玉米须（Stigma maydis）是禾本科作物玉米的干燥花柱和柱头，是我国传统中药材，具有利尿、消肿、降压、止血等功效。玉米在我国各地均有种植，产量极高，2019年全国玉米产量达到26 077万吨，其中玉米须占玉米产量的5%。玉米须中含有多种生物活性成分，如黄酮类、多糖类、氨基酸类、挥发性成分、有机酸、生物碱等，其药用价值和保健功能较高[1]。Deng等发现，玉米须多糖可以有效降低高血脂症小鼠体内总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇的含量[2]；宋有洪等从玉米须的生物活性成分和药理保健功能进行综合论述，阐明玉米须应用前景广阔，应加大其高附加值研发力度[3]。
牛蒡（Arctium lappa Linn）为菊科牛蒡属植物，药食同源，含有菊糖、绿原酸、咖啡酸、芦丁、槲皮素、槲皮苷等多种功能性成分[4-5]，具有降血脂、降血糖、降血压、消炎、防癌等功效[6-8]。已有部分研究者利用牛蒡的保健功能进行了产品研制，如牛蒡茶、牛蒡酸奶、牛蒡饮料等，并不断有新的产品被开发研究，未来市场发展趋势良好[9-11]。
植物复合饮料常会因果胶及蛋白质等大分子物质而出现浑浊、产生沉淀的现象。为解决这类问题，生产过程中一般添加果胶酶或纤维素酶进行过滤澄清处理，以改善饮料的稳定性[12-13]。但这类游离酶制剂存在难回收、易失活、成本高的问题，而固定化酶因可以反复使用、稳定性高逐渐受到关注[14-15]。
目前，对以玉米须和牛蒡为原料的产品研发类型较多，但将两者复合研究尚属空白，且原料浸提液的制备多以感官评价为指标，标准单一，没有考虑两者包含的生物活性成分的提取效果。有研究证明，玉米须和牛蒡含有大量黄酮，抗氧化活性较高，应用价值较高[16-17]。本试验以玉米须和牛蒡为原料，以黄酮含量为浸提液制备条件选择依据研制复合饮料。以壳聚糖固定化复合酶为澄清剂，研究其在玉米须牛蒡复合饮料中的澄清效果，评价其多次使用操作稳定性。通过降低产品生产成本，加快玉米须和牛蒡加工产业链的升级，充分利用产量优势，推动农产品产业持续健康发展。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
牛蒡干：市售；成熟玉米须：徐州市区菜场，清洗、晾干，粉碎，过40目筛。
维生素C、柠檬酸、白砂糖均为食品级：浙江一诺生物科技有限公司；果胶酶（酶活20 U/mg）、纤维素酶（酶活50 U/mg）、壳聚糖（分析纯）、DPPH（分析纯）、芦丁标准品（纯度≥98%）、葡萄糖标准品（纯度≥98%）：美国Sigma公司；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇、硫酸、蒽酮等（均为分析纯）：南京化学试剂有限公司。
FA1004电子天平：常熟市百灵天平仪器有限公司；JYL-C012九阳料理机：九阳股份有限公司；UV-7504紫外可见分光光度计：上海欣茂仪器有限公司；HH型恒温水浴锅：江苏金坛钟大仪器厂。
1.2 试验方法
1.2.1 壳聚糖固定化复合酶的制备
参考颉向红等的方法，并做适当修改[15，18]。取1 g壳聚糖溶解于100 mL 1%冰醋酸溶液中，搅拌均匀，用注射器滴入10%氢氧化钠-乙醇溶液，加入少许5%戊二醛，得到壳聚糖微球。按复合酶（纤维素酶与果胶酶质量比为1∶2）∶壳聚糖质量比为1∶10的比例混合，在80 r/min转速下振荡1 h，4℃条件下固定6 h，用蒸馏水清洗过滤，即得到壳聚糖固定化复合酶。
1.2.2 黄酮含量的测定
参考方敏等的方法，并作适当修改[19]。准确称取20 mg干燥至恒重的芦丁标准品，用95%乙醇溶解，并定容到50 mL，充分混匀后得到0.4 mg/mL的芦丁标准溶液。分别吸取 0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0 mL芦丁标准溶液于50 mL容量瓶中，加入95%乙醇溶液12 mL，5%亚硝酸钠溶液2 mL，混匀后静置6 min，加入10%硝酸铝溶液2 mL，混匀、静置6 min，加入10%氢氧化钠溶液20 mL，定容至50 mL。静置15 min后，以空白试剂做参比，在510 nm波长处测定其吸光度。以吸光度为纵坐标，芦丁标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。取适当量的样液按上述方法操作，于510 nm波长处测定吸光度，计算样液中黄酮含量。
1.2.3 多糖含量的测定
