蟛蜞菊[Wedelia chinensis（Osbeck）Merr.]又叫黄花蟛蜞草、黄花墨菜、黄花龙舌草、田黄菊、卤地菊，属于菊科蟛蜞菊属的植物，主要生长在我国的广东、广西等亚热带地区[1]。据研究发现，蟛蜞菊具有较好的药用价值，全草入药[2]，现临床主要用于治疗肝炎、口腔炎等[3]，这和蟛蜞菊富含的植物活性成分密切相关。沈卓豪等[4]研究发现了蟛蜞菊花挥发油富含多种倍半萜类化合物，对大肠杆菌等6种细菌具有抑制作用；任慧等[5]从蟛蜞菊中分离出9种酚酸类化合物；孙小茗等[6]研究发现蟛蜞菊内酯对对乙酰氨基酚引起的急性肝损伤有明显的保护作用；陈秀清等[7]对比4种蟛蜞菊叶蛋白的提取方法，但关于蟛蜞菊的活性成分总黄酮提取研究尚未见报道，许永[8]发现黄酮类化合物具有抑菌、消炎、抗氧化等多种功效。
超声辅助提取技术被视为“绿色技术”，是一种高效、环保的提取技术，常用于提取热不稳定性的成分，如Sun Xiaoyang等[9]利用超声辅助提取花生蛋白，发现该方法能有效改善花生的乳化性；Luis等[10]发现超声辅助提取藤黄总黄酮可使提取率提高3倍以上；Li Yuanhui等[11]将超声辅助提取技术应用葛根淀粉，得到高纯度的葛根淀粉。叶红玲等[12]采用超声辅助法提取蓝莓花青素，李海燕等[13]确定了当归多糖的最佳提取工艺。为了使蟛蜞菊的资源能够得到充分的利用，本试验选取蟛蜞菊为原料，以蟛蜞菊的主要有效活性成分黄酮类化合物的提取作为出发点，对于蟛蜞菊的黄酮类化合物的提取工艺进行了初步的研究，并做了抗氧化活性的测定，为进一步对蟛蜞菊的黄酮类化合物的研究和应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
蟛蜞菊：采自广西崇左市。
芦丁、N-1-萘乙二胺盐酸、无水磷酸氢二钠：国药集团化学试剂有限公司；DPPH（纯度≥97%）：上海蓝季科技发展有限公司；硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、一水柠檬酸：成都市科龙化工试剂厂；硫酸亚铁、水杨酸（纯度为99.5%）、无水对氨基苯磺酸：天津市光复精细化工研究所；双氧水、石油醚、无水乙醇、抗坏血酸：天津市北辰方正试剂厂；以上试剂均为分析纯。
UV-16001超声波清洗仪：上海冠特超声仪器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式多用真空泵：河南省予华仪器有限公司；VIS-7220N可见分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；AR124CN电子分析天平：上海奥豪斯仪器有限公司；HZ-2A恒温水浴锅：南京南大万和科技有限公司；101电热鼓风干燥箱：北京市永光明医疗仪器有限公司；GS-3008粉碎机：广东佛山市南海家乐仕电器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 总黄酮提取
参照许建本等[14]的提取方法对蟛蜞菊总黄酮进行提取。
1.2.2 单因素试验
设置料液比 1 ∶20（g/mL），超声功率 50 W，提取时间20 min，提取温度60℃，其他参数和操作同方法1.2.1，探究不同的乙醇浓度（35%、40%、45%、50%、55%）对总黄酮得率的影响。
设置乙醇浓度为45%，超声功率50 W，提取时间20 min，提取温度60℃，其他参数和操作同1.2.1，探究不同的料液比[1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40（g/mL）]对总黄酮得率的影响。
设置乙醇浓度为45%，料液比1∶35（g/mL），提取温度60℃，提取时间20 min，其他参数和操作同方法1.2.1，探究不同的超声功率（30、40、50、60、70 W）对总黄酮得率的影响。
设置乙醇浓度为45%，料液比1∶35（g/mL），超声功率50 W，提取温度60℃，其他参数和操作同方法1.2.1，探究不同的提取时间（20、30、40、50、60 min）对总黄酮得率的影响。
