亚麻籽是我国西北地区常见的油料作物之一，亚麻籽经过压榨取油后的副产物为亚麻籽饼粕，亚麻籽饼粕中蛋白含量在32%～49%之间，亚麻籽饼粕蛋白具有与大豆分离蛋白相似的氨基酸模式，含有人体所必需的8种氨基酸，是一种优质的蛋白质来源[1-3]。然而亚麻籽饼粕通常被作为动物饲料、肥料或者废料处理，这造成了资源的极大浪费。因此从亚麻籽饼粕中提取蛋白对于开发利用亚麻籽饼粕的潜在价值具有现实意义。亚麻籽蛋白中球蛋白（11 s、2 s）含量为56%～73.4%，其分子量分别约为 252 kDa～298 kDa、10 kDa～50 kDa，白蛋白（1.6 s、2 s）含量为 20%～42%，分子量为10、16 kDa～17 kDa[4-6]。植物分离蛋白具有一定的生理活性如抗氧化[7]、降血压[8]、免疫调节[9]、调节血糖[10]。
体外酶解蛋白质获得小分子肽是对蛋白进行深层次利用的方法之一，蛋白质经过体外酶解后得到小分子肽，暴露出更多的活性部位。α-淀粉酶是一种糖苷水解酶，通过水解淀粉内部的α-1，4糖苷键将淀粉水解为糊精、低聚糖和单糖，促进淀粉的消化吸收。α-淀粉酶抑制剂通过抑制唾液及肠道中淀粉酶的活性从而阻碍碳水化合物的消化吸收，降低血糖水平[11]。Vilcacundo等[12]通过体外模拟消化制备藜麦降血糖活性肽发现经十二指肠消化阶段后的酶解产物具有更高的α-淀粉酶抑制活性，张一帆等[13]酶解杨梅蛋白制得的多肽产物显示出α-糖苷酶抑制活性从而起到降血糖功能。亚麻籽蛋白经过酶解之后可提高生物活性，但是目前关于亚麻籽α-淀粉酶抑制活性肽的研究较少。
本文以亚麻籽饼粕为原料，利用Design-Expert V8.0.6软件中心组合设计，对5个主要工艺参数，即料液比、pH值、浸提温度、一次浸提时间及二次浸提时间进行响应面优化设计试验，以获取最佳提取条件。并测定了亚麻籽饼粕蛋白质及不同蛋白酶酶解产物的α-淀粉酶抑制活性，为副产物亚麻籽饼粕蛋白的提取及α-淀粉酶抑制活性肽的开发提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
亚麻籽饼粕：荣海生物科技有限公司；猪胰α-淀粉酶（13 U/mg）、3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitro salicylic acid，DNS）、可溶性淀粉、碱性蛋白酶（300 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）：上海源叶生物有限公司，其他所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
Milli-Q Integral 5型纯水仪：德国默克密理博公司；KJELTEC 8000型全自动凯式定氮仪：丹麦FOSS集团公司；THZ-92B型漩涡振荡器、HH.S11-4型电热恒温水浴锅：上海博讯实业有限公司；C-MAG HS 7型磁力搅拌器：德国IKA公司；X-30R型台式高速离心机：美国Beckman Coulter有限公司；Cary 60 UV-Vis型紫外可见分光光度计：安捷伦科技有限公司；AKTA pure型蛋白纯化仪：美国通用电气公司。
1.3 方法
1.3.1 碱提酸沉法提取亚麻籽饼粕蛋白工艺流程
方法参考文献[14-15]并略做修改，对亚麻籽饼粕蛋白的提取方法见图1。
图1 碱提酸沉法提取亚麻籽饼粕蛋白工艺流程
Fig.1 Process for extracting flaxseed cake protein by alkali extraction and acid precipitation
1.3.2 亚麻籽饼粕蛋白含量的测定
利用凯氏定氮法测定亚麻籽饼粕蛋白含量，方法参考国标GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》，转换系数设置6.25。按照式（1）计算亚麻籽饼粕蛋白的提取率。
