苏丹红I～IV、苏丹红G、苏丹橙G和苏丹红7B均为合成色素，既可用于石油、机油等化工产品的调色，也可用于皮革、纺织品或家具的涂染[1-2]。由于上述化合物的结构中均有偶氮结构，人体若长期接触，会对肝、肾脏器产生强烈毒性作用，并有致癌风险[3-4]，因此国内外食品安全监管部门明确要求，不允许将其作为食品添加剂使用，因此建立高效、灵敏、准确的检测方法，对相关食品的安全监管意义重大。
目前苏丹红I～IV、苏丹红G、苏丹橙G和苏丹红7B的检测方法主要有紫外分光光度法[5]、薄层色谱法[6]、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[7-8]、高效液相色谱-质谱法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS）[9-10]、气相色谱法[11]及酶联免疫检测法[12]等。其中以HPLC法和HPLC-MS/MS法应用最为常见，但高效液相色谱法的灵敏度较低，且易受共存组分的干扰，而其与质谱联用后，可克服上述缺点，具有灵敏度高、选择性强且定性与定量准确等特点，利于排除液相色谱的假阳性结果，因而利用HPLCMS/MS法检测腌制肉类食品中合成色素的研究被广泛报道[13-15]，但不同预处理样品方法对测定结果的影响，却鲜有提及。因此，本研究分别采用液液萃取-凝胶渗透色谱（liquid liquid extraction-gel permeation chromatography，LLE-GPC）法、固相萃取法（solid-phase extraction，SPE）和QuEChERS法预处理腌制肉类食品后，利用HPLC-MS/MS法测定合成色素的含量，从而为相关食品中合成色素的定量检测提供参考。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
苏丹红I、苏丹红II、苏丹红III、苏丹红IV、苏丹红G、苏丹橙G和苏丹红7B标准物质（纯度≥90.0%）：上海安谱科学仪器有限公司；腊肠：市售；甲醇、乙腈、甲酸、醋酸铵、乙酸乙酯、环己烷、正己烷、二氯甲烷均为色谱纯：德国默克公司；乙酸、无水硫酸钠均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司；硅胶（C18）填料、N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）填料、Bio-Beads S-X3填料：天津博纳艾杰尔科技有限公司；试验用水为高纯水（电阻率大于18.2 MΩ·cm）。
PL-GPC220凝胶渗透色谱仪、Agilent 1200高效液相色谱：美国安捷伦科技公司；API 4000四极杆质谱仪：美国PE公司；ME204电子天平：梅特勒-托利多公司；LG-22M高速冷冻离心机：四川蜀科仪器有限公司；FV64全自动氮吹浓缩仪：广州得泰仪器科技有限公司；FRQ-1020超声波清洗器：温州百亚超声设备有限公司；XH-D涡旋混合器上海冠森生物科技公司；HN-98IB组织匀浆机：上海达洛科学仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 标准溶液配制
1.2.1.1 混合标准储备液配制
分别准确称取苏丹红I、苏丹红II、苏丹红III、苏丹红IV、苏丹红G、苏丹橙G和苏丹红7B标准物质10.0 mg（精确至0.000 1 g），共置于100 mL容量瓶内，用乙腈稀释至刻度线定容、摇匀，即得0.1 mg/mL混合标准储备液。
1.2.1.2 混合标准溶液配制
分别精密移取上述混合标准储备液0.10、0.50、1.0、5.0、10.0 mL，置于 100 mL 容量瓶内，用乙腈稀释至刻度线定容、摇匀，配制成浓度为0.10、0.50、1.0、5.0、10.0 μg/mL的混合标准溶液，现用现配。
1.2.2 仪器工作条件
1.2.2.1 凝胶渗透色谱条件
凝胶色谱柱（400 mm×25 mm），填料为Bio-Beads S-X3（0.037 mm～0.075 mm）；淋洗液：乙酸乙酯-环己烷（1∶1，体积比）；流量：5.0 mL/min；进样体积：5 mL。
1.2.2.2 液相色谱条件
Agilent Zorbax SB C18色谱柱（100 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温为 30 ℃；流量为 1.0 mL/min；进样体积10 μL；流动相：流动相A为0.1%（体积分数）甲酸、流动相 B 为乙腈；梯度洗脱程序：0～4 min 60%B；6 min～8 min时，B线性升高至100%；10 min～12 min时B线性降低至60%后，保持8 min。
