赭曲霉毒素（ochratoxin）是由很多曲霉属和青霉属真菌产生的次级代谢产物[1-3]，其具有肾毒性、肝毒性、致癌性、致畸性和免疫抑制作用，会对人类健康造成严重危害，其中毒性最强的赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）已被证明在肾脏和肝脏中具有致癌性[4-6]。国际癌症研究机构和世界卫生组织将其归类为2B类致癌物[7]。OTA会污染多种食品，在谷物、葡萄酒、咖啡豆、豆类、香料、肉类和奶酪产品以及其他饮料（例如啤酒）中都检测到了OTA的存在[8-11]。这不仅造成巨大的经济损失，也对人类健康造成威胁。因此需要研究制定有效的防治措施，最大程度地降低毒素合成，保护人类健康。
黑曲霉（Aspergillus niger）是自然界中广泛存在的一种曲霉属真菌，通常被认为是安全的（generally recognized as safe，GRAS）[12]，是工业生产中使用的最重要的真菌之一，被广泛用于胞外酶、有机酸等工业生产中[13-15]，同时也被用作异源蛋白质和次级代谢产物的转化宿主[14，16-17]。然而Abarca等发现某些黑曲霉菌株能够产生致癌的真菌毒素赭曲霉毒素A[18]。近年来，研究人员陆续在樱桃、咖啡豆、葡萄、腌肉制品、饲料和多种谷物中发现了一些可以产生OTA的黑曲霉[19]。这不仅影响了黑曲霉的工业应用，也加深了黑曲霉污染农产品的危害。因此，迫切需要有效的策略来预防黑曲霉感染和霉菌毒素的产生。
目前已有大量的研究致力于阐明OTA的生物合成途径及其分子的调控机制。然而OTA生物合成基因簇的边界和组成仍然没有完全确定，其具体的合成机制尚不清楚[20]。OTA作为一种次级代谢产物，除了会受到簇内特异性调控因子调控，还受簇外的全局调控因子调控。veA是在构巢曲霉中被发现的一种全局调控因子[21]，后来，在多种真菌中鉴定了veA直系同源物，并证明其在真菌发育和次级代谢中起重要作用。Crespo-Sempere A等发现veA可以在碳黑曲霉中调控OTA产生，本课题组前期研究发现在黑曲霉中veA基因的缺失几乎消除了OTA的产生 [22-23]。本研究以产OTA的黑曲霉CICC 41702为出发菌株构建黑曲霉veA过表达菌株，揭示过表达veA基因对黑曲霉生长发育和OTA生物合成的影响，为赭曲霉毒素基因簇的鉴定提供理论依据，并为有效地控制黑曲霉产毒污染提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌株和质粒
赭曲霉毒素产生菌黑曲霉 CICC 41702（Aspergillus niger CICC 41702）、 大 肠 杆 菌 DH5α（Escherichia coli DH5α）、根癌农杆菌 AGL1（Agrobacterium tumefaciens AGL1）及双元穿梭质粒p44：天津科技大学生化过程与技术实验室保存；veA基因过表达质粒p44-OE：：veA、OE：：veA 突变株：天津科技大学生化过程与技术实验构建。
1.1.2 试剂
限制性内切酶 Pst I和EcoR-I、TaKaRaTaq酶、PrimeSTARMaxPremix 酶、DL5000DNAMaker、DL10000 DNA Maker：TaKaRa 公司；2×Rapid Taq Master Mix、ClonExpress
Multis重组克隆试剂盒、HiScript II Q RT SuperMix for qPCR、ChamQ SYBR qPCR Master Mix：Vazyme公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒：北京索来宝生物科技有限公司；化学试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基
大肠杆菌和农杆菌培养所用的培养基为细菌培养基LB（lysogeny broth），黑曲霉培养过程中用到的培养基包括：完全培养基CM（complete medium）和察氏培养基CYA（czapek yeast exatract），具体配置方法参照文献[24]。