1.3.3 亚麻籽饼粕蛋白提取的单因素试验
影响蛋白提取率的因素主要有料液比、浸提温度、pH值、一次浸提时间以及二次浸提时间。准确称取一定量的亚麻籽饼粕样品，按照以上5个因素选取不同的水平做单因素试验，提取步骤按本文1.3.1。利用凯氏定氮法测定亚麻籽饼粕蛋白含量，按照公式（1）计算蛋白的提取率。
1.3.3.1 料液比对亚麻籽饼粕蛋白提取率的影响
准确称取5.000 g亚麻籽饼粕，设置料液比为1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g/mL），50 ℃条件下，碱液（pH 9.5）一次浸提2 h，二次浸提 1 h，考察液料比对亚麻籽饼粕蛋白提取的影响。
1.3.3.2 浸提温度对亚麻籽饼粕蛋白提取率的影响
准确称取5.000 g亚麻籽饼粕，设置浸提温度为30、40、50、60、70、80 ℃，料液比 1 ∶20（g/mL）条件下，碱液（pH 9.5）一次浸提2 h，二次浸提1 h，考察浸提温度对亚麻籽饼粕蛋白提取的影响。
1.3.3.3 pH值对亚麻籽饼粕蛋白提取率的影响
准确称取5.000 g亚麻籽饼粕，设置pH值为8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5，在料液比为 1 ∶20（g/mL）、浸提温度为50℃的条件下，碱液一次浸提2 h，二次浸提1 h，考察pH值对亚麻籽饼粕蛋白提取的影响。
1.3.3.4 一次浸提时间对亚麻籽饼粕蛋白提取率的影响
准确称取5.000 g亚麻籽饼粕，设置一次浸提时间为60、80、100、120、140、160 min，在料液比为 1 ∶20（g/mL）、浸提温度为50℃的条件下，碱液（pH9.5）二次浸提1 h，考察一次浸提时间对亚麻籽饼粕蛋白提取的影响。
1.3.3.5 二次浸提时间对亚麻籽饼粕蛋白提取率的影响
准确称取5.000 g亚麻籽饼粕，设置二次浸提时间为 0、30、60、90、120、150 min，在料液比为 1 ∶20（g/mL）、浸提温度为50℃的条件下，碱液（pH 9.5）一次浸提2 h，考察二次浸提时间对亚麻籽饼粕蛋白提取的影响。
1.3.4 响应面法优化亚麻籽饼粕蛋白提取工艺试验
在单因素试验的基础上，根据中心组合设计（Box-Behnken），采用软件Design Expert V8.0.6建立五因素三水平的试验，确定亚麻籽饼粕蛋白提取的最佳工艺条件。以Y蛋白提取率为考察指标，液料比（A）、一次浸提时间（B）、温度（C）、二次浸提时间（D）以及pH值（E）为自变量，用+1、0、-1分别代表自变量的水平，亚麻籽饼粕蛋白提取率为响应值，因素水平编码见表1。
表1 响应面设计因素水平编码表
Table 1 Response surface design factor level coding table
水平因素A料液比/（g/mL）B一次浸提时间/min C温度/℃ D二次浸提时间/min E pH值-1 1∶15 100 40 40 9 0 1∶20 120 50 60 9.5 1 1∶25 140 60 80 10
1.3.5 亚麻籽蛋白酶解产物制备
采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、复合酶1（碱性蛋白酶 ∶胰蛋白酶=1 ∶1，酶活比）、复合酶 2（胰蛋白酶∶中性蛋白酶=1∶1，酶活比）和复合酶3（碱性蛋白酶∶中性蛋白酶=1∶1，酶活比）对亚麻籽提取蛋白进行液态酶解，料液比为1∶20（g/mL），蛋白酶用量为4 500 U/g蛋白，分别在蛋白酶的最适温度和pH值条件下酶解6 h，并在酶解过程中调整pH值，酶解结束后85℃加热15 min灭酶，并将酶解液4 500 r/min离心30 min取上清，冷冻干燥，制得亚麻籽蛋白酶解产物。亚麻籽蛋白酶解用酶见表2。