1.2.2.3 质谱条件
电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）；扫描方式为正离子扫描模式；检测方式为多反应监测模式（multi-reaction monitoring，MRM）；离子源温度600℃；气帘气流量30 L/min；雾化气流量40 L/min；辅助干燥气流量50 L/min；喷雾电压为5 200 V。
MRM监测模式下7种合成色素的特征离子及其它质谱参数见表1。
表1 7种合成色素的质谱参数
Table 1 Optimal mass parameters for the seven kinds of synthetic colorants
注：*为定量离子。
去簇电压/V苏丹红I 5.43 249.0 156.1/93.0* 29/30 80苏丹红II 12.36 277.1 156.0/121.1* 50/35 75苏丹红III 14.65 353.1 294.1/197.1* 32/30 90苏丹红IV 9.22 381.1 224.1/91.0* 27/26 100苏丹红G 3.38 279.1 156.0/123.1* 38/35 105苏丹橙G 2.55 216.0 121.1/95.0* 18/20 90苏丹红7B 16.91 380.1 169.1/183.1 35/37 100分析物 保留时间/min （m/z） 子离子（m/z） 碰撞能量/eV母离子
1.2.3 LLE-GPC法
1.2.3.1 样品制备
超市购置的腊肠食品，捣碎后混匀，置于组织匀浆机内，完全粉碎制得供试样品。
1.2.3.2 待测物提取
准确称取粉碎完全后的样品2.0g（精确至0.0001g），置于50 mL聚四氟乙烯离心管内，精密移取20 mL乙酸乙酯-环己烷（1∶1，体积比），摇匀后涡旋振荡15 min后，加入2 g无水硫酸钠，继续振荡10 min后静置至上层溶液澄清，离心7 min后（转速：4 500 r/min），吸取上清液，重复上述步骤，合并两次提取液，过0.45 μm滤膜，即得提取溶液。
1.2.3.3 GPC纯化
精密移取提取溶液10 mL，采用1.2.2.1凝胶渗透色谱条件净化1.2.3.2中提取液，收集22 min～28 min洗脱液后，于40℃氮气浓缩蒸干，残余物采用乙腈定容至1.0 mL，经0.22 μm滤膜过滤后，上样至高效液相色谱串联质谱仪中检测。
1.2.4 SPE纯化
精密移取提取溶液10 mL至活化后的Thermo SCX固相萃取柱，经50 mL正己烷淋洗去除油脂后，采用20 mL二氯甲烷洗脱，收集洗脱液，于40℃氮气浓缩蒸干，采用乙腈定容至1 mL后，过0.22 μm滤膜，待测。
1.2.5 QuEChERS法
准确称取粉碎完全后的样品2.0g（精确至0.0001g），置于50 mL聚四氟乙烯离心管内，加入20 mL乙腈-水（1∶1，体积比），涡旋振荡15 min后，加入2 g无水硫酸钠，继续振荡 10 min，离心 7 min后（转速：4 500 r/min），吸取上清液，重复上述步骤，合并两次提取液后，精密移取10 mL，加入至装有100 mg硅胶（C18）吸附剂的聚四氟乙烯离心管内，涡旋振荡5 min后，离心5 min（转速：4 500 r/min），吸取上清液，过 0.22 μm 滤膜，待测。
1.2.6 基质干扰评价
为评估不同预处理方法的试验条件对基质干扰的去除效果，在乙腈和空白腊肠中分别加入等体积1.0μg/mL的混合标准溶液，照公式：基质效应（ME/%）=|（A/B-1）｜×100，（式中：A为空白腊肠中色素的质谱响应强度；B为乙腈中色素的质谱响应强度）计算采用不同预处理方法试验条件的基质效应。参考相关文献评价标准[16]，当ME/%＜10%不存在基质干扰，10%＜ME/%＜20%时，为低程度干扰，20%＜ME/%＜50%时，为中程度干扰，ME/%＞50%时，则基质严重干扰目标化合物的测定。
2 结果与分析
2.1 不同化合物的色谱图
根据7种合成色素的特征离子，在MRM监测模式下不同化合物的总离子流图，见图1，LLE-GPC法中凝胶渗透色谱分离，见图2。
图1 7种合成色素的总离子流色谱图
Fig.1 The total ion chromatogram of seven kinds of synthetic colorants
1.苏丹橙；2.苏丹红 G；3.苏丹红 I；4.苏丹红 IV；5.苏丹红 II；6.苏丹红 III；7.苏丹红 7B（1.0 μg/mL）。
2.2 线性范围与检出限
图2 GPC纯化加标样品色谱图
Fig.2 The Gel permeation chromatogram