设置乙醇浓度为45%，料液比1∶35（g/mL），超声功率50 W，提取时间40 min，其他参数和操作同方法1.2.1，探究不同的提取温度（30、40、50、60、70 ℃）对总黄酮得率的影响。
1.2.3 正交试验设计
根据单因素试验结果，选取乙醇浓度、料液比、超声功率、提取时间这4个因素的3个水平，在最佳温度60℃下进行L9（34）正交试验，以确定蟛蜞菊的总黄酮最佳提取工艺。因素水平表见表1。
表1 正交试验因素水平
Table 1 The design for orthogonal test of four factors at three different levels
水平D料液比/（g/mL）1 30 40 40 1∶30 2 40 50 45 1∶35 3 50 60 50 1∶40因素A提取时间/min B超声功率/W C乙醇浓度/%
1.2.4 总黄酮得率的测定
参照Aadil等[15]的测定方法。
1.2.5 抗氧化能力的测定
1.2.5.1 DPPH·清除能力的测定
参照许建本等[14]的测定方法。
1.2.5.2·OH清除能力的测定
参照马玲龙等[16]的测定方法。
1.2.5.3 NaNO2清除能力的测定
参照王敏等[17]的测定方法。
1.2.6 重复性试验
由正交试验得出蟛蜞菊总黄酮的最优提取方案后，在最优方案下重复提取3次，在波长为510 nm处测出吸光度值，算出提取率，并进一步计算其平均值，对最佳工艺进行验证。
1.2.7 加标回收试验
准确移取4份0.50 mL在最优方案条件下得到的蟛蜞菊总黄酮提取液，分别移入25 mL的比色管中，其中有3份分别加入0.5 mL的芦丁标准溶液（0.40 mg/mL），接着按步骤1.2.4进行操作，在波长为510 nm处测吸光度值，并根据吸光度数值计算出加标回收率。其计算公式如式（1）。
1.3 数据处理
所有试验数据重复测定3次以上，采用Origin8.5、SPSS19.0软件进行图片绘制和数据处理。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 乙醇浓度对蟛蜞菊总黄酮得率的影响
乙醇浓度对蟛蜞菊总黄酮得率的影响见图1。
图1 乙醇浓度对总黄酮得率的影响
Fig.1 Effect of ethanol concentration on total flavonoids yield
由图1可知，随着乙醇浓度的增大，蟛蜞菊总黄酮得率呈先上升后下降的趋势，当乙醇浓度为35%时，黄酮得率最低，为6.83%，当乙醇浓度为45%时，黄酮得率呈现最大值，为7.49%，改变乙醇浓度可提高黄酮得率，提高了9.66%。当乙醇浓度超过45%时，蟛蜞菊总黄酮得率出现下降趋势，这可能和蟛蜞菊黄酮的主要成分有较大关系，众所周知，黄酮是一大类以2-苯基色原酮为基本母核的化合物，其溶解度与结构和存在状态密切相关。当乙醇浓度为45%时，有利于蟛蜞菊总黄酮的溶解，因此得率最高。
2.1.2 料液比对蟛蜞菊总黄酮得率的影响
料液比对蟛蜞菊总黄酮得率的影响见图2。
图2 料液比对总黄酮得率的影响
Fig.2 Effect of ratio of material to liquid on total flavonoids yield
由图 2 可知，当料液比为 1∶20（g/mL）～1∶35（g/mL），随着溶剂体积的增大，蟛蜞菊总黄酮得率不断升高，从7.14%到7.34%，当溶剂体积大于35倍时，黄酮得率开始降低，这一变化趋势和其他学者的研究结果一致，如荆常亮[18]研究发现溶剂体积在一定范围内的增加有利于黄酮类化合物的溶出，主要是因为溶剂体积的增大会增加有效成分与溶剂的接触机会，从而有助于黄酮类化合物的溶出。因此蟛蜞菊总黄酮提取的最佳料液比为 1 ∶35（g/mL）。
2.1.3 超声功率对蟛蜞菊总黄酮得率的影响
超声功率对蟛蜞菊总黄酮得率的影响见图3。
图3 超声功率对总黄酮得率的影响