参考惠秋沙的方法，并作适当修改[20]。准确称取100 mg干燥至恒重的葡萄糖标准品，蒸馏水溶解并定容至100 mL，充分混匀后得到1.00 mg/mL葡萄糖标准溶液。分别吸取 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 葡萄糖标准溶液置于25 mL容量瓶中。加硫酸蒽酮溶液定容至刻度线。沸水浴15 min，冷却后于625 nm波长处测定其吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。
取适量玉米须复合饮料溶液，置离心管中3 000 r/min的转速离心10 min，精密量取10 mL，加入无水乙醇40 mL，静置过夜。抽滤，按顺序加入无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤沉淀。将带粗多糖的滤纸于烘箱中烘干后置于60 mL热水中溶解趁热抽滤。滤液用蒸馏水定容至100 mL，摇匀。按照测定标准曲线的方法操作测定625 nm波长处其吸光度，计算饮料中多糖含量。
1.2.4饮料工艺流程
1.2.5 主要工艺要点
1.2.5.1 玉米须浸提液的制备
1）单因素试验
称取粉碎后的玉米须10 g，以水做提取剂，按照1.2.2测定浸提液中黄酮的吸光度，以吸光度表示黄酮含量，并以其为指标，进行单因素试验，考察的因素水平为料液比 1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL），浸提时间 40、50、60、70、80 min，浸提温度 50、60、70、80、90 ℃，pH 值 6、6.5、7、7.5、8。
2）正交试验
通过单因素试验获得各因素水平，设计四因素三水平正交试验确定玉米须浸提液最佳制备条件，因素水平设计见表1。
表1 玉米须浸提条件正交试验因素水平表
Table 1 Factor and level of orthogonal experiment of extracting conditions for corn silk
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1.2.5.2 牛蒡浸提液的制备
1）单因素试验
称取粉碎后的牛蒡10 g，以水做提取剂，按照1.2.2测定浸提液中黄酮的吸光度，以吸光度表示黄酮含量，并以其为指标，进行单因素试验，考察的因素水平为料液比 1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL），浸提时间 30、40、50、60、70 min，浸提温度 50、60、70、80、90 ℃，pH 值 6、6.5、7、7.5、8。
2）正交试验
经过单因素试验获得各因素水平，设计四因素三水平正交试验确定牛蒡浸提液最佳制备条件，因素水平设计见表2。
1.2.5.3 饮料的配制
1）单因素试验
以感官评分为指标，进行单因素试验，考察牛蒡浸提液和玉米须浸提液体积比 2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5 ∶5、6∶4，柠檬酸添加量 0.06%、0.08%、0.1%、0.12%、0.14%，白砂糖添加量 2%、4%、6%、8%、10%，壳聚糖固定化复合酶添加量0.4%、1.2%、2.0%、2.8%、3.6%对饮料感官品质的影响。
表2 牛蒡浸提条件正交试验因素水平表
Table 2 Factor and level of orthogonal experiment of extracting conditions for burdock
水平因素A料液比/（g/mL）B浸提时间/min C浸提温度/℃ D pH值1 1∶30 50 60 6.5 2 1∶40 60 70 7.0 3 1∶50 70 80 7.5
2）正交试验
经过单因素试验获得各因素水平，设计四因素三水平正交试验玉米须牛蒡饮料的最佳配方，因素水平设计见表3。
表3 饮料工艺正交试验因素水平表
Table 3 Factor and level of orthogonal experiment of beverage processing
因素水平D壳聚糖固定化复合酶添加量/%1 3∶7 0.08 6 2.0 2 4∶6 0.10 8 2.8 3 5∶5 0.12 10 3.6 A牛蒡浸提液和玉米须浸提液体积比B柠檬酸添加量/%C白砂糖添加量/%
1.2.6 感官评定
参照宁楚洁等和徐辉对玉米须饮料和牛蒡饮料感官评价体系的建立，做适当修改[11，21]。选20名专业的感官鉴评人员（10男10女），鉴评人员利用其视觉、嗅觉、味觉逐一评价饮料的色泽、组织状态、气味、风味，进行综合评分，并去掉最高值与最低值取其平均值。评分标准见表4。
