树莓（Rubus idaeus Linn.）是蔷薇科（Rusaceae）悬钩子属（Rubus L.）植物[1]，又名覆盆子、马林、托盘等，被人们称为“黄金水果”、“植物界的阿司匹林”[2]。根据植株的生长特点和果实的颜色，将树莓分为黄树莓、红树莓、黑树莓和紫树莓这4大类[3]。黄树莓的成熟果较甜，可溶性糖含量明显高于红树莓（“费尔杜德”、“哈瑞太兹”、“红玉”等）成熟果[4]。黄树莓果实中挥发性香气成分萜烯及醇酮类物质含量显著高于“海伦”红树莓[5]，具有潜在的香水、香料等产品开发前景。此外，随着人们对抗氧化延缓衰老食品的需求，鲜食果实的抗氧化性研究倍受关注。在植物体内，自由基会引起细胞的氧化衰老，为此，植物体内存在抗氧化衰老的清除自由基的系统，包括抗氧化酶和抗氧化物质，其中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）与过氧化物酶（peroxidase，POD）构成保护酶系统，通过SOD催化H+和O2-·（超氧阴离子自由基）生成H2O2（过氧化氢）与O2，H2O2被CAT或者POD催化生成O2与H2O，从而减轻或降低活性氧自由基对细胞的伤害[6-7]；自由基是引发慢性疾病的重要因素，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）是一类较为稳定的自由基，对DPPH自由基的清除率常被作为评估抗氧化能力的重要指标[8]，在一定程度上能体现抗氧化物质总酚的抗氧化能力[9]，而总酚含量与抗氧化能力显著相关[10-12]。前人阐明了不同发育时期的红树莓[13-14]、桑葚[15-16]、刺梨[17]、巴西樱桃[18]、桃[19]等的抗氧化酶活性变化规律，对这些植物的开发利用有理论指导价值，而关于黄树莓果实从青果到黄红果不同发育时期果实的抗氧化性尚未见报道。本试验以“橙色奇迹”黄树莓不同发育时期的果实为试材，对抗氧化酶活性、总酚含量及其对DPPH自由基的清除率进行研究，旨在阐明不同发育时期黄树莓果实的抗氧化特性，以期为进一步根据黄树莓果实的抗氧化特点进行适时采收及研发抗氧化衰老的产品提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为“橙色奇迹”黄树莓果实，采自河北省廊坊市永清县树莓基地，采摘4个不同发育时期的果实，依次为青果、白果、黄果、黄红果，经过液氮速冻，转至-80℃超低温冰箱保存。
1.2 仪器与设备
Thermo scientific ST 8R高速冷冻离心机：德国赛默飞世尔有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；OHAUS CP114电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；HH-6数显恒温水浴锅：金坛市杰瑞尔电器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 “橙色奇迹”黄树莓果实抗氧化酶活性的测定方法
参照李文欣等[13]的方法测定黄树莓果实的抗氧化酶活性。称取青果、白果、黄果、黄红果各0.3 g（3次重复），放入低温预冷的研钵中，用移液器快速加1 mL 50 mmol/L pH 7.8磷酸缓冲液（4℃存放）入研钵中，快速研磨至匀浆状态，迅速转移至低温预冷的离心管中，快速加入1 mL 50 mmol/L pH 7.8磷酸缓冲液（4℃存放）淋洗研钵并迅速转移至低温预冷的离心管中，重复淋洗一次，配平，将离心管在12 000 r/min和4℃的条件下离心30 min，离心结束后，轻轻倒出上清液，量取上清液体积，放到4℃条件下待用。运用分光光度计测定CAT、POD及SOD活性，所用方法依次为过氧化氢法（一个CAT活性单位以每分钟吸光度值变化0.1来表示）、愈创木酚法（一个POD活性单位以每分钟吸光度值变化0.1来表示）、氮蓝四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）光还原法（一个酶活力单位是以抑制NBT光还原的50%的酶液量来表示）。
1.3.2 “橙色奇迹”黄树莓果实总酚含量及DPPH自由基清除率的测定方法
1）参考李文欣等[13]的方法进行总酚的提取及测定。使用提取液为25%的盐酸-乙醇溶液，在70℃条件下回流提取0.5 h，过滤至刻度试管，4℃条件保存备用。配制 0、10、20、30、40 mg/L 的没食子酸标准品溶液，分别加入0.1 mL福林酚试剂、1 mL各浓度的没食子酸标准品溶液，25℃下暗反应5 min，再加入1 mol/L Na2CO30.2 mL，用蒸馏水定容至3 mL，混匀后50℃水浴0.5 h，运用分光光度计在760 nm下测其OD值，制作标准曲线。
2）样品总酚含量的测定：称取样品0.2 g，待测液同样按上述方法进行测定，利用标准曲线所得的方程求得总酚含量。
