响应面法优化超声波辅助提取橡胶籽油及其脂肪酸成分分析

橡胶籽（rubber seed）是大戟科橡胶树属橡胶树（Hevea brasiliensis）的主要副产物之一，主要种植在我国云南、海南、广西等地。云南热区是我国第二大天然橡胶种植基地，天然橡胶种植业已成为该区的支柱产业，橡胶籽资源量大，具有较高的经济开发利用价值[1-2]。橡胶籽仁含油量可高达38%～55%，是一种独特的热带木本植物油料[3]。橡胶籽油在我国有长期食用的历史，其脂肪酸不饱和度达80%以上，食用效能高，食用效能不低于花生油，并具有降血脂、降血压、预防心血管疾病和抗炎的功效[4-6]。

常用的油脂提取方法有：浸提法[7]、压榨法[8]、水酶法[9]、超声波辅助溶剂法[10]、微波辅助提取法[11]、超临界萃取法[12]等。传统的浸提法，提取时间长、能耗高、提取率低。超声波提取作为一种新型的辅助提取手段，具有环保、节能、高效等特点，已广泛应用于化学、食品等许多科学研究领域[13-14]。本研究采用响应面法优化超声波辅助溶剂法提取橡胶籽油，对其提取工艺参数进行优化。以橡胶籽仁为原料，研究不同有机溶剂对橡胶籽油的提取效果，探究料液比、超声功率、超声时间以及超声温度对橡胶籽油提取率的影响，优化提取条件，获得最佳提取工艺参数；并测定其脂肪酸组成，与传统压榨法制得的橡胶籽油脂肪酸进行比较分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

橡胶籽、橡胶籽压榨油：西双版纳华坤生物科技有限责任公司；石油醚、正己烷、95%乙醇、乙酸乙酯、乙醚、氢氧化钾、氢氧化钠（分析纯）：广东光华科技股份有限公司；反式脂肪酸甲酯混标、37种脂肪酸甲酯混合标准品：上海安谱试验科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

SB25-12DTDS超声波清洗器：宁波新艺超声设备有限公司；DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅、101-2AB型电热恒温鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；RV10旋转蒸发仪：IKA公司；5804R高速冷冻离心机：德国艾本德股份公司；TD电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司；YF-800粉碎机：浙江永历制药机械公司；GC-2010 Plus：日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 橡胶籽基本指标的测定

水分参照GB 5009.3-2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》；粗脂肪含量参照GB 5009.6-2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》；蛋白质含量参照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》。

1.3.2 橡胶籽油的提取

橡胶籽经烘干、去壳、粉碎后，过40目筛得橡胶籽粉末。称取10 g橡胶籽粉末于锥形瓶中，按比例加入提取试剂，在一定超声温度、超声功率的条件下提取一定时间，完成后冷却至室温（25℃），在10 000 r/min离心 10 min，移出上清液，回收溶剂，于（100±5）℃烘箱中干燥至恒重。按公式计算橡胶籽油的提取率。

式中：m为橡胶籽油的质量，g；M为橡胶籽仁粉的质量，g。

1.3.3 单因素试验

1.3.3.1 提取剂对橡胶籽油提取率的影响

固定超声波功率200 W，超声温度40℃，超声时间40 min，料液比 1 ∶10（g/mL），选用石油醚、乙酸乙酯、正己烷、乙醚、95%乙醇分别进行提取，计算橡胶籽油提取率，研究不同提取剂对橡胶籽油提取率的影响。

1.3.3.2 料液比对橡胶籽油提取率的影响

固定提取剂为石油醚，超声波功率200 W，超声温度 40℃，超声时间 40min，在料液比为 1∶8、1∶10、1∶12、1 ∶14、1 ∶16（g/mL）条件下分别进行试验，研究不同料液比对橡胶籽油提取率的影响。

1.3.3.3 超声功率对橡胶籽油提取率的影响

固定提取剂为石油醚，料液比 1∶12（g/mL），超声温度40℃，超声时间40 min，在超声功率为150、200、250、300、350 W条件下分别进行试验，研究不同超声功率对橡胶籽油提取率的影响。

1.3.3.4 超声时间对橡胶籽油提取率的影响

固定提取剂为石油醚，料液比 1∶12（g/mL），超声功率300 W，超声温度40℃，在超声时间为30、40、50、60、70 min条件下分别进行试验，研究不同超声时间对橡胶籽油提取率的影响。

1.3.3.5 超声温度对橡胶籽油提取率的影响

固定提取剂为石油醚，料液比 1∶12（g/mL），超声功率300 W，超声时间40 min，在超声温度为35、40、45、50、55℃的条件下分别进行试验，研究不同超声温度对橡胶籽油提取率的影响。

