香附为莎草科植物莎草（Cyperus rotundus L.）的干燥根茎[1]。常用于治疗肝郁气滞、月经不调、脾胃气滞等[2]，同时，香附又有妇科之要药的美名[3]。在临床应用非常广泛，常被制成“香砂养胃片”、“四制香附丸”、“调经益灵片”、“七制香附丸”等多种中成药，香附所治疗的疾病范围非常广泛，因此，它在中医临床理气类中药材中也经常被应用[4]。在临床应用中，香附主要行使解热、镇痛、镇静、解痉、抗菌、保护胃黏膜等作用[5]。正是由于临床应用的需要，目前市场中的香附饮片主要就是生香附和醋炙香附[6-7]。
近红外光谱是指在红外光谱范围中短波长的一类电磁波[8]，依据分子振动吸收的数据不同从而实现物质检测分析的目的[9-10]。在近红外检测范围内，药材中的物质成分都能得到大量有效的信息反馈，从整体上反映中药的化学成分的状况，对差异细微的红外光谱进行鉴别，同时傅里叶近红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）分以方便快捷，对样品无破坏性，对环境无污染，样品损耗少等优点[11-12]。近年来红外光谱分析技术在中药材的应用较为广泛[13-14]。但对于基础指标水分、灰分、浸出物的定量分析较少，本文以傅里叶变换红外光谱结合化学计量法对香附水分、灰分和浸出物进行快速测定，为药材香附质量标准的制定提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 试验材料
分别采购了15批共60个香附样品，经河南中医药大学药学院董诚明教授鉴定为莎草科植物莎草Cyperus rotundus L.的干燥根茎，详细信息见表1。
1.1.2 试剂
乙醇（分析纯）：天津致远化学试剂有限公司；甲苯（分析纯）：山东烟台双双化工有限公司。
表1 香附产地
Table 1 Cyperus rotundus place of origin
香附批次编号 产地 数量1河北 4 2安国 4 3浙江 4 4河南 4 5大别山 4 6亳州 4 7浙江 4 8河南 4 9广东 4 10 云南 4 11 山东 4 12 海南 4 13 吉林 4 14 广东 4 15 安徽 4
1.2 仪器与设备
ANTARIS II型傅立叶变换近红外光谱仪：Thermo SCIENTIFIC美国电热公司；BX-2.5-10型数显箱式电炉：上海柏欣仪器设备厂；FA2004N型电子天平：上海民桥精密科学仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 香附的处理
60个香附样品均经过打粉处理，过5号药典筛。
1.3.2 香附的水分、灰分和浸出物测定
依据2015版中国药典规定的甲苯法测定香附样品的水分含量（通则0832第四法），不超过13%。总灰分测定法测定香附样品的灰分含量（通则2302），不超过4%。醇溶性浸出物测定法（通则2201）项下的热浸法测定，含量不低于15%，用稀乙醇作溶剂。
1.4 光谱的采集
本试验运用ANTARIS II FT-NIR Analyzer对60个香附样品进行光谱采集，结果见图1。
图1 香附样品的近红外光谱
Fig.1 NIR spectra of Cyperus rotundus
将香附样品粉末均匀放置于5 cm直径采样杯中。方式为旋转采样，光谱范围为12 000 cm-1～4 000 cm-1。背景光谱扫描32次，每个样品扫描64次，扫描时间平均为60 s。试验所得样品光谱为直接去除背景的光谱。
1.5 模型的建立
1.5.1 光谱的预处理
对香附的原始光谱进行预处理，包括光谱的算法、导数、降噪、基线校正等，适宜的预处理方式会对于最终模型的精确度产生重要影响。本试验中采用二阶导数光谱（second derivative），并且选择导数滤波（norris derivative filter，ND）、卷积法（savitzky-golay，SG）和无平滑（no smoothing，NS）方法进行平滑处理。选择的光谱范围是 12 000 cm-1～4 000 cm-1。
图1中60份香附样品的近红外光谱整体趋势相同，全部样品光谱在10 000 cm-1～12 000 cm-1光谱范围中波动较大，应该是噪声所致。60个样品光谱在10 500 cm-1～8 800 cm-1范围内趋势平缓；在 8300、6800、5 600、5 200、4 700、4 400、4 300 cm-1处可见明显波峰，在 5 400、5 000、4500、4200 cm-1处可见明显波谷。
1.5.2 模型的验证与校正
