以橄榄为例研究单宁提取方法的改进及优化

橄榄[Canarium album（Lour.）Raeusch.]为橄榄科橄榄属乔木植物，广泛种植于我国福建、广东、广西、海南[1-5]。其果味甘酸，性平，具有清热解毒，化痰止咳，生津止渴的作用。且橄榄营养丰富，果肉内含蛋白质、碳水化合物、脂肪、维生素C[6-7]等物质，含钙量也很高。此外，橄榄中单宁含量极高，单宁又称鞣质、单宁酸，是多元苯酚类衍生物，有多重功效，如抗病毒活性、收敛、抗肿瘤活性[8]，并能与自由基发生反应[9-15]，具有很强的抗氧化能力等[15-19]。但是，橄榄涩味重，其涩味主要来自细胞中的单宁，果实中单宁含量越高，涩味越浓。因此，果实加工过程需要进行脱涩处理，尽量把果实中单宁去除。目前，植物单宁的提取一般选择以甲醇、乙醇等有机溶剂为主，但是提取时间长，易造成单宁氧化量及副提取物量的增加，导致提取效率偏低。超声波辅助提取技术则可利用超声波增大介质分子的运动速度、增大介质的穿透力等效应以提取生物有效成分[20-22]。本研究比较了不同提取溶剂的提取效率，结合超声波辅助提取技术，以橄榄为例从多方面优化单宁的提取工艺，目的在于提高单宁的提取效率，并将之应用于食品脱涩工艺中。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜橄榄果：于2019年4月采购于福建莆田，置于-20℃冰箱中冷藏备用[14]。

单宁酸：天津市大茂化学试剂厂；甲醇、乙醇、邻二氮菲：广州试剂厂；甘油、冰醋酸、乙二胺四乙酸二钠、六合水三氯化铁：西陇化工股份有限公司；无水乙酸钠：天津市致远化学试剂有限公司；以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器

S22H超声波清洗仪：致微厦门有限公司；BSA224S电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司；XMTD203恒温水浴锅：金坛市科析仪器有限公司；H1850R台式高效冷冻离心机：湖南湘怡实验仪器开发有限公司；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；T6新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；CS-700高速多功能打粉机：永康市天祺盛世工贸有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 单宁标准曲线的制定

精密称取单宁酸5 mg，用蒸馏水定容于50 mL容量瓶中，作为0.1 mg/mL单宁标准溶液。分别取0、200、400、600、800、1 000 μL 标准溶液于 25 mL 棕色容量瓶中，加入5mL蒸馏水和125 μL的0.1 mol/L FeCl3溶液，静置20min，再加入5mL邻二氮菲缓冲溶液[0.015mol/L邻二氮菲∶NaAc缓冲溶液∶0.05 mol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）=10∶5∶1（体积比）]定容，静置 10 min，在510 nm处测定各浓度的吸光度[23-25]。以吸光度为纵坐标，单宁浓度为横坐标绘制标准曲线，得Y=0.276X-0.001 8，R2=0.995 4。

1.3.2 单宁含量的测定

单宁含量测定采用邻二氮菲分光光度法。用0.1 mol/L的FeCl3溶液与样品液反应，加入邻二氮菲溶液反应，在510 nm处检测其吸光度，通过标准曲线计算橄榄单宁提取量。

1.3.3 溶剂提取效率的比较

将烘干至恒重的橄榄粉碎成80目的粉末。取0.50 g橄榄粉末，在提取温度40℃、提取时间40 min、料液比1∶40（g/mL）、超声波功率100 W下采用固定功率超声波辅助提取单宁，比较水、甘油、甲醇、乙醇、甲醇-甘油、乙醇-甘油等不同提取溶剂对单宁提取率的影响。

在相关文献检索和初步试验的基础上，确定对提取率有较大影响的3个因素：提取温度（A+）、提取时间（B+）、料液比（C+）为三因素。选用混合正交表L9（33），按正交设计法寻找最佳工艺条件[26]，正交因素水平表见表1。

