.4.2 筛选菌株的耐胆盐能力
将筛选出的两株乳酸菌PC12和PC31分别进行耐胆盐的测定，筛选出降解PC12和PC31耐胆盐能力的强弱见表3。
表3 筛选菌株的耐胆盐能力
Table 3 The bile salt tolerance of screening strains
菌株编号 A 600达到0.3所需时间/h 迟滞期时间/h M R S 0.3%胆盐的M R S P C 1 2 3.7 8 3.5 4 -0.2 4 P C 3 1 4.1 2 4.2 0 0.0 8
筛选所得的两株菌PC12和PC31在MRS培养基和添加了0.3%胆盐的MRS养基中生长速度相近。当A600达到0.3，PC12在MRS培养基中生长所需时间为3.78 h，在含0.3%胆盐的MRS培养基中所需时间为3.54 h，比MRS快0.24 h，表明添加0.3%胆盐对PC12生长没有抑制作用，并且有一定的促进作用。PC31在MRS培养基中所需时间为4.12 h，在0.3%胆盐的MRS中所需4.20 h，比MRS培养基慢0.08 h，表明胆盐对PC31生长有一定的抑制作用。
3.5 目标菌株的鉴定
综合降解铅的能力、产酸能力以及耐酸和耐胆盐能力强弱，将筛选所得PC12菌株作为目标菌株进行鉴定。
3.5.1 目标菌株的形态学特征
对PC12进行形态学特征观察，菌落表面微微凸起、湿润、边缘光滑整齐，革兰氏染色显示成阳性，短杆状，多数成对出现，结果见图4。
3.5.2 目标菌株的生化鉴定结果
对筛选所得目标菌株PC12进行生化鉴定，其结果如表4所示。
图4 PC12的平板划线及革兰氏染色
Fig.4 The plate streaking and gram staining of PC12
表4 PC12生化鉴定结果
Table 4 The biochemical identification results of PC12
注：“+”表示阳性；“-”表示阴性。
检测项目 结果 检测项目 结果乳糖 + 木糖 +麦芽糖 + 木聚糖 -甘露糖 + 山梨糖醇 +鼠李糖 - 葡萄糖产气 -葡萄糖 + 产H 2 S -果糖 + 甲基红试验 +海藻糖 + 吲哚试验 +蔗糖 + V-P试验 +
对PC12进行一系列生理生化试验，结果表明与《常见细菌系统鉴定手册》以及乳酸菌分类鉴定及方法对照，初步判定该菌株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。
3.5.3 16SrDNA分子鉴定
以目标菌株PC12的DNA为模板，以细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增，扩增产物的测序结果在GenBank数据库中进行BLAST序列比对，显示与植物乳杆菌Lactobacillus plantarum同源性高达99%，确定该菌株为植物乳杆菌。
4 结论与讨论
本研究以南充的本地泡菜为材料，平板涂布法初筛获得44株乳酸菌，以降解重金属铅的能力大小为复筛指标，获得两株降解铅的能力较高的PC12和PC31，综合耐受铅的能力测定、产酸能力、耐酸和耐胆盐能力测定，选择PC12作为目标菌株进行生化以及16SrDNA分子鉴定，确定该菌株为植物乳杆菌。
研究表明，乳酸菌降解重金属的机理主要是吸附作用，本研究选择降解重金属铅的能力作为复筛因子，选择的是在MRS培养基中添加的Pb2+标准溶液，筛选菌株的生长环境相对简单，降解效率可能会与复杂环境下有一定差异。对复筛的两株菌PC12和PC31进行耐受铅的能力测试、产酸能力、耐酸和耐胆盐能力测试，结果显示，其耐受铅的能力依然相差不大，但是其产酸、耐酸和耐胆盐显示出明显的差异。菌株PC12均比PC31性能强，不同的菌株之间，其生理功能存在差异主要源于基因组水平存在差异[18]。
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