表2 亚麻籽蛋白酶解用酶
Table 2 Enzymes for the hydrolysis of flaxseed protease
酶种类用量/（U/g蛋白）碱性蛋白酶 4 500中性蛋白酶 4 500胰蛋白酶 4 500复合酶 1 4 500（碱∶胰=1∶1，酶活比）复合酶 2 4 500（胰∶中=1∶1，酶活比）复合酶 3 4 500（碱∶中=1∶1，酶活比）
1.3.6 α-淀粉酶抑制活性
参照参考文献[16]的方法分别测定亚麻籽饼粕蛋白和酶解产物α-淀粉酶的抑制活性，将0.25 mL抑制剂和0.25 mL α-淀粉酶液加入到0.5 mL磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 6.9） 溶液中，37 ℃水浴10 min后，加入0.5 mL 1%的可溶性淀粉，精确反应5 min后加入1 mL DNS试剂，100℃水浴10 min后迅速冷却，加入5 mL超纯水，在540 nm波长下测定其吸光度，测定过程中设置空白对照管、抑制对照管和空白管。按照式（2）计算α-淀粉酶抑制率。
式中：A1、A2、A3和 A4分别为空白管、空白对照管、抑制管和抑制对照管在540 nm下的吸光度值。
1.3.7 酶解产物分子量分布
凝胶色谱法测定酶解产物的分子量分布，采用仪器为GE AKTA pure蛋白纯化系统，色谱柱型号为SuperdexTM30increase10/300GL，流动相：50 mmol/L 磷酸盐缓冲液pH6.8，流速：0.5 mL/min，等度洗脱，检测波长：280 nm。标准品分子量分别为 75、43、29、13.7、6.5 kDa，酶解产物的上样浓度为10 mg/mL，上样体积设置为100 μL。
1.4 数据分析
采用SPSS 25.0软件进行数据分析。试验数据以平均值±标准差表示（通过3次平行试验），以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 亚麻籽饼粕蛋白提取的单因素试验结果
试验研究了亚麻籽饼粕粉料液比、浸提温度、pH值、一次浸提时间和二次浸提时间对碱提-酸沉法提取亚麻籽饼粕蛋白质的影响，结果如图2～图4所示。
图2 料液比对亚麻籽饼粕蛋白提取率的影响
Fig.2 Relationship between ratio of flaxseed cake to solution and extraction rate of flaxseed cake protein
图3 温度和pH值对亚麻籽饼粕蛋白提取率的影响
Fig.3 Effects of temperature and pH on protein extraction rate of flaxseed cake
图4 浸提时间对亚麻籽饼粕蛋白提取率的影响
Fig.4 Effect of extraction time on protein extraction rate of flaxseed cake
如图2所示，亚麻籽饼粕蛋白提取率随着溶剂体积的增大而逐渐增加。在料液比为1∶10（g/mL）时，由于溶液的黏度较大，分子扩散速率较低，体系分散不均匀，导致体系pH值不均匀，影响了蛋白质的溶出，因此，蛋白的提取率较低[17]。当料液比为 1∶20（g/mL）时蛋白的提取率达到最大值，此后随着溶剂体积的增大蛋白的提取率已逐渐降低。因此，最佳料液比确定为1 ∶20（g/mL）。
由图3可知，浸提温度对亚麻籽饼粕蛋白的提取率有较大的影响。在30℃～50℃之间，亚麻籽饼粕蛋白的提取率随着浸提温度的增加而增加，当浸提温度达到50℃时，蛋白的提取率最大；当温度继续升高时，蛋白的提取率反而逐渐下降，这可能是随着浸提温度的升高，有些蛋白的空间构象发生了变化而致其变性，蛋白的提取率降低。因此，最佳浸提温度确定为50℃。pH值对亚麻籽饼粕蛋白的提取率的影响呈现先升后降的趋势。在pH 9.5时，蛋白的提取率达到最大值。当pH值继续增加时，蛋白质的提取率反而会下降，这可能是由于过高的pH值导致部分蛋白质发生变性，从而导致蛋白质的提取率下降。因此，最佳pH值确定为9.5。