1.3.5 响应面试验

以正交试验的最佳提取条件作为参考，考虑成本过高，调整料液比为 1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL）。把单宁提取率作为响应值，选取提取温度、提取时间、料液比3个影响因素为自变量，采用三因素三水平的响应面优化以上因素，水平及因素编码如表2响应面水平及因素编码所示。

1.4 数据处理

根据Box-Benhnken试验设计原理，应用Design Expert 8.06软件对试验所得结果进行回归拟合分析处理。

2 结果与分析

2.1 不同溶剂提取效率的比较

在提取温度40℃、提取时间40 min、料液比1 ∶40（g/mL）、超声波功率 100 W 的基础上[18-21]，考察了水、甘油、甲醇、乙醇、甲醇∶甘油=7∶3（体积比）、乙醇∶甘油=7∶3（体积比）作为提取溶剂的提取效率。提取溶剂对单宁提取率的影响见图1。

由图1可知，各溶剂的效率大小为：甲醇+甘油＞甘油＞乙醇+甘油＞甲醇＞水＞乙醇。甘油的添加有效提高有机溶剂对单宁的提取率；添加甘油后，甲醇的提取率从24.93%提升至70.31%，乙醇的从5.8%提升至28.66%。

甘油作为有机溶剂，具有价格低廉、安全无毒和对单宁具有较大溶解度的特点，理论上是一种有潜质的溶剂。但试验结果表明，单独使用甘油的效果并不佳，可能是由于甘油的黏稠性质导致其无法较好地提取样品中的单宁。而甲醇与甘油的混合溶剂，显著提高单宁的提取率。原因可能是甲醇成液体状穿透性强，能将单宁带出样品，溶解于甘油中。

2.2 甘油添加比例的提取效率比较

为进一步明确甘油添加量对提取率的影响，提取溶剂分别为：甲醇与甘油体积比分别为 8∶2、7∶3、6∶4、5 ∶5、4 ∶6、3 ∶7、2 ∶8（体积比），其它条件与 2.1 一致。甲醇与甘油不同比例对单宁提取率的影响见图2。

由图2可知，增加甘油含量会提升提取率，直到60%甘油具有最高的提取率，为87.89%；随后，甘油比例继续增大时，提取率会逐渐降低。因此，优化结果为甲醇∶甘油=4∶6（体积比）时提取率最高，适合选为橄榄单宁的提取剂。

2.3 正交试验优选最优条件

以2.2为基础，溶剂选用甲醇∶甘油=4∶6（体积比），超声波功率100 W，探究温度、时间、料液比等因素对单宁提取效率的影响。其中，基于单宁受热易分解的特点，提取温度选择20、40、60℃；考虑成本因素，提取时间选择40、60、80 min，提取料液比选择1∶20、1 ∶40、1 ∶80（g/mL）。

2.3.1 正交试验结果

以正交试验（表1）的条件设计试验，每组重复3次，计算出各条件下的单宁提取率，并对数据进行处理，正交试验的结果见表3。结果表明，在甲醇∶甘油=4∶6（体积比）、功率为100 W、温度为20℃、时间为80 min、料液比为 1 ∶80（g/mL）的提取条件下，橄榄单宁的提取率最高约为93.26%。

由表3可知，各因素对橄榄单宁提取率影响程度的主次顺序为B+（时间）＞A+（温度）＞C+（料液比），最佳方案为A+1B+3C+2。方差分析结果如表4。

2.3.2 正交试验结果的验证

为验证上述正交试验的结果，选取正交结果最优条件A+1B+3C+3，k值最优结果A+1B+3C+2进行验证试验，通过3次重复试验，正交最优条件得出平均单宁提取率为94.08%，高于k值结果，故在后续试验中选A+1B+3C+3做进一步优化。验证试验结果与正交试验结果相差0.82%。误差在可允许范围内，正交试验重复率高，数据真实可信。