1.1.4 仪器与设备
HPLC-FLD 1200：德国安捷伦公司；LDZX-50FB立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；PCR基因扩增仪：美国BIO-RAD公司；LRH-250-A生化培养箱：韶关市泰宏医疗器械有限公司；AQ-C18色谱柱：日本岛津仪器有限公司；LC480Ⅱ荧光定量PCR仪：Roche公司；OLYMPUS 719068光学显微镜：OLYMPUS公司。
1.1.5 引物
研究所使用的引物如表1所示。
表1 本研究用引物
Table 1 Primers used in this study
引物序列（5'→3'）veA-F AACAATGGCCACTAGACCTCCCCTT veA-R AATTGCCCTCTTAGATGGCCGGAGATATTTTGG ku70Z-F CTATGACATGATTACGAATTCAAGTAGAATGTTAGAAACGTAGCAACCA ku70Z-R CTGGCCTCTGTAGTAGAATGTTGTGGAATCGTTTAAAG PgpdA-F GAGGTCTAGTGGCCATTGTTTAGATGTGTCTATGTGGCGG
续表1 本研究用引物
Contimue table 1 Primers used in this study
注：下划线的序列代表酶切位点。
引物序列（5'→3'）PgpdA-R GAGGTCTAGTGGCCATTGTTTAGATGTGTCTATGTGGCGG Tgla-F GGCCATCTAAGAGGGCAATTGGTTATATGATCATG Tgla-R TAACGTCGACTAGCGATTGCGCAGCAACG hyg-F GCAATCGCTAGTCGACGTTAACTGATATTGAAGGAG hyg-R CCCGCCATGCTATTTCTTTGCCCTCGGACG ku70Y-F CAAAGAAATAGCATGGCGGGATTGTTGGA ku70Y-R GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGCTGAATGCGTCCTAAATACTAACA CTCCTCAGTCCGCAACCA RT-PCRveA-R GGCATCGGCTCGTATTCA β-actin-F ACCACCGACTCCCTACTA β-actin-R AGTCAAGAGAGAGATGGGAT RT-PCRveA-F
1.2 veA基因的克隆与序列分析
参考国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI） 公 布 的 黑 曲 霉CBS513.88中veA的基因序列（编号：XP-001392627.1），设计引物veA-F/veA-R，以黑曲霉CICC 41702基因组为模板，进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增以获得veA基因。PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，60.8℃30s，72℃110 s，30 个循环；72 ℃10 min。利用1%琼脂糖凝电泳检测PCR产物，切胶回收纯化后的DNA片段送至金维智测序公司进行测序，将测序结果与NCBI上公布的序列进行比对。并利用DNAMAN软件进行氨基酸序列比对，并在网站https：//web.expasy.org/protparam/上推算该蛋白的等电点、分子量。
1.3 OE：：veA过表达菌株的构建
以黑曲霉CICC 41702基因组为模板，利用引物veA-F/veA-R扩增veA基因；利用引物ku70Z-F/ku70Z-R及ku70Y-F/ku70Y-R分别扩增ku70基因的同源左右臂，将同源左右臂分别命名为HR1和HR2；利用引物PgpdA-F/PgpdA-R扩增PgpdA启动子、利用引物Tgla-F/Tgla-R扩增Tgla终止子；以实验室保存的p44质粒为模板，利用引物hyg-F/hyg-R扩增hyg。回收纯化后所得 veA、HR1、HR2、PgpdA、Tgla、hyg 片段，通过融合PCR的方法，利用引物PgpdA-F/veA-R将PgpdA、veA片段融合成单条片段PgpdA-veA，先利用EcoR I和Pst I双酶切P44质粒，再利用ClonExpress