本试验借助于TQ Analyst软件来进行香附快速测定模型的建立，采用定量校正算法，主要使用偏最小二乘法（partial least squares，PLS）与逐步多元线性回归法（sparse multinomial logistic regression，SMLR）。光程选择时采用多元信号修正（multiplicative signal correction，MSC）与内参考标准法（internal reference，IR），以此来减小误差，设置目标组分含量的上下限时，将下限值设置为香附样品目标组分含量最低值的95%，上限值设置为香附样品目标组分含量最高值的105%。光谱范围的选择则依据TQ Analyst软件中的suggest向导进行。
在进行光谱预处理时，本试验分别采用IR、MSC方法并以内部交叉验证模型相关系数（R2）为指标，其中模型的相关系数（R2）越接近1，说明试验所得样品的化学值与近红外模型的预测值越接近，即相关性越好，而均方根误差校正集预测均方差（root mean square error of calibration，RMSEC）与预测集预测均方差（root mean square error of prediction，RMSEP）的值越小，则说明所建模型的预测性能越好[15-16]。
2 结果与分析
2.1 香附的水分、灰分、浸出物含量
对香附的水分、灰分、浸出物含量测定结果见表2。
表2 香附的各成分含量
Table 2 Content of constituents of Cyperus rotundus
组分 最大值/% 最小值/% 平均值/%水分 13.70 6.27 9.59灰分 4.04 1.69 2.24浸出物 25.77 15.04 19.58
由表2可知，香附水分含量6.27%～13.7%，灰分含量1.69%～4.04%，浸出物含量15.04%～25.77%，所得数据均符合2015版药典规定。
2.2 香附水分、灰分、浸出物定量模型的建立
对光谱模型进行拟合，筛选出最佳模型见表3。
表3 光谱处理方法分析结果
Table 3 Analysis results of spectral treatment method
浸出物模型R2 PLS+IR+1st Der+NS 0.732 7 0.976 2 0.000 0 PLS+IR+1st Der+SG 0.699 1 0.682 9 0.000 0 PLS+IR+1st Der+ND 0.644 6 0.240 9 0.000 0 PLS+IR+2nd Der+NS 0.723 3 0.983 3 0.000 0 PLS+IR+2nd Der+SG 0.647 6 0.938 0 0.000 0 PLS+IR+2nd Der+ND 0.562 8 0.463 5 0.000 0 PLS+MSC+1st Der+NS 0.733 3 0.976 1 0.000 0 PLS+MSC+1st Der+SG 0.685 7 0.673 8 0.000 0 PLS+MSC+1st Der+ND 0.728 3 0.385 5 0.000 0光谱预处理 水分模型R2灰分模型R2
续表3 光谱处理方法分析结果
Continue table 3 Analysis results of spectral treatment method
注：1st Der表示一阶导数处理；2ndDer表示二阶导数；NS表示无平滑处理；ND表示导数滤波平滑处理；SG表示卷积法平滑处理。
浸出物模型R2 PLS+MSC+2nd Der+NS 0.716 7 0.988 4 0.000 0 PLS+MSC+2nd Der+SG 0.636 6 0.948 4 0.000 0 PLS+MSC+2nd Der+ND 0.563 5 0.484 6 0.000 0 SMLR+IR+1st Der+NS 0.887 2 0.751 7 0.690 6 SMLR+IR+1st Der+SG 0.878 5 0.733 1 0.669 3 SMLR+IR+1st Der+ND 0.888 3 0.679 8 0.581 6 SMLR+IR+2nd Der+NS 0.827 6 0.706 6 0.656 2 SMLR+IR+2nd Der+SG 0.889 0 0.752 4 0.746 3 SMLR+IR+2nd Der+ND 0.843 1 0.658 4 0.894 0 SMLR+MSC+1st Der+NS 0.899 1 0.757 9 0.666 8 SMLR+MSC+1st Der+SG 0.894 2 0.775 2 0.640 1 SMLR+MSC+1st Der+ND 0.884 3 0.782 7 0.580 1 SMLR+MSC+2nd Der+NS 0.872 5 0.720 5 0.658 2 SMLR+MSC+2nd Der+SG 0.876 7 0.804 6 0.728 7 SMLR+MSC+2nd Der+ND 0.902 7 0.819 6 0.845 9光谱预处理 水分模型R2灰分模型R2