1.3.4 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，以橡胶籽油提取率为响应值，利用Design-Expert 8.0.6软件根据中心组合原理设计四因素三水平响应面优化试验。因素水平见表1。

1.3.5 橡胶籽油脂肪酸的测定

1.3.5.1 橡胶籽油甲酯化

参照GB/T 17376-2008《动植物油脂脂肪酸甲酯制备》对橡胶籽油进行甲酯化处理。称取橡胶籽油60 mg于具塞试管中，加入4 mL正己烷溶解试样，溶解后加入200 μL氢氧化钾-甲醇溶液，剧烈摇荡30 s后静置至澄清透明。加入1 g硫酸氢钠，剧烈摇晃1 min，静置后取上清液过滤膜，待测。

1.3.5.2 气相色谱（gas chromatography，GC）条件

氢火焰离子化（flame ionization，FID）检测器；SPTM-2560（100 m×0.25 mm×0.2 μm）弹性石英毛细管柱；升温程序：初温120℃，维持8 min，以6℃/min升至200℃，保持15 min，再以4℃/min升至220℃，保持41 min；进样口温度230℃，检测器温度280℃，柱流量：0.7 mL/min；载气：高纯氮气（N2）；分流比 50 ∶1，进样量1 μL。通过与脂肪酸标准对比定性以后，采用面积归一法计算脂肪酸相对含量。

1.3.6 橡胶籽油基本指标的测定

酸价参照GB 5009.229-2016《食品安全国家标准食品中酸价的测定》冷溶剂指示剂滴定法测定；过氧化值参照GB 5009.227-2016《食品安全国家标准食品中过氧化值的测定》滴定法测定；折光率使用WAY-2S数字阿贝折光仪进行测定；皂化值参照GB/T 5534-2008《动植物油脂皂化值的测定》测定；碘值参照GB/T 5532-2008《动植物油脂碘值的测定》测定。

1.4 数据处理

所有数据均采用3次重复试验的平均值±标准差表示。采用Origin Pro2017对试验数据进行处理、和绘图。采用SPSS20.0进行试验数据统计与分析，显著性差异采用ANOVA检验以及DUCAN分析。

2 结果与分析

2.1 橡胶籽成分的测定

对橡胶籽的理化指标进行测定，其测定结果如表2所示。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 提取剂对橡胶籽油提取率的影响

不同溶剂对橡胶籽油提取率的影响见图1。

由图1可知，用5种不同有机溶剂提取橡胶籽油时，乙酸乙酯和正己烷之间无显著性差异，其余两两比较均存在显著性。提取率从高到低的顺序为：石油醚＞乙酸乙酯＞正己烷＞乙醚＞95%乙醇；石油醚的提取率最高，可达（35.87±0.67）%；故选用石油醚作为提取剂。

2.2.2 料液比对橡胶籽油提取率的影响

料液比对橡胶籽油提取率的影响见图2。

由图2可知，随着溶剂的增加，橡胶籽油提取率呈现先增加后缓慢减小的趋势。这是因为橡胶籽仁粉末质量一定，当溶剂较少时，橡胶籽油分散在溶剂中的浓度较高，抑制了油脂的浸出速率；随着溶剂的增加，橡胶籽油分散在溶剂中浓度降低，在一定时间内增加了橡胶籽油的溶出率[15]。当料液比增加到1∶12（g/mL）时，提取率达到最大，此时大部分油脂已被提出，继续增加溶剂质量，提取率略微下降。溶剂用量越大，成本越高。

2.2.3 超声功率对橡胶籽油提取率的影响

超声功率对橡胶籽油提取率的影响见图3。

由图3可知，当超声波功率在150 W～300 W时，橡胶籽油的提取率随超声波功率的增加而增大；这是因为超声波具有破碎细胞壁的作用，随着超声波的增加，破壁作用在加快，同时物质的运动速度也在加快，使得溶剂与底物充分发生接触、碰撞，加快了反应速率，从而提高了油脂提取率。在超声波功率为300 W时，橡胶籽油提取率最高。

2.2.4 超声时间对橡胶籽油提取率的影响

超声时间对橡胶籽油提取率的影响见图4。

由图4可知，当提取时间较短时，油脂提取不充分，导致提取率较低。随着超声时间的延长，橡胶籽油提取率增加，在超过40 min，提取率开始趋于稳定，并有略微下降的趋势。可能是超声时间过长破坏了橡胶籽油中某些成分的结构，导致提取率下降。