表4 饮料感官评分标准
Table 4 Standard of sensory evaluation of beverage
项目 评分标准 评分色泽 色泽透亮、均匀、呈金黄色 20～25色泽较透亮、较均匀、较黄色 15～19色泽稍暗淡、稍不均匀、偏黄色 10～14色泽暗淡、不均匀、呈褐色 0～9
续表4 饮料感官评分标准
Continue table 4 Standard of sensory evaluation of beverage
项目 评分标准 评分组织状态 澄清透明、无沉淀 20～25有少许沉淀，但不影响整体美观 15～19稍不透明，有明显沉淀 10～14不透明，整体浑浊 0～9气味 香气独特，玉米须、牛蒡香味浓郁 20～25香味稍淡，气味较和谐 15～19稍有香味，可以饮用 10～14有异味，影响饮用 0～9风味 风味独特，酸甜可口 20～25风味一般，可以接受 15～19口感过酸、过甜或过苦 10～14风味较差，影响饮用 0～9
图1 料液比、浸提时间、浸提温度、pH值对玉米须浸提液黄酮含量的影响
Fig.1 Effects of liquid-solid ratio，extraction time，extraction temperature，and pH value on flavonoids content in corn silk extract solution
A.料液比；B.浸提时间；C.浸提温度；D.pH值。
1.2.7 饮料澄清度的测定
取最适添加量的壳聚糖固定化复合酶于复合饮料中，连续澄清操作，反复使用10次，每次使用后用蒸馏水反复清洗壳聚糖固定化复合酶，分别测定复合饮料在900 nm波长下的透光率，以此表示复合饮料的澄清度[14-15]。
1.2.8 统计分析
每个试验均做3次。试验数据利用Origin10.0系统计算方差，差异由Duncan’s多重比较法获得，5%为显著水平。
2 结果与分析
2.1 玉米须浸提液的制备条件
2.1.1 玉米须浸提液制备条件的单因素试验
玉米须浸提液制备条件的单因素试验结果见图1。
玉米须浸提液中的黄酮含量在制备过程中受诸多因素影响。由图1（A）可以看出，玉米须浸提液吸光度随着料液比的变化而不断提高。当料液比达到1∶50（g/mL）时吸光度最高，之后有所下降，但未形成显著差异（P＞0.05），因此为节约提取剂用量，选择最适料液比为 1 ∶50（g/mL）。由图 1（B）可以看出，随着浸提时间的延长，玉米须浸提液吸光度不断升高。浸提时间为70 min时，吸光度浸提逐渐趋于平衡，浸提80 min时，吸光度未见显著增加（P＞0.05），因此为节省工艺时间，选择最适浸提时间为70 min。由图1（C）可以看出，随着浸提温度的升高，玉米须浸提液吸光度逐渐升高，当温度达到70℃后，吸光度无显著变化（P＞0.05）。因此为减少能源消耗，选择最适浸提温度为70℃。由图1（D）可以看出，浸提液pH值为7.0时吸光度显著高于其他处理组（P＜0.05），pH值可能影响黄酮类化合物的极性，影响其在水中的溶解性，因此选择最适浸提pH值为7.0。
2.1.2 玉米须浸提液制备条件的正交试验结果
正交试验结果见表5。
由表5可知，通过极差（R）结果分析4个因素影响玉米须浸提液吸光度的大小顺序为：料液比＞pH值＞浸提时间＞浸提温度。通过直观分析得出玉米须浸提液最佳制备条件为A2B3C3D2，另外9组试验中直接得到的最优组合为A1B3C3D3。验证试验结果表明，A2B3C3D2工艺浸提液的吸光度为0.769，显著高于A1B3C3D3的吸光度 0.718（P＜0.05），最终确定玉米须浸提液最佳制备条件为：料液比1∶50（g/mL），浸提时间80 min，浸提温度80℃，pH 7.0。
表5 玉米须浸提条件正交试验结果
Table 5 Results of orthogonal experiment of extracting conditions for corn silk
试验号 因素 吸光度料液比 浸提时间 浸提温度 pH值1 1 1 1 1 0.251 2 1 2 2 2 0.453 3 1 3 3 3 0.714 4 2 1 2 3 0.520 5 2 2 3 1 0.509 6 2 3 1 2 0.698 7 3 1 3 2 0.429 8 3 2 1 3 0.321 9 3 3 2 1 0.302 k1 0.473 0.400 0.423 0.354 k2 0.576 0.428 0.425 0.527 k3 0.351 0.571 0.551 0.518 R 0.225 0.171 0.128 0.173