对光谱模型进行拟合，筛选出最佳模型。其中，香附的水分模型以SMLR+MSC+2nd Der+ND模型最好，香附的灰分模型以PLS+MSC+2nd Der+NS模型最好，香附的浸出物模型以SMLR+IR+2nd Der+ND模型最好。
2.3 香附水分灰分浸出物模型
分别建立的香附水分、灰分和浸出物的预测模型，结果见表4。
随机选取建模样本为52个，验证样本8个，光谱范围为12 000 cm-1～4 000 cm-1。香附水分的预测模型精度R2=0.902 7，RMSEC=0.774，预测均方差RMSEP=0.521；香附灰分所得模型精度R2=0.988 4，RMSEC=0.061 9，RMSEP=0.058 5；香附浸出物模型中，精度R2=0.890 3，RMSEC=1.25，RMSEP=2.33。所建模型精度高，均方根误差小。
2.4 香附水分、灰分、浸出物模型对未知含量样品的预测
对香附水分、灰分、浸出物模型进行验证，结果见表5。
表4 香附模型
Table 4 Cyperus rotundus model
指标 建模 预处理 光谱范围/cm-1 相关系数（R2） 校正均方差（RMSEC） 预测均方差（RMSEP）水分 SMLR MSC+2nd Der+ND 12 000～4 000 0.902 7 0.774 0.521灰分 PLS MSC+2nd Der+NS 12 000～4 000 0.988 4 0.061 9 0.058 5浸出物 PLS IR+2nd Der+NS 12 000～4 000 0.890 3 1.25 2.33
表5 香附水分、灰分、浸出物含量的预测
Table 5 Prediction of moisture，ash and extractum content of Cyperus rotundus
序号 水分含量参考值/%预测值/% 绝对偏差/% 灰分含量参考值/%水分含量预测值/% 绝对偏差/% 浸出物含量参考值/%灰分含量 浸出物含量预测值/% 绝对偏差/%8.15 7.94 -0.21 1.89 2.52 0.63 23.39 20.84 -2.55 8 9.53 10.06 0.53 2.13 2.11 -0.02 18.77 22.97 4.20 23 10.86 11.29 0.43 2.61 2.65 0.04 17.36 20.48 3.12 24 8.77 8.98 0.21 2.05 2.35 0.30 18.89 19.84 0.95 39 8.79 8.82 0.03 2.54 2.18 -0.36 20.93 18.74 -2.19 40 11.90 10.84 -1.06 2.28 2.56 0.28 17.34 18.35 1.01 52 9.98 9.30 -0.68 2.45 2.31 -0.14 19.90 21.46 1.56 53 10.20 10.37 0.17 2.29 2.66 0.37 19.54 20.06 0.52 7
从表5中的数据可以看出，在随机挑选出的8个香附样品中，所建立的香附灰分快速测定模型在绝对偏差上是明显要低于香附水分和浸出物快速测定模型，而本身在所得3种模型的精度上就是香附灰分快速测定模型的精度最高，相关系数R2高达0.988 4，也就进一步证明了试验所得模型可以应用于香附水分、灰分、浸出物含量的快速测定，且测定精确度与相关系数R2呈正相关。将未参与建模的8个样本带入模型，回执预测值和实测值的散点图见图2～图4。检验样本集中在趋势线y=x附近，表明模型精度高，稳定性强。
图2 香附水分预测值与实测值
Fig.2 Predicted and measured values of Cyperus rotundus moisture content
Calibration为校准值；Validation为验证值；Correction为校正值；Cross-correction为交叉矫正；Ignore为忽略值。
图3 香附灰分预测值与实测值
Fig.3 Predicted and measured values of Cyperus rotundus ash content
Calibration为校准值；Validation为验证值；Correction为校正值；Cross-correction为交叉矫正；Ignore为忽略值。
图4 香附浸出物预测值与实测值
Fig.4 Predicted and measured values of Cyperus rotundus extractum content