2.2.5 超声温度对橡胶籽油提取率的影响

超声温度对橡胶籽油提取率的影响见图5。

由图5可知，在超声温度35℃～45℃时，橡胶籽油提取率随着提取温度的增加而增加；在超声温度为45℃时，橡胶籽油的提取率最高；当超声温度45℃～55℃时，提取率迅速下降后趋于平稳，这可能是温度较高，石油醚在超声波作用下，挥发速率加快，导致提取率也随之快速下降；但由于超声温度未达到石油醚的沸点，挥发一定量后，开始趋于稳定。

2.3 响应面法优化橡胶籽油提取试验

2.3.1 响应面法试验设计及结果

在单因素试验的基础上，根据响应面法中心旋转组合试验设计原理对工艺进行优化，选取料液比（A）、超声功率（B）、超声时间（C）、超声温度（D）为响应面变量，以橡胶籽油提取率为响应值，设计响应面优化试验，用Design-Expert 8.0.6软件进行数据处理和分析，通过橡胶籽油浸提条件的优化，确定最佳浸提方案。响应面试验方案及结果见表3。

2.3.2 模拟回归模型的建立及显著性检验

回归模型方差分析及显著性检查见表4。

对数据进行二次多元回归拟合，得到橡胶籽油提取率（Y）与料液比（A）、超声功率（B）、超声时间（C）、超声温度（D）的二次多项回归方程分别为：

由表4对模型进行的方差分析结果可以看出，试验模型是显著的（p＜0.000 1），失拟项p值为0.054 1不显著，因变量与所有自变量之间的线性关系显著（R2=0.908 9），说明该方程的拟合度较好，表明回归模型达到极显著，可以反映提取率和各因素之间的关系，试验误差小，试验预测数据具有良好的可靠性，故可以用该模型对橡胶籽油的提取试验进行预测和分析。

概率值p＜0.05即为显著项，由此可以看出A、C、A2、B2、C2、D2为显著项；其余都不显著；根据 F 数值越大，影响的效果越显著，各因素对橡胶籽油提取率的影响程度的强弱顺序为：C（超声时间）＞A（料液比）＞B（超声功率）＞D（超声温度）。

因素交互作用的响应面图见图6。

由图6可知，各个试验影响因素构成的都是呈开口向下，中心部分向上凸起的响应曲面图，曲面中存在最高点且在试验设计的范围以内[16]。从图中可以看出料液比（A）、超声功率（B）、超声时间（C）、超声温度（D）各影响因素之间的交互作用不显著；响应曲面的陡峭程度表示各个因素的影响程度，曲面越陡峭影响越大，反之亦然；等高线可以直观反映变量的交互作用，形成椭圆形则表示交互作用强，圆形则表示交互作用弱[17]。

试验得出橡胶籽油最佳提取条件为：料液比1∶12.44（g/mL）、超声功率 306.14W、超声时间 46.90min、超声温度45.68℃、在此条件下橡胶籽油提取率预测值为42.83%。根据试验可操作性，将试验条件微调为：料液比 1 ∶12.4（g/mL）、超声功率 306 W、超声时间47 min、超声温度45.7℃，进一步进行验证试验。

试验得出橡胶籽油提取率42.80%与预测值42.83%相比，相对误差为0.07%，两者误差吻合度较好。因此，响应面法优化得到的橡胶籽油提取工艺条件准确可靠。

2.4 橡胶籽油脂肪酸组成

橡胶籽油脂肪酸组成见表5。

由表5可知，超声波辅助溶剂法提取的橡胶籽油共检测出5种脂肪酸，分别是棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和α-亚麻酸，其中亚油酸含量最高，达到（36.571±0.129）%。亚油酸是n-6型PUFA，是一种人体必需脂肪酸，研究表明，亚油酸有抑制胆固醇合成、抗氧化、预防糖尿病、调节身体机能和维持健康的作用[18]。采用压榨法获得的橡胶籽毛油共检测出15种脂肪酸，其中有7种SFA（豆蔻酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸、木焦油酸），有4种MUFA（棕榈-烯酸、十七碳烯酸、油酸、花生烯酸），有4种PUFA（亚油酸、γ-亚麻酸、α-亚麻酸、二十碳四烯酸），但主要是由油酸、亚油酸、α-亚麻酸、棕榈酸和硬脂酸组成，其他10种脂肪酸含量均小于1%。橡胶籽油中含有80%左右的不饱和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA），其中多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）达到57%以上。UFA是人体必需的脂肪酸，根据双键个数的不同，分为MUFA和PUFA[19]。PUFA指含有两个或两个以上双键且碳链长度为18～22个碳原子的直链脂肪酸，比其他植物油脂或脂肪酸反应更灵活，可作为制作环氧化脂肪酸的原料[20]。UFA中含有大量的双键，可通过加氢、环氧化等加成反应等化学修饰而得到性能优异生物基的化学中间体和化学品，橡胶籽油中含有80%左右的不饱和脂肪酸，可用作为极佳的化工原料[21]。UFA对心脑血管有调节和保护的作用，表现在调节机体的血脂水平、调节糖代谢的途径、调节血压平衡等作用[22]。在脂肪酸评价中，PUFA与SFA比值是一个重要的指标，研究表明，PUFA与SFA比值大于2时，植物油才具有明显降血脂的功能，比值越大时，降血脂效果越显著。橡胶籽油PUFA与SFA比值可达到3∶1，研究结果表明，长期食用橡胶籽油对机体没有不良影响，具有能降低血脂的功效，且具有食用和医用价值[23]。