由图4可知，随着提取时间增长蛋白质的提取率逐渐增加，一次浸提时间在120 min，二次浸提时间在60 min时，继续延长提取时间，蛋白质的提取率增幅变化较小，因此确定一次浸提时间为120 min，二次浸提时间为60 min。
2.2 响应面法优化亚麻籽饼粕蛋白质提取工艺试验结果
2.2.1 试验设计与试验结果
采用五因素三水平的响应面法对亚麻籽饼粕蛋白质提取工艺条件进行优化，响应面的设计及结果如表3所示。
表3 响应面法试验设计与试验结果
Table 3 Respond surface experimental design and results
编号 提取率/%料液比 一次浸提时间 温度 二次浸提时间 pH值1 0 -1 0 0 -1 62.72 2 1 0 0 0 1 74.46 3 0 0 0 -1 -1 71.75 4 0 1 1 0 0 83.93 5 -1 -1 0 0 0 73.55 6 0 0 1 -1 0 70.40 7 0 1 0 0 -1 82.58 8 0 -1 0 1 0 71.30 9 1 0 0 -1 0 73.10 10 -1 1 0 0 0 76.26 11 0 -1 0 0 1 73.55 12 0 1 0 1 0 74.91 13 -1 0 1 0 0 71.75 14 1 0 1 0 0 74.01 15 1 0 0 0 -1 73.55 16 -1 0 0 0 -1 72.65 17 0 0 1 0 -1 65.43 18 1 0 0 1 0 74.91 19 1 -1 0 0 0 74.46 20 0 0 0 0 0 88.00 21 0 -1 -1 0 0 69.94 22 0 0 0 -1 1 77.62 23 1 1 0 0 0 73.55 24 0 0 0 0 0 87.31 25 0 0 0 0 0 78.32 26 0 0 -1 0 -1 60.92 27 0 1 0 0 1 74.91 28 0 1 0 -1 0 64.98 29 0 -1 0 -1 0 75.81 30 -1 0 0 0 1 76.26 31 -1 0 0 -1 0 78.52 32 -1 0 0 1 0 75.36 33 -1 0 -1 0 0 73.55 34 0 0 -1 -1 0 71.75 35 0 0 0 0 0 87.48 36 0 0 -1 1 0 75.81 37 0 0 1 0 1 74.46 38 0 0 -1 0 0 74.01 39 0 0 1 1 0 76.26 40 0 0 0 1 -1 71.30 41 0 -1 1 0 0 60.47 42 0 0 0 1 1 74.91 43 0 0 -1 0 1 75.81 44 0 0 0 0 0 88.00 45 0 1 -1 0 0 67.69 46 0 0 0 0 0 86.49
2.2.2 模型回归方程的建立及各因素对亚麻籽饼粕蛋白质提取率的影响
利用Design-Expert V8.0.6软件进行多元回归拟合，得到回归模型方程：Y/%=85.93-0.37A+2.31B+0.45C+0.68D+2.57E-0.90AB+0.45AC+1.24AD-0.68AE+6.43BC+3.61BD-4.63BE+0.45CD-1.47CE-0.56DE-4.62A2-7.06B2-8.26C2-5.56D2-6.87E2。
对该模型进行显著性检验以及模型回归方程的方差分析结果见表4。
表4 模型回归方程方差分析
Table 4 Variance analysis of model regression equation