Multis多片段拼接无缝克隆技术将HR1、HR2、PgpdA-veA、Tgla、hyg连接至质粒p44，从而获得完成最终质粒p44-OE：：veA的构建（图1）。将过表达质粒p44-OE：：veA通过电转化的方法，导入根癌农杆菌AGL1中，利用含有p44-OE：：veA质粒根癌农杆菌AGL1侵染黑曲霉，提取黑曲霉转化子基因组进行PCR验证，筛选出在ku70基因处过表达veA基因的黑曲霉转化子。过表达veA基因的流程图如图2所示。
图1 p44-OE：：veA质粒图谱
Fig.1 Vector map of p44-OE：：veA
图2 veA基因在ku70处过表达流程图
Fig.2 The schematic of veA gene overexpression at ku70 gene in A.niger
1.4 实时荧光定量PCR测定veA基因表达量变化
采用实时荧光定量PCR技术，利用引物RTPCRveA-F/RT-PCRveA-R，检测出发菌株与 OE：：veA突变株在CYA液体培养基中生长到第3天时veA基因的相对表达量，并以β-actin基因（引物β-actin-F/β-actin-R）作为内参基因。具体操作过程参考本课题组之前的方法[23]。
1.5 出发菌株与OE：：veA突变株菌落形态、菌丝形态及生长速率的差异
取 1 μL（1×107个/mL）出发菌株与 OE：：veA 突变菌株的孢子悬液接种到CYA平板中央，各3组平行，25℃培养7 d，每隔24 h观察菌落形态并测量菌落的直径。将孢悬稀释到106个/mL，分别吸取5 μL孢悬至玻璃片与CYA培养基的缝隙中，培养48 h，各3个平行，至长出菌丝，随后将玻璃片取出置于载玻片上用光学显微镜观察菌丝形态。
1.6 出发菌株与OE：：veA突变株产赭曲霉毒素含量的比对
分别吸取1 mL（1×107个/mL）混匀的黑曲霉出发菌株与OE：：veA突变株的孢子悬液，分别接种到100mL CYA液体培养基中，各做3个平行，25℃避光静置培养，吸取适量的培养液用孔径为0.22 μm有机滤膜过滤，并利用高效液相色谱荧光检测器（high-performance liquid chromatography with fluorescence detection，HPLC-FLD）检测赭曲霉毒素，检测条件：KromstarTM HPLC 反相C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；激发波长：333 nm，发射波长：460 nm；流动相乙腈∶水∶醋酸=99∶99 ∶2（体积比）；流速：1.0 mL/min，进样量为 20 μL。
1.7 数据处理
单因素试验数据测定3次，以均值±标准差方式表示，采用Excel 2003软件处理及分析。
2 结果与分析
2.1 veA基因的克隆及序列分析
以黑曲霉出发菌株CICC 41702基因组为模板，用引物veA-F/veA-R，扩增veA同源基因，将其连接到pMD18-T载体上，送至金维智测序。测序结果表明该基因与NCBI公布的黑曲霉CBS513.88的veA基因序列完全相同。该基因由555个氨基酸编码组成，预测veA蛋白预测分子量为61 317.65，等电点为9.69。
2.2 OE：：veA过表达菌株的构建
以hyg（抗性基因）筛选黑曲霉转化子，从而获得含有目的片段的转化子，最终得到在ku70处过表达veA基因的菌株。使用引物ku70Z-F/ku70Y-R对转化子进行PCR验证。若黑曲霉转化子基因组上ku70左右臂之间原始片段被目的片段替换，则出发菌株和正确转化子将扩增出长度不同的单一条带。如果目的片段在基因组上随机插入，会导致转化子扩增出两条长度不同的双带（ku70基因组本身的3 884 bp条带和表达元件6 726 bp目的条带）。结果如图3所示。15号泳道为正确的阳性黑曲霉转化子，由此成功获得在ku70处过表达veA基因的菌株。