相同的橡胶籽原料，通过压榨法获得的橡胶籽油检测出15种脂肪酸，而超声辅助溶剂法提取的橡胶籽油只检测出5种脂肪酸；橡胶籽油中主要的脂肪酸是棕榈酸、油酸、亚油酸和α-亚麻酸，质量分数从高到低是：亚油酸＞油酸＞α-亚麻酸＞棕榈酸＞硬脂酸。多检出的10种脂肪酸，总含量为1.207%；其中含量最高的是山萮酸，质量分数为（0.325±0.375）%，含量相对较低。两种方法提取的橡胶籽油脂肪酸种类上存在明显差异，可能是因为超声波辅助溶剂法在提取过程中，原料与溶剂在恒温条件下长时间直接接触，可能导致游离脂肪酸的形成[24]，后期旋转蒸发脱除溶剂的过程中又二次加热，且在（100±5）℃烘箱中干燥至恒重的过程中，高温条件下与空气直接接触发生氧化反应，会致使少量的脂肪酸挥发。直接压榨法在对原料进行处理后，通过螺旋杆挤压出油，提取工艺简单、压榨时间短，能较大程度的提取出橡胶籽里的油脂，提取率较高；超声波辅助溶剂法提取，由于橡胶籽原料粗脂肪含量较高，不能进行超微粉碎，粉碎后过40目筛，提取程度不完全，也可能是造成脂肪酸种类差异的原因。超声波辅助溶剂法提取的橡胶籽油脂肪酸质量分数略高于压榨法，分别为87.927%和86.431%，变异系数1.21%，无显著性差异。

2.5 橡胶籽油基本性质测定

橡胶籽油主要理化指标见表6。

超声波辅助溶剂法提取的橡胶籽油，颜色为浅黄色，澄清透亮；压榨法制得的橡胶籽油，颜色较深为黄褐色。油脂的理化指标是衡量油脂质量好坏的重要指标，分别对两种方法制备的橡胶籽油进行了测定，结果表明橡胶籽油的折光指数无显著差异；超声波辅助溶剂法提取的橡胶籽油在酸价、过氧化值、皂化值和碘值的结果均比压榨法制备的橡胶籽油高。过氧化值表示油脂和脂肪酸等被氧化的程度，数值越高，油脂质量越差；通过压榨法制备的橡胶籽油的过氧化值明显比超声波辅助溶剂法制备的高，对油脂质量破坏程度较高。

3 结论

干燥的橡胶籽粗脂肪含量达（53.99±0.81）%，本研究采用超声波辅助溶剂法提取橡胶籽油，在单因素试验基础上，通过响应面优化提取工艺参数，研究结果表明石油醚作为溶剂提取效果最好，在料液比1 ∶12.4（g/mL）、超声功率 306 W、超声时间 47 min、超声温度45.7℃条件下，实际橡胶籽油提取率可达42.8%。采用超声波辅助溶剂法提取的橡胶籽油检测出5种脂肪酸，采用直接压榨法获得的橡胶籽油共检测出15种脂肪酸，两种方法制得的橡胶籽油主要都是由棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和α-亚麻酸脂肪酸组成，质量分数总和达到87%左右，两种制备橡胶籽油的方法所测定的脂肪酸总量上并无显著差异。通过测定橡胶籽油的酸价、过氧化值等理化指标，结果表明压榨法制备橡胶籽油，质量上破坏较大；橡胶籽油需进行精炼改善其理化指标，以达到食用植物油国家标准。橡胶籽油含有80%左右的不饱和脂肪酸，具有降血脂、降血糖的功效，是一种优质的食用油。

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