注：*** 表示差异高度显著，P＜0.001；** 表示差异极显著，P＜0.01。
方差来源 平方和 自由度 均平方 F值 P值 显著性水平模型 1 500.58 20 75.03 4.94 0.000 1 ***A料液比 2.15 1 2.15 0.14 0.709 7 B一次浸提时间 85.59 1 85.59 5.64 0.025 5 **C温度 3.26 1 3.26 0.21 0.647 1 D二次浸提时间 7.33 1 7.33 0.48 0.493 4 E pH值 105.40 1 105.40 6.95 0.014 2 **AB 3.26 1 3.26 0.21 0.647 1 AC 0.81 1 0.81 0.054 0.818 7 AD 6.16 1 6.16 0.41 0.529 8 AE 1.83 1 1.83 0.12 0.731 1 BC 165.42 1 165.42 10.90 0.002 9 **BD 52.14 1 52.14 3.44 0.075 7 BE 85.59 1 85.59 5.64 0.025 5 **CD 0.81 1 0.81 0.054 0.818 7 CE 8.60 1 8.60 0.57 0.458 5 DE 1.27 1 1.27 0.084 0.774 5 A2 186.04 1 186.04 12.26 0.001 8 **B2 435.19 1 435.19 28.67＜0.000 1 ***C2 596.16 1 596.16 39.28＜0.000 1 ***D2 269.53 1 269.53 17.76 0.000 3 ***E2 412.32 1 412.32 27.17＜0.000 1 ***残差 379.42 25 15.18失拟 308.32 20 15.42 1.08 0.513 1不显著纯误差 71.10 5 14.22总和 1 880.00 45 75.03 4.94 0.000 1
用各因素的F值评价该因素对试验指标的影响，F值越大，表明该因素的影响越显著，5个因素对亚麻籽饼粕蛋白质提取率的影响为：E＞B＞D＞C＞A。回归模型的 F 值为 4.94，P 值（0.000 1）小于 0.001，表明所得模型是极显著的。模拟误差失拟项中P值大于0.05，该模型失拟不显著，说明该方程对试验拟合度较好，可靠性较高。应用该回归模型能够对亚麻籽饼粕蛋白质提取效果进行比较好的分析预测。
2.2.3 响应面数据分析及最优条件的确定
响应曲面的坡度可以反应该因素对蛋白质提取率的相关条件的敏感度高低[18]。等高线反映了各因素之间交互作用的强弱[19]，椭圆形等高线表明两因素之间的交互作用比较显著，而圆形等高线则表示两因素之间交互作用不显著[20]。不同考察因素对亚麻籽饼粕蛋白质提取率交互影响的响应曲面和等高线见图5。
图5 不同考察因素对亚麻籽饼粕蛋白质提取率交互影响的响应曲面和等高线
Fig.5 Response surfaces and contours of the interaction effects of different investigation factors on the extraction rate of flaxseed cake
由图5可知，一次浸提时间和pH值之间以及一次浸提时间和温度之间均存在显著的交互作用。
碱提-酸沉法是提取蛋白质的常用方法，该方法操作过程简单，蛋白质提取率高，能够除去饼粕中水溶性糖分、纤维素、淀粉这些主要杂质，有研究[21]表明通过碱提-酸沉可同时除去亚麻籽饼粕中生氰糖苷和植酸等含量较低的抗营养因子，脱除率分别可达92.30%和82.49%。因此采用碱提-酸沉法可制备得到低氰苷和低植酸的亚麻籽饼粕蛋白质。