图3 黑曲霉转化子的PCR验证
Fig.3 The A.niger transformants confirmed by the PCR method
M.DL10 000 DNA marker；1.出发菌株；2.阳性对照；15.阳性转化子；3～14、16.异位插入及未插入的转化子。
2.3 出发菌株与OE：：veA突变株中veA基因表达量变化比较
利用实时荧光定量PCR的方法检测第3天即OTA刚开始生成时veA基因的相对表达量，结果如图4所示。
图4 veA基因的相对表达量
Fig.4 Relative expression of veA gene
OE：：veA菌株中veA基因的表达量是出发菌株中veA基因表达量的299%，大大提高了veA基因在黑曲霉中的表达量。证实了veA基因过表达元件已在黑曲霉中正常的进行转录，可进行下一步试验。
2.4 出发菌株与OE：：veA菌株菌落形态、菌丝形态及生长速率差异比较
出发菌株与OE：：veA菌株菌落形态、菌丝形态及生长速率差异见图5。
出发菌株与OE：：veA菌株菌落形态的生长情况结果图5A所示，出发菌株及OE：：veA菌株的菌落中间有大量棕色孢子产生，边缘菌丝呈乳黄色，菌落边缘整齐。与出发菌株相比，OE：：veA菌株的菌丝颜色变浅呈浅黄色，且菌丝有些许透明，菌落中间呈现更多褶皱。在光学显微镜下观察发现与出发菌株相比OE：：veA突变株菌丝枝节较少，菌丝长度变短且菌丝整体疏散但有更多的分生孢子头（图5B）。通过测量菌株生长过程中的菌落直径（图5C），发现出发菌株与OE：：veA菌株生长速率差别不大。
图5 出发菌株及OE：：veA菌株的表型分析
Fig.5 Phenotypic analysis of starting strain and the OE：：veA mutant strains
A.不同时间点的菌落形态；B.菌丝形态；C.生长速率。
2.5 出发菌株与OE：：veA突变株产赭曲霉毒素分析
培养5 d的出发菌株与OE：：veA突变株产赭曲霉毒素HPLC-FLD的检测见图6。
图6HPLC-FLD图
Fig.6HPLC-FLD chromatograms
A.CYA培养基对照；B.出发菌株的培养液；C.黑曲霉OE：：veA菌株的培养液。
由图6可知，出发菌株与OE：：veA菌株都可以检测到OTβ，OTα、OTB以及OTA的峰，出峰时间分别为3.567、3.884、7.149、11.340 min，与出发菌株相比，OE：：veA菌株中，OTβ，OTα、OTB以及OTA 的含量显著降低。出发菌株在培养过程中，OTA含量均持续增加，而OE：：veA菌株在培养过程中OTA含量较低且基本保持一致。在培养5、6、7 d过程中，与出发菌株对比，OE：：veA菌株 OTA含量相对减少 46%、63.33%、75.81%，呈下降趋势，结果见图7。
图7 出发菌株及OE：：veA菌株OTA生物合成变化
Fig.7 OTA biosynthesis of starting strain and OE：：veA strains
3 结论
本研究以黑曲霉CICC 41702作为出发菌株，全局调控因子veA基因作为研究对象，通过分子手段构建了过表达veA菌株OE：：veA。结果表明过表达veA基因会改变黑曲霉的菌落形态及菌丝形态。本课题组之前的研究以及Wang等的研究表明黑曲霉中的veA基因的缺失对菌丝形态也有一定程度影响[23，25]，可见veA基因对黑曲霉菌丝形态的发育至关重要。
Zhang等研究发现敲除黑曲霉中的veA基因，会消除赭曲霉毒素的积累[23]，而本研究表明过表达veA基因也会大幅度减少赭曲霉毒素的合成。因此veA基因既能正向又能负向调控赭曲霉毒素的产生，且推测veA对与OTA合成相关基因的调控作用在培养过程的后期更大。本研究为后续探究OTA生物合成途径及防治黑曲霉中OTA的合成提供了理论依据。
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