2.2 牛蒡浸提液的制备条件
2.2.1 牛蒡浸提液制备条件的单因素试验结果
牛蒡浸提液制备条件的单因素试验结果见图2。
图2 料液比、浸提时间、浸提温度、pH值对牛蒡浸提液黄酮含量的影响
Fig.2 Effects of liquid-solid ratio，extraction time，extraction temperature，and pH value on flavonoids content in burdock extract solution
A.料液比；B.浸提时间；C.浸提温度；D.pH值。
由图2可以看出，在以水为提取剂进行牛蒡浸提液的制备过程中，料液比对吸光度影响较大，料液比为1∶40（g/mL）时浸提液吸光度显著高于其他处理组（P＜0.05），故选择最适料液比为 1 ∶40（g/mL）。随着牛蒡浸提时间的延长，吸光度不断升高，当浸提时间到达60 min后，牛蒡黄酮浸提逐渐趋于平衡，与浸提70 min的吸光度未见显著差异（P＞0.05）。与玉米须黄酮类似，牛蒡黄酮类化合物均为生物活性物质，高温条件下浸提时间过长容易导致活性降低，同时为节约工艺时间，故选择最适浸提时间为60 min。随着浸提温度的升高，浸提液吸光度逐渐升高，当温度到达70℃后，黄酮浸提效果未见显著提高（P＞0.05），当温度升高至90℃后，黄酮类化合物可能由于失活、分解，吸光度下降，故选择最适浸提温度为70℃。浸提液pH值对牛蒡中黄酮的浸提效果影响幅度变化较大，这可能与玉米须浸提液pH值的影响原理一样，即浸提液的pH值影响黄酮的极性。当浸提液pH值为7.0时，吸光度最高，故选择最适pH值为7.0。
2.2.2 牛蒡浸提液制备条件的正交试验结果
正交试验结果见表6。
由表6可以看出，通过极差（R）结果分析影响牛蒡浸提液的吸光度大小顺序为：料液比＞浸提时间＞pH值＞浸提温度。9组试验中直接找出的最优制备条件组合为试验号9，即A3B3C2D1，而直观分析得出的最佳制备条件为A3B3C1D1。验证试验结果表明，直观分析的最佳组合A3B3C1D1得到的牛蒡浸提液的吸光度为0.782，A3B3C2D1的吸光度为0.709，两者形成显著差异（P＜0.05）。因此，牛蒡浸提液最佳制备条件为：料液比1 ∶50（g/mL），浸提时间 70 min，浸提温度 60 ℃，pH 6.5。
表6 牛蒡浸提条件正交试验结果
Table 6 Results of orthogonal experiment of extracting conditions for burdock
试验号 因素 吸光度料液比 浸提时间 浸提温度 pH值1 1 1 1 1 0.409 2 1 2 2 2 0.347 3 1 3 3 3 0.296 4 2 1 2 3 0.378 5 2 2 3 1 0.585 6 2 3 1 2 0.647 7 3 1 3 2 0.369 8 3 2 1 3 0.544 9 3 3 2 1 0.712 k1 0.351 0.385 0.533 0.569 k2 0.537 0.492 0.479 0.454 k3 0.542 0.552 0.417 0.406 R 0.191 0.167 0.116 0.163
2.3 玉米须牛蒡复合饮料的制备工艺
2.3.1 玉米须牛蒡复合饮料制备工艺的单因素试验结果
玉米须牛蒡复合饮料制备工艺的单因素试验结果见图3。因壳聚糖固定化复合酶对饮料感官品质的影响不显著，本文未分析该因素的影响结果。
图3 牛蒡浸提液和玉米须浸提液体积比、柠檬酸添加量、白砂糖添加量对饮料感官品质的影响
Fig.3 Effects of compound of juice of burdock and corn silk，citric acid amount and sugar amount on sensory quality of beverage
A.牛蒡浸提液和玉米须浸提液体积比；B.柠檬酸添加量；C.白砂糖添加量。
由图3（A）可知，牛蒡浸提液和玉米须浸提液体积比对饮料感官评分的影响随着体积比的变化而改变。体积比为2∶8时，玉米须味道过重，颜色较浅；体积比为6∶4时，牛蒡味过重，味道较苦，颜色过深，风味均不佳，感官评分低，都不受欢迎。体积比为4∶6时，牛蒡与玉米须的味道和谐，色泽鲜亮，感官评分显著高于其他处理组（P＜0.05），故选择最适牛蒡浸提液和玉米须浸提液体积比为 4 ∶6。由图 3（B）、（C）可知，柠檬酸和白砂糖的添加量不适当使得饮料的糖酸比不佳，会影响饮料风味，即味道过淡、过甜或过酸，均不受欢迎，感官评分较低。柠檬酸添加量0.10%的感官评分显著高于其他处理组（P＜0.05），白砂糖添加量8%的感官评分显著高于其他处理组（P＜0.05），故选择最适柠檬酸添加量为0.10%，最适白砂糖添加量为8%。