采用标准加入法，利用HPLC-MS/MS法测定不同质量浓度的混合标准溶液，以质谱响应强度（y）作纵坐标，7种合成色素的质量浓度为横坐标（x），绘制标准曲线，同时以3倍信噪比（S/N）为检测限，以10倍信噪比（S/N）为定量限，得到不同分析物在一定线性范围下的回归方程、相关系数及检测限与定量限，结果见表2。
2.3 LLE-GPC法条件优化
2.3.1 提取溶剂选择
提取溶剂对目标化合物的提取效率直接影响测定结果的准确度，为保证样品中目标化合物完全富集，选择不同提取溶剂，照1.2.3.2步骤，分别萃取1.2.6中样品溶液，考察正己烷、环己烷、乙酸乙酯、乙酸乙酯-环己烷（1∶1，体积比）和乙酸乙酯-正己烷（1∶1，体积比）对基质效应的影响，结果发现，不同提取溶剂的ME/%均低于10%，但考虑后续凝胶色谱净化的洗脱液为乙酸乙酯-环己烷（1∶1，体积比），因此确定乙酸乙酯-环己烷（1∶1，体积比）为提取溶剂。
表2 线性范围、线性回归方程、方法检测限与定量限
Table 2 Linear ranges，linear regression equation，limit of detection and limit of quantitation
分析物线性范围/（μg/mL）回归方程相关系数检测限/（μg/kg）定量限/（μg/kg）苏丹红I 0.1～10.0 y=41 262x+164.39 0.998 2 2.79 8.57苏丹红II 0.1～10.0 y=26 572x+123.11 0.997 4 3.51 10.84苏丹红III 0.1～10.0 y=45 724x+136.42 0.998 6 2.57 7.91苏丹红IV 0.1～10.0 y=25 396x+103.58 0.998 1 3.44 10.72苏丹红G 0.1～10.0 y=63 751x+126.83 0.999 5 1.38 4.28苏丹橙G 0.1～10.0 y=76 463x+215.42 0.998 9 0.89 2.83苏丹红7B 0.1～10.0 y=61 471x+172.46 0.999 6 1.41 4.64
2.3.2 提取次数选择
提取次数间接反映提取效率，照1.2.3.2步骤，分别考察提取次数对基质效应的影响，结果发现，样品溶液经两次提取后，对不同色素的基质效应可降低至5%以下，因此确定提取次数为两次。
2.4 SPE法条件优化
2.4.1 固相萃取柱选择
固相萃取需利用固相萃取柱选择性吸附目标化合物，经液相淋洗除杂后，再选择性洗脱待测组分，从而实现待测物的分离、净化与富集，因此选择不同类型固相萃取柱，照1.2.3.2步骤，分别处理1.2.6中样品溶液，考察 Dikma ProElut Silica、Agilent Bond Elut PSA、Thermo SCX固相萃取柱对基质效应的影响，结果见图3。
图3 固相萃取柱对基质效应的影响
Fig.3 The effect of solid phase extraction column on matrix effect
1.苏丹橙；2.苏丹红 G；3.苏丹红 I；4.苏丹红 IV；5.苏丹红 II；6.苏丹红 III；7.苏丹红 7B。
从图3可知，相较其它两种固相萃取柱，采用Thermo SCX固相萃取柱的基质效应可降低至10%以下，这归因于待测7种合成色素的化学结构中均存在苯环偶氮结构，易形成季铵盐阳离子，构成π-π共轭稳定体系，而Thermo SCX固相萃取柱的固定相为苯磺酸基，具有强阳离子交换作用[17]，因此对上述合成色素均有较好保留，从而可有效去除基质干扰，因此选择采用Thermo SCX固相萃取柱。
2.4.2 洗脱剂选择
提取溶液上样至固相萃取柱后，经正己烷洗涤去除油脂、蛋白质和非极性的杂质后，采用洗脱剂选择性洗脱待测组分，因此考察等体积的不同洗脱剂（甲醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷）对基质效应的影响，结果发现，与其它洗脱剂相比，二氯甲烷对目标化合物检测的基质效应，可降至最低，因此采用二氯甲烷作为洗脱剂。
2.5 QuEChERS法条件优化
2.5.1 提取剂选择
由于7种合成色素的水溶性较好，化学性质相近，因此分别选择等体积的不同溶剂（乙腈、乙腈-水（1∶1，体积比）、水、甲醇、甲醇-水（1∶1，体积比））作为提取剂，照1.2.5步骤，预处理1.2.6中样品溶液，考察对基质效应的影响，结果发现，当采用乙腈-水（1∶1，体积比）提取时，对7种合成色素检测的平均基质效应最低（4.7%），这可能归因于乙腈-水（1∶1，体积比）提取目标物和其它极性杂质后，加入无水硫酸钠发生盐析效应，促使乙腈与水分层，从而除去溶于水相的蛋白质、糖分等杂质[18]，因此选用乙腈-水（1∶1，体积比）作为QuEChERS法预处理的提取剂。