Fig.3 Effect of power on total flavonoids yield
由图3可知，在超声功率为30 W到50 W之间时，蟛蜞菊总黄酮得率不断升高，在超声功率为50 W的时候黄酮得率最高，高达7.29%。当超声功率大于50 W时，随着超声功率的增加，黄酮得率呈轻微下降的趋势，可能是因为超声功率较大时对黄酮类物质有所破坏。由此可见蟛蜞菊总黄酮的最佳超声功率为50 W。
2.1.4 提取时间对蟛蜞菊总黄酮得率的影响
提取时间对蟛蜞菊总黄酮得率的影响见图4。
图4 提取时间对总黄酮得率的影响
Fig.4 Effect of extraction time on total flavonoids yield
由图4可知，在提取时间为20 min～40 min之间时，蟛蜞菊总黄酮得率不断升高，但在提取时间大于40 min后，蟛蜞菊总黄酮得率急剧降低，这说明当提取时间为40 min时，黄酮基本被提取出来了，后续再增加提取时间，黄酮物质不再增加。因此总黄酮的最佳提取时间为40 min。
2.1.5 提取温度对蟛蜞菊总黄酮得率的影响
提取温度对蟛蜞菊总黄酮得率的影响见图5。
图5 提取温度对总黄酮得率的影响
Fig.5 Effect of extraction temperature on total flavonoids yield
由图5可知，随着提取温度的增加，蟛蜞菊总黄酮得率不断增加，但当提取温度大于50℃时，黄酮得率增加速度变得缓慢，并在60℃后出现了下降趋势。一般情况下，环境温度越高，分子运动越快，分子扩散和渗透作用加强，因此黄酮溶出量增加，但当温度过高会破坏部分黄酮物质，从而导致黄酮得率下降，这一点和刘香萍等[19]的研究一致。综合考虑，选60℃为最佳提取温度。
2.2 正交试验
根据单因素试验结果，选取乙醇溶液的浓度、料液比、超声功率、提取时间4个影响因素。按照表1设计L9（34）正交试验，得出蟛蜞菊总黄酮得率，结果见表2。方差分析见表3。
表2 蟛蜞菊总黄酮提取正交试验结果
Table 2 Results of orthogonal experiment on extraction of total flavonoids from Wedelia chinensis
试验号 A提取时间/min总黄酮得率/%1 1（30） 1（40） 1（40） 1（1∶30） 6.777 2 1 2（50） 2（45） 2（1∶35） 6.748 3 1 3（60） 3（50） 3（1∶40） 6.686 4 2（40） 1 2 3 6.860 5 2 2 3 1 6.810 6 2 3 1 2 6.816 7 3（50） 1 3 2 6.768 8 3 2 1 3 6.816 9 3 3 2 1 6.866 k1 6.737 6.802 6.803 6.818 k2 6.829 6.791 6.827 6.777 k3 6.817 6.789 6.755 6.787 R 0.092 0.013 0.072 0.041 B超声功率/W C乙醇浓度/%D料液比/（g/mL）
表3 正交试验结果方差分析
Table 3 Variance analysis of orthogonal test
注：F0.05（2，8）=4.46，F0.01（2，8）=8.62；**表示因素影响极显著（P＜0.01）。
变异来源 离均差平方和 自由度 均方 F值 显著水平A 0.014 89 2 0.007 45 56.653 **B 0.000 26 2 0.000 13 1.000 C 0.007 71 2 0.003 85 29.311 **D 0.002 65 2 0.001 32 10.068 **总和 0.025 51 8
由表2和表3可知，在提取温度为60℃的条件下，影响蟛蜞菊中总黄酮得率的主次因素为A＞C＞D＞B，即提取时间＞乙醇浓度＞料液比＞超声功率，提取时间、乙醇浓度和料液比这3个因素对蟛蜞菊中总黄酮得率有极显著影响。从正交优化试验可以得出提取蟛蜞菊总黄酮的最佳工艺条件为A2B1C2D1，即提取时间40 min、超声功率为40 W、乙醇浓度45%、料液比1 ∶30（g/mL）。