2.3.2 玉米须牛蒡复合饮料制备工艺的正交试验结果正交试验结果见表7。
表7 饮料工艺正交试验结果
Table 7 Results of orthogonal experiment of beverage processing
因素试验号 复合酶添加量1 1牛蒡浸提液和玉米须浸提液体积比柠檬酸添加量白砂糖添加量感官评分1 1 1 85 2 1 2 2 2 93 3 3 3 3 78 4 2 1 2 3 83 1 5 2 3 1 80 6 2 3 1 2 75 2 7 1 3 2 73 8 3 2 1 3 80 3 3 2 1 75 k1 85.33 80.33 80.00 80.00 k2 79.33 84.33 83.67 80.33 k3 76.00 76.00 77.00 80.33 R 9.333 8.333 6.667 0.333 9 3
由表7可知，通过极差（R）结果判断出影响饮料感官品质的大小顺序为：牛蒡浸提液和玉米须浸提液体积比＞柠檬酸添加量＞白砂糖添加量＞壳聚糖固定化复合酶添加量。其中复合酶作为改善加工工艺、提高产品澄清度进行使用，不能影响产品风味，该特点通过极差结果得到证明。通过直观分析得出复合饮料的最佳制备工艺为A1B2C2D2或A1B2C2D3，与9组试验中直接找出的最优组合试验号2，即A1B2C2D2重合。因此，确定玉米须牛蒡复合饮料的最佳制备工艺为：牛蒡浸提液和玉米须浸提液体积比3∶7，柠檬酸添加量0.10%，白砂糖添加量8%，壳聚糖固定化复合酶添加量2.8%。
2.4 主要功能性成分含量测定
2.4.1 饮料黄酮含量的测定结果
芦丁标准曲线见图4。
图4 芦丁标准曲线
Fig.4 Standard curve of rutin standard
如图4所示，芦丁标准曲线的线性回归方程为y=0.009 5x+0.000 1，R2=0.999 5。将最佳制备工艺得到的复合饮料中黄酮吸光度带入方程，计算得到饮料中黄酮含量为0.306 mg/mL。
2.4.2 饮料多糖含量的测定结果
葡萄糖标准曲线见图5。
图5 葡萄糖标准曲线
Fig.5 Standard curve of glucose standard
如图5所示，葡萄糖标准曲线的线性回归方程为y=0.050 2x-0.003 2，R2=0.999 5。将最佳制备工艺得到的复合饮料中多糖吸光度带入方程，计算得到饮料中多糖含量为0.661 mg/mL。
2.5 饮料澄清度的测定结果
最佳制备工艺得到的饮料在不同澄清次数下的透光率，结果见图6。
图6 壳聚糖固定化复合酶澄清玉米须牛蒡复合饮料的操作稳定性
Fig.6 Stability of chitosan immobilized complex enzyme on clarification of corn silk and burdock compound beverage
a～h字母相同表示差异不显著（P＞0.05），不同则表示差异显著（P＜0.05）。
随着澄清次数的增加，透光率逐渐下降，该结果与林建城和秦珂等结果类似，酶反复作用于不同原料，可能均会因为酶本身部分失活或回收损失使得澄清效果降低[14，22]。澄清操作8次后，透光率下降至78.3%，肉眼观察无明显变化，外观可接受，说明固定化酶具有较好的操作稳定性，若应用于生产实践，可直接降低饮料生产成本。
3 结论
通过单因素试验和正交试验，以吸光度表示黄酮含量，并以其为指标，确定了以水为提取剂的玉米须浸提液和牛蒡浸提液的最佳制备条件。玉米须浸提液最佳制备条件为料液比1∶50（g/mL），浸提时间80 min，浸提温度80℃，pH 7.0；牛蒡浸提液最佳制备条件为料液比 1∶50（g/mL），浸提时间 70 min，浸提温度60℃，pH 6.5。同样利用单因素试验和正交试验，以感官评分为指标，确定了玉米须牛蒡复合饮料的最佳工艺配方，即牛蒡浸提液和玉米须浸提液体积比3∶7，柠檬酸添加量0.10%，白砂糖添加量8%，壳聚糖固定化复合酶添加量2.8%，对复合饮料的感官品质的影响顺序为牛蒡浸提液和玉米须浸提液体积比＞柠檬酸添加量＞白砂糖添加量＞壳聚糖固定化复合酶添加量。最佳工艺条件下得到的复合饮料中的黄酮含量为0.306 mg/mL，多糖含量为0.661 mg/mL。壳聚糖固定化复合酶对饮料感官品质无显著影响，并起到较好的澄清效果，且可以反复使用，操作稳定性较好，在实际生产过程中可降低饮料加工成本，具有较好的应用前景。
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