2.4 响应面试验优选最优条件

2.4.1 响应面结果分析

以响应面（表2）的条件设计试验，每组重复3次，计算出各条件下的单宁提取率，并对数据进行处理，橄榄单宁提取中心组合试验方案及结果见表5。

2.4.2 回归模型方差结果及分析

回归方程分析表见表6。

由表6可知，该模型方程P=0.003 4＜0.05，远小于0.01，表现为“差异极显著”，表明回归模型达到极显著水平。模型的相关系数R2=92.54%，大于0.8，说明模型拟合度良好，体现了响应值得率实际值与预测值之间的拟合度较大，反应真实试验值。失拟项P=0.089 6＞0.05，表现为“不显著”，可得出该模型合适，失拟项对于存在的纯误差不显著，可忽略。变异系数C.V.=2.68%，远小于10，说明试验具有较高的重复性。综上所诉，试验误差小，重复性强，方法可靠，因此该模型可进一步分析单宁最佳提取工艺条件。

2.4.3 响应面交互因素分析

各因素交互作用的响应面曲面图见图3～图5。

观察交互作用的响应面曲面坡度陡峭程度，若坡度陡峭，表明响应值受变量交互作用的影响大；分别将提取时间、提取温度、料液比其中两个影响因素固定为零水平，组合得出另外两个影响因素的交互作用。并结合表6可知，AB交互作用P=0.004 1，表示为“影响极显著”，表明提取温度与提取时间两因素之间的交互作用对橄榄单宁提取率影响极大。AC交互作用P=0.294 2。BC交互作用P=0.979 4，表明提取时间与料液比之间的交互作用对橄榄单宁提取率影响较小。由F值可得出，各影响因素的主次顺序为：提取时间（B）＞提取温度（A）＞料液比（C），与正交试验所得结果吻合。

2.4.4 最佳提取工艺的优化及验证分析

在正交试验最优结果（A+1B+3C+3）的基础上，通过响应面软件优化得到的最佳提取工艺条件为：在超声波功率为100 W的条件下，提取温度为15.08℃，提取时间为98.65 min，料液比为 1 ∶22.49（g/mL），单宁提取率的理论值为97.52%。为了验证结果的真实性、可靠性与实际操作的方便性，将实际提取工艺参数调整为提取温度为 15℃，提取时间为 99 min，料液比为 1∶22.5（g/mL）。以此为提取条件，进行3次平行重复试验，得出实际单宁的平均提取率为95.99%与理论值97.52%相差1.53%，误差在5%以内，说明此模型可靠性较高。

3 结论

以甲醇和甘油作为提取溶剂，采用超声波辅助法提取橄榄粉末中单宁，经正交试验结果显示提取时间＞提取温度＞料液比。因此，最优条件为：甲醇∶甘油=4∶6（体积比）、提取功率100 W、提取温度20℃、提取时间80 min、料液比1∶80（g/mL），在此条件下提取率可以达到（93.26±0.45）%。同时，考虑环保及成本问题，建议以提取温度为40℃、提取时间为80 min、提取料液比为1∶20作为最优条件。

进一步运用响应面软件Design Expert 8.06优化工艺条件，得出橄榄粉末中单宁提取的最佳工艺条件为：超声波功率为100 W，提取温度为15℃，提取时间为99 min，料液比为1∶22.5（g/mL），单宁提取率为95.99%。本试验研究表明使用甲醇和甘油作为提取溶剂，对单宁的提取率及重复率效果显著，可为橄榄的产品开发提供一定的依据。