Calibration为校准值；Validation为验证值；Correction为校正值；Cross-correction为交叉矫正；Ignore为忽略值。
3 结论与讨论
本研究利用傅里叶近红外光谱（NIRS）分析技术建立了香附水分、灰分、浸出物的快速预测模型，并应用未参与数据验证，实现了香附样品中相关指标的快速精准的测定，其中香附水分模型中，光谱预处理选择多元信号修正（MSC）+二阶导数光谱+ND，逐步多元线性回归法建模，光谱范围12 000 cm-1～4 000 cm-1。模型 R2为 0.902 7，RMSEC 为 0.774，RMSEP 为 0.521。香附灰分以偏最小二乘法建模，光谱处理包括MSC+2nd Der+NS，模型 R2为 0.988 4，RMSEC 为 0.061 9，RMSEP为0.058 5。香附浸出物模型中，光谱处理包括内参考标准法IR+2nd Der+NS，选择偏最小二乘法建模，模型 R2为 0.890 3，RMSEC为 1.25，RMSEP为2.33。其中香附灰分模型精确度较高，水分和浸出物的模型精确度略低，可能是在香附样品水分、浸出物含量测定时的误差所致。以上所得模型对于香附水分、灰分、浸出物含量的预测均有较高的精确度，可实现近红外光谱分析技术对香附水分、灰分、浸出物含量的快速测定，这为香附质量标准的制定提供理论依据。
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典-四部：2015年版分辑号：四部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：258
[2] 武玉婷.山东不同产地香附质量研究[D].济南：山东中医药大学，2012
[3](明)李时珍.本草纲目：校点本[M].北京：人民卫生出版社，2004
[4] 周根群.中药炮制和用法对药物作用的干预价值探析[J].世界最新医学信息文摘，2016，16(52)：179-181
[5] 李喆，牛莉娜.香附的炮制及临床应用研究[J].世界最新医学信息文摘，2017，17(94)：96-102
[6]中华人民共和国卫生部药政管理局.全国中药炮制规范[M].北京：人民卫生出版社，1988
[6] 中华人民共和国药政管理局.全国中药炮制规范-一九八八年版[M].北京：人民卫生出版社，1988
[7] 黄险峰，彭国平.香附的化学成分及药理研究进展[J].中药材，2003，26(1)：65-68
[8] 李文龙，瞿海斌.近红外光谱应用于中药质量控制及生产过程监控的研究进展[J].浙江大学学报：医学版，2017，46(1)：80-88
[9] 汪方舟.近红外光谱建模法在中药质检中的应用[J].山东农业大学学报：自然科学版，2018，49(5)：787-790
[10]胡晔，万茶艳，程存归.香附及其伪品天葵子的衰减全反射傅里叶变换红外光谱鉴别及聚类分析[J].中国药房，2014，25(43)：4103-4105
[11]王亚敏，张卓勇，汤彦丰，等.近红外光谱技术在中药鉴别及分析中的应用[J].首都师范大学学报：自然科学版，2004，25(3)：41-45，51
[12]范林宏，范文翔，韦志强，等.近红外光谱技术结合化学计量学在中药分析中的应用现状[J].中国实验方剂学杂志，2019，24(25)：205-210
[13]Liu H X，Sun S Q，Lv G H，et al.Study on Angelica and its different extracts by Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy[J].Spectrochimica Acta Part A：Molecular and Biomolecular Spectroscopy，2006，64(2)：321-326
[14]Yap K Y L，Chan S Y，Lim C S.Authentication of traditional Chinese medicine using infrared spectroscopy：distinguishing between ginseng and its morphological fakes[J].Journal of Biomedical Science，2007，14(2)：265-273
[15]柳艳云，胡昌勤.近红外分析中光谱波长选择方法进展与应用[J].药物分析杂志，2010，30(5)：968-975
[16]薛淑娟，陈随清，王利丽，等.基于近红外光谱法对不同商品规格地黄进行定性及定量研究[J].中华中医药杂志，2017，32(5)：2055-2059