2.5.2 吸附剂选择
QuEChERS法常用 C18、N-丙基乙二胺（PSA）作为吸附剂，以去除提取溶剂中的糖类和蛋白质，因此分别照1.2.5步骤，预处理1.2.6中样品溶液，考察不同种类与用量的吸附剂对基质效应的影响，结果见图4。
图4 吸附剂对基质效应的影响
Fig.4 The effect of adsorbent on matrix effect
从图4可知，当吸附剂为PSA时，样品基质对合成色素检测时干扰较小，7种色素的平均基质效应为5%左右，而C18相对较高，可能归因于对部分色素具有一定吸附作用，另外随着PSA用量的增多，平均基质效应降低并不明显，因此选择100 mg PSA作为QuEChERS法预处理的吸附剂。
2.6 不同预处理方法结果的准确度与精密度
为考察3种预处理方法结果的准确度与精密度，采用回收率表示结果准确度，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）表示结果的精密度，分别照1.2.3、1.2.4和1.2.5所述步骤，预处理3个水平（0.50、1.0、5.0 μg/mL）的加标样品，进行回收试验，每个水平平行测定5次，结果见表3。
表3 不同预处理方法的测定结果回收率与相对标准偏差（n=5）
Table 3 The average recoveries and RSDs of results in different pretreatment methods（n=5）
RSD/%苏丹红I 0.5 96.1 3.9 75.9 4.2 106.7 3.4 1.0 92.8 3.2 106.2 4.0 105.4 3.1 5.0 107.4 2.8 102.5 3.8 102.3 4.2苏丹红II 0.5 102.8 4.2 86.5 3.4 93.3 3.8 1.0 97.2 4.5 104.8 3.6 103.5 4.4 5.0 93.4 3.8 97.2 4.3 94.3 3.5苏丹红III 0.5 92.6 3.6 86.4 4.0 95.2 3.7 1.0 94.3 2.7 77.6 2.8 96.7 3.1 5.0 91.5 3.5 88.3 3.4 92.2 4.0苏丹红IV 0.5 103.2 3.8 105.7 3.9 107.2 4.3 1.0 98.3 4.0 93.4 4.1 96.3 3.6 5.0 101.6 4.4 91.5 4.5 105.9 3.1苏丹红G 0.5 96.7 3.2 94.6 3.6 103.3 2.4 1.0 91.6 4.5 87.5 3.1 98.1 2.9 5.0 93.3 2.5 78.4 2.5 104.8 4.1苏丹橙G 0.5 105.6 2.1 106.5 2.2 96.6 3.0 1.0 104.5 3.9 104.6 4.1 103.1 3.3 5.0 109.2 4.4 97.4 3.2 94.2 3.8苏丹红7B 0.5 93.7 4.6 92.9 3.8 105.9 4.1 1.0 97.1 4.5 73.2 4.5 102.6 3.6 5.0 92.3 3.7 82.8 4.3 103.8 3.2分析物加标水平/（μg/kg）LLE-GPC SPE QuEChERS平均回收率/%RSD/%images/BZ_185_1825_744_1839_768.png平均回收率/%RSD/%images/BZ_185_2043_744_2057_768.png平均回收率/%
从表3可知，SPE法的不同浓度水平的平均回收率在70%～110%之间，而QuEChERS法与LLE-GPC法的不同浓度水平的平均回收率均在90%～110%之间，优于SPE法，这可能归因于提取溶液在固相萃取时，未被完全洗脱，3种方法的相对标准偏差均低于5%。与LLE-GPC法、SPE法相比，QuEChERS法的提取、除杂、纯化过程简便、快速，且无需昂贵的仪器与耗材，因而综合预处理效率较高，适于相关产品的快速检测。
3 结论
采用液液萃取-凝胶渗透色谱法、固相萃取法和QuEChERS法预处理腌制肉类食品后，利用高效液相色谱-质谱法同时测定其合成色素的含量，固相萃取法的不同浓度水平的平均回收率在80%～110%之间，而QuEChERS法与液液萃取-凝胶渗透色谱法的不同浓度水平的平均回收率均在90%～110%之间。与液液萃取-凝胶渗透色谱法、固相萃取法相较，QuEChERS法预处理样品的操作更为简便、快速，且处理成本适中，综合预处理效率较高，因此适用于腌制肉类食品中合成色素的测定。
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