[1] 吴如健，万继锋，韦晓霞，等.橄榄果实发育过程中单宁变化规律研究[J].福建农业学报，2015，30(5)：489-491

[2] 黄坚航.福建橄榄道地性研究[J].亚太传统医药，2006，2(8)：77-78

[3] 孔祥佳，刘廉荣.超声波乙醇浸提法提取橄榄叶总多酚工艺的研究[J].福建中医药，2017，48(2)：34-37

[4] 张玲，吴彦芳，张钟.超声波辅助提取橄榄浸膏工艺研究[J].广东石油化工学院学报，2016，26(6)：20-23

[5] 张福平，陈蔚辉，林建新.橄榄的营养保健价值及开发利用[J].食品研究与开发，2002，23(4)：48-49

[6] 刘婷，王茜，海光辉，等.基于响应面法的餐用油橄榄果脱涩工艺优化[J].经济林研究，2019，37(1)：139-147

[7] 项昭保，陈海生，何从林.橄榄的化学成分与药理作用研究进展[J].时珍国医国药，2006，17(11)：2299-2300

[8] 项昭保，伍晓玲，钟雪.响应面优化超声波辅助乙醇提取橄榄叶总黄酮的工艺研究[J].食品工业科技，2018，39(10)：211-215，221

[9] 任雪峰，齐亚娥，吴冬青，等.牛蒡叶单宁提取工艺及大孔树脂吸附性能的研究[J].河西学院学报，2018，34(2)：29-40

[10]李志，冉茂乾，焦彦朝.响应面法优化刺梨中单宁提取工艺研究[J].云南师范大学学报(自然科学版)，2019，39(2)：53-59

[11]杨琼琼.柿木皮单宁提取纯化及抗氧化活性研究[D].南宁：广西大学，2016

[12]舒杨雄，陈亚，谭念，等.石榴皮单宁的提取及抑菌效果研究[J].粮食科技与经济，2016，41(5)：63-64，69

[13]耿树香，宁德鲁，陈海云，等.油橄榄果脱苦实验及其单宁含量的变化研究[J].西部林业科学，2012，41(3)：70-74

[14]陈洪彬，蔡英卿，张妙霞，等.超声波辅助提取余甘果实单宁工艺的优化[J].食品与发酵工业，2014，40(5)：241-245

[15]胡上英，庞庭才，黄海，等.银叶树果壳单宁提取及抗氧化性研究[J].粮食与油脂，2018，31(10)：93-96

[16]孟明佳，凌敏，张金闯，等.柿渣中不溶性单宁分析及其抗氧化活性[J].食品科技，2017，42(1)：100-106

[17]张亮亮，林鹏，林益明.橄榄果实单宁的抗氧化能力研究[J].食品与发酵工业，2008，34(7)：24-27

[18]顾海峰.柿子单宁的性质、结构及其与几种蛇毒蛋白的相互作用研究[D].武汉：华中农业大学，2007

[19]张维伟，赵忠，张文辉，等.辽东栎橡碗单宁提取及其抗氧化活性[J].食品工业科技，2018，39(23)：215-221，240

[20]李珍，苏有勇，曹茂炅，等.超声波辅助提取紫茎泽兰中单宁的工艺优化[J].化学与生物工程，2015，32(12)：47-50

[21]余先纯，孙德林，李湘苏.超声波辅助提取柿子树叶单宁的研究[J].化学研究与应用，2011，23(3)：345-349

[22]王鸣.橄榄水提物的抗氧化性及其应用[D].福州：福建农林大学，2016

[23]李晓文，严聃，盛灿梅.邻二氮菲-铁(Ⅲ)分光光度法测定茶叶中微量单宁[J].食品与机械，2006，22(2)：90-91，101

[24]侯芳，郑伟.邻二氮菲法测铁的实验改进[J].广州化工，2019，47(8)：134-136

[25]刘涛，刘宁，王雅，等.超声波细胞破碎法提取香蕉皮中水解单宁的工艺研究[J].中国调味品，2019，44(2)：39-44

[26]任平，岳淑宁，李忠玲，等.石榴皮单宁类化合物的提取研究[J].食品工业科技，2007，28(2)：149-150，153