通过Design-Expert 8.0.6软件优化得到亚麻籽饼粕蛋白质的最佳提取条件：料液比为1∶19.77（g/mL），一次浸提时间为124.23 min，温度为51.03℃，二次浸提时间为62.48 min，pH 9.55。在此试验条件下，提取率为86.38%。按照试验的可操作性，将最佳试验条件调整为料液比为1∶20（g/mL），一次浸提时间为120 min，温度为50℃，二次浸提时间为60 min，pH 9.5。通过3次平行试验，测得最佳试验条件下亚麻籽饼粕蛋白质的提取率为（83.27±3.00）%。另外，与许光映等[22]的研究结果（51.65%）相比，明显提高了蛋白质的提取率，说明该提取工艺条件具有相对优势。因此，可以得知通过响应面法优化得到的模型回归方程及最佳试验条件可靠。
目前提取亚麻籽蛋白质的方法通常是对亚麻籽进行脱胶和脱脂的前处理后提取蛋白质，前处理过程不仅造成了能源消耗并且提取的蛋白质含量仅在30%左右，提取率较低[23]。本试验采用油脂加工副产物饼粕为原料提取其蛋白质，提取率达到83.27%，极大的提高了亚麻籽蛋白质的提取率，增加了工业副产物-亚麻籽饼粕的附加价值。
2.3 α-淀粉酶抑制活性
蛋白质作为淀粉酶的抑制剂时通常作为淀粉模拟物[24]或与α-淀粉酶结合产生特殊结构[25]造成酶失活，此类α-淀粉酶抑制剂多发现于芸豆、小麦以及高粱中，在亚麻籽中鲜有报道。亚麻籽蛋白质及不同酶的酶解物对α-淀粉酶抑制活性见图6。
由图6可知，亚麻籽饼粕蛋白质具有α-淀粉酶抑制活性，当亚麻籽饼粕蛋白质经过酶解后，其酶解产物的α-淀粉酶抑制活性显著提高。采用单酶及复合酶对亚麻籽饼粕蛋白质进行酶解后发现，碱性蛋白酶酶解产物的α-淀粉酶抑制活性较高，复合酶与碱性蛋白酶相比并无显著增加效果。碱性蛋白酶为内肽酶，亚麻籽蛋白质经碱性蛋白酶酶解后能够生成相对分子量较小的肽，蛋白质结构内部疏水基团暴露，这些疏水性基团更容易与酶的活性部位结合，表现出生物活性。
不同酶解产物分子量分布见图7。
图6 亚麻籽蛋白质及不同酶的酶解物对α-淀粉酶抑制活性
Fig.6 Inhibition of α-amylase of flaxseed cake protein and enzymatic hydrolysate
图7 不同酶解产物分子量分布
Fig.7 Molecular weight distribution of different enzymatic hydrolysis products
由碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶的酶解产物分子量分布试验结果发现，碱性蛋白酶酶解产物中低分子量（＜6.5 kDa）肽含量最高，达 83.4%。Vilcacundo等[26]通过体外模拟消化藜麦蛋白质发现分子量小于5 kDa的多肽与藜麦蛋白质相比具有更高的α-淀粉酶抑制活性。亚麻籽蛋白质碱性蛋白酶酶解产物的高比例低分子量肽与其较强的α-淀粉酶抑制活性有关[27]。
3 结论
本试验以油脂加工副产物亚麻籽饼粕为原料，利用碱提-酸沉法提取亚麻籽饼粕蛋白质，在一次浸提的基础上，添加了二次浸提，明显提高了蛋白质的提取率。利用响应面法建立了提取工艺条件的二次项模型，通过方差分析，得知该模型显著，所得回归方程拟合度较好。影响亚麻籽饼粕蛋白质提取率的各因素顺序大小为pH值＞一次浸提时间＞二次浸提时间＞温度＞料液比。最佳提取工艺条件是：pH 9.5，料液比1∶20（g/mL），温度50℃，一次浸提时间120 min以及二次浸提时间60 min。在此试验条件下，测得亚麻籽饼粕蛋白质的提取率为83.27%，说明通过响应曲面法得到的模型回归方程可以较好的预测试验结果。亚麻籽蛋白质经过碱性蛋白酶酶解得到的产物具有α-淀粉酶抑制活性，提高了亚麻籽饼粕蛋白质及其酶解物的附加价值。
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