按最佳提取工艺条件：提取温度60℃、提取时间40 min、超声功率为40 W、乙醇浓度45%、料液比1∶30（g/mL），进行3次平行试验，测得黄酮得率平均值为6.896%，3组试验数据相差较小，表明正交试验优选得出的工艺条件具有可靠性。
精密移取4份蟛蜞菊总黄酮提取液0.50 mL，其中3份分别加入0.50 mL的芦丁标准溶液（0.40 mg/mL），以乙醇为空白对照，按1.2.7步骤进行操作，3组试验得到的回收率结果分别为101%、100%、98.1%，得到平均回收率为99.7%，RSD值为2.9%，表明此方法准确可靠。
2.3 抗氧化能力的测定
2.3.1 蟛蜞菊总黄酮对DPPH·清除能力的测定
蟛蜞菊总黄酮对DPPH·的清除能力见图6。
图6 蟛蜞菊总黄酮对DPPH·的清除能力
Fig.6 The DPPH·scavenging ability of of total flavonoids in the Wedelia chinensis
由图6可以得出，随着蟛蜞菊总黄酮和抗坏血酸的浓度不断提高，DPPH·的清除能力呈上升趋势，当蟛蜞菊总黄酮浓度低于0.5 mg/mL时，DPPH·的清除能力上升速度很快，当质量浓度为0.664 0 mg/mL时，DPPH·的清除能力达到了94.62%，与VC的DPPH·的清除能力96.72%相近，说明蟛蜞菊总黄酮在较大浓度时具有很强的清除DPPH·的能力。
2.3.2 蟛蜞菊总黄酮对·OH清除能力的测定
蟛蜞菊总黄酮对·OH的清除能力见图7。
图7 蟛蜞菊总黄酮对·OH的清除能力
Fig.7 The·OH scavenging ability of of total flavonoids in the Wedelia chinensis
由图7可以得出，随着蟛蜞菊总黄酮和抗坏血酸的质量浓度不断提高，·OH的清除能力呈上升趋势，当蟛蜞菊总黄酮质量浓度较低时，·OH的清除能力上升速度很快，当浓度较高时，·OH的清除能力上升速度较慢，并趋于稳定的状态。当质量浓度为0.664 0 mg/mL时，·OH的清除能力达到了76.29%，比同浓度的VC的·OH的清除能力98.98%低，说明蟛蜞菊总黄酮在较大浓度时具有一定的清除·OH的能力，但其清楚能力没有抗坏血酸强。
2.3.3 蟛蜞菊总黄酮对NaNO2清除能力的测定
蟛蜞菊总黄酮对NaNO2清除能力见图8。
图8 蟛蜞菊总黄酮对NaNO2清除能力
Fig.8 The NaNO2scavenging ability of total flavonoids in Wedelia chinensis to sodium nitrite
由图8可以得出，随着蟛蜞菊总黄酮和抗坏血酸的浓度不断提高，NaNO2的清除能力呈上升趋势，当蟛蜞菊总黄酮浓度较低时，NaNO2的清除能力也较低，低至24.07%。随着质量浓度的提高，NaNO2的清除能力也逐渐增强，当蟛蜞菊总黄酮浓度为0.664 0 mg/mL时，NaNO2的清除能力达到了63.99%，比最低时提高了166%，说明一定浓度的蟛蜞菊总黄酮具有一定的NaNO2清除能力。
3 结论
本文以蟛蜞菊为研究对象，采用超声波辅助提取蟛蜞菊总黄酮，并对其抗氧化能力进行探究，通过试验发现总黄酮的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度45%、料液比 1∶30（g/mL）、超声功率 40 W、提取时间 40 min、提取温度60℃，此条件下，蟛蜞菊总黄酮的得率高达6.896%。蟛蜞菊总黄酮提取液的质量浓度越大，对·OH、DPPH·以及亚硝酸钠的清除能力就越强。当蟛蜞菊总黄酮的质量浓度为0.664 mg/mL时，对于DPPH·、·OH、NaNO2的清除率分别为 94.62%、76.29%、63.99%，即DPPH·的清除率＞·OH的清除率＞NaNO2的清除率，表明蟛蜞菊具有较强的抗氧化能力，具备了较高的药用开发应用价值，可用做医药方面和抗氧化保健品的原料，开发成具有抗氧化作用的保健食品。
[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1979：354
[2] 柯展鸿，陈雁飞，惠苗，等.南美蟛蜞菊和蟛蜞菊化感作用的比较研究[J].华南师范大学学报(自然科学版)，2014，46(1)：83-88
[3] 李兴.蟛蜞菊化学成分及抗肿瘤活性研究[D].石家庄：河北医科大学，2008
[4] 沈卓豪，刘磊，韩姣姣，等.南美蟛蜞菊花挥发油GC-MS分析及抗菌活性研究[J].中国实验方剂学杂志，2014，20(7)：54-58
[5] 任慧，徐巧林，董丽梅，等.南美蟛蜞菊中的酚酸类化学成分[J].热带亚热带植物学报，2015，23(4)：469-473
[6] 孙小茗，左晓彬，王春宇，等.蟛蜞菊内酯对对乙酰氨基酚致小鼠急性肝损伤的保护作用[J].中国比较医学杂志，2019，29(6)：86-91
[7] 陈秀清，胡亦平，林益坤，等.南美蟛蜞菊叶蛋白提取方法筛选[J].南方农业学报，2017，48(7)：1274-1279
[8] 许永.中草药提取物在卷烟中的应用研究[D].昆明：昆明理工大学，2008
[9] Sun Xiaoyang，Zhang Wen，Zhang Lifen，et al.Molecular and emulsifying properties of arachin and conarachin of peanut protein isolate from ultrasound-assisted extraction[J].LWT，2020，132(10)：109790
[10]Luis Carrillo-Hormaza，Luisa Duque，Sebastián López-Parra，et al.High-intensity ultrasound-assisted extraction of Garcinia madruno biflavonoids：Mechanism，kinetics，and productivity[J].Biochemical Engineering Journal，2020，161(9)：107676
[11]Li Yuanhui，Wu Zhenfeng，Wan Na，et al.Extraction of high-amylose starch from Radix puerariae using high-intensity low-frequency ultrasound[J].Ultrasonics Sonochemistry，2019，12(59)：104710
[12]叶红玲，姚军，刘冬，等.蓝莓果渣花青素的超声提取及组成分析[J].食品研究与开发，2019，40(10)：105-108，130
[13]李海燕，范明辉，时薛丽，等.响应面法优化当归多糖超声提取工艺研究[J].食品研究与开发，2019，40(12)：159-163
[14]许建本，苏秀芳，莫耀芳.超声波辅助法提取假苹婆树叶总黄酮及其清除羟自由基能力[J].食品工业科技，2018，39(23)：199-202，209
[15]Aadil Rana，Muhammad，Zeng Xin-An，et al.Effects of ultrasound treatments on quality of grapefruit juice[J].Food Chemistry，2013，141(3)：3201-3206
[16]马玲龙，李小爽，陆仲坤，等.芹菜素-铜(Ⅱ)配合物研制及其清除自由基活性[J].食品科技，2019，44(6)：275-281
[17]王敏，田珍燕，王蔚新.板栗壳多酚的提取及其抗氧化性能的研究[J].食品研究与开发，2018，39(22)：66-72
[18]荆常亮.紫花苜蓿总黄酮的提取、纯化及其抗氧化活性研究[D].北京：中国农业科学院，2016
[19]刘香萍，王国庆，李国良，等.响应面法优化提取紫花苜蓿叶总黄酮及其抗氧化活性研究[J].中国食品学报，2016，16(4)：145-152