3）DPPH自由基清除率的测定参照Ikram Ilahi等[8]的方法稍有改动，根据总酚含量测定方法得到总酚待测液，称取2 mg DPPH粉末，用无水乙醇定容至200 mL容量瓶，配制成0.01 mg/L DPPH-乙醇溶液，4℃保存。取2 mL 0.01 mg/L DPPH-乙醇溶液和1 mL无水乙醇，混匀后运用分光光度计在517 nm下测得吸光值A0，取2.9 mL无水乙醇和0.1 mL总酚待测液，混匀后在517 nm下测得吸光值A1，取2 mL 0.01 mg/L DPPH-乙醇溶液、0.9 mL无水乙醇和0.1 mL总酚提取液，混匀后在517 nm下测得A2。清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100。
1.4 数据处理
使用Excel软件制作柱形图；使用DPS数据处理系统，选择单因素的Duncan新复极差法，对数据进行差异显著性分析；使用SPSS软件进行相关性分析。
2 结果与分析
2.1 “橙色奇迹”黄树莓果实不同发育时期抗氧化酶活性的研究
2.1.1 “橙色奇迹”黄树莓果实不同发育时期超氧化物歧化酶活性的变化
“橙色奇迹”黄树莓不同发育时期果实的超氧化物歧化酶活性如图1所示。
由图1可知，“橙色奇迹”黄树莓不同发育时期果实的SOD活性在4.00 U/（g·min）FW～35.58 U/（g·min）FW之间，整体呈现上升趋势。黄红果的SOD活性最高，为35.58 U/（g·min）FW，极显著（p＜0.01）高于其他3个时期；其他3个时期差异均为极显著，其中青果的SOD活性最低，为4.00 U/（g·min）FW。
2.1.2 “橙色奇迹”黄树莓果实不同发育时期过氧化氢酶活性的变化
“橙色奇迹”黄树莓不同发育时期果实的过氧化氢酶活性如图2所示。
图1 “橙色奇迹”黄树莓不同发育时期的果实超氧化物歧化酶的活性
Fig.1 The activity of superoxide dismutase in fruit of'orange miracle'yellow raspberry at different developmental stages
不同小写字母表示0.05水平下差异显著；不同大写字母表示0.01水平下差异显著。
图2 “橙色奇迹”黄树莓不同发育时期果实的过氧化氢酶的活性
Fig.2 Catalase activity of‘orange miracle’yellow raspberry fruit at different developmental stages
不同小写字母表示0.05水平下差异显著；不同大写字母表示0.01水平下差异显著。
由图2可知，“橙色奇迹”黄树莓不同发育时期果实的CAT活性在3.17 U/（g·min）FW～11.69 U/（g·min）FW之间，整体呈现先上升再下降的趋势。其中白果的CAT活性最高，为11.69 U/（g·min）FW，极显著（p＜0.01）高于其他3个时期，其他3个时期之间无显著性差别。
2.1.3 “橙色奇迹”黄树莓不同发育时期果实过氧化物酶活性的影响
“橙色奇迹”黄树莓不同发育时期果实的过氧化物酶活性如图3所示。
由图3可知，“橙色奇迹”黄树莓不同发育时期果实的POD活性在2.27 U/（g·min）FW～20.51 U/（g·min）FW之间，整体呈现下降趋势。青果的POD活性最高，为20.51 U/（min·g）FW，极显著（p＜0.01）高于其他3个时期；白果与黄果存在显著性差异（p＜0.05）；黄红果的POD含量最低，为2.27 U/（min·g）FW，极显著（p＜0.01）低于其他3个时期。
图3 “橙色奇迹”黄树莓不同发育时期果实的过氧化物酶的活性
Fig.3 Peroxidase activity of‘orange miracle’yellow raspberry fruit at different developmental stages
不同小写字母表示0.05水平下差异显著；不同大写字母表示0.01水平下差异显著。
2.2 “橙色奇迹”黄树莓不同发育时期果实的总酚含量的影响
“橙色奇迹”黄树莓不同发育时期果实的总酚含量如图4所示。
图4 “橙色奇迹”黄树莓不同发育时期果实的总酚含量
Fig.4 The total phenolic content of‘orange miracle’yellow raspberry fruit at different developmental stages
不同小写字母表示0.05水平下差异显著；不同大写字母表示0.01水平下差异显著。
由图4可知，“橙色奇迹”黄树莓不同发育时期果实的总酚含量在16.56 mg/g FW～29.30 mg/g FW之间，整体呈现先下降再上升的趋势。青果的总酚含量最高，为 29.30 mg/g FW，极显著（p＜0.01）高于其他 3个时期；黄红果的总酚含量仅次于青果，与其他3个时期差异极显著（p＜0.01）；白果与黄果无显著性差异。
2.3 “橙色奇迹”黄树莓不同发育时期果实的总酚提取液清除DPPH自由基能力的研究
“橙色奇迹”黄树莓不同发育时期果实的总酚提取液清除DPPH自由基能力如图5所示。
由图5可知，“橙色奇迹”黄树莓不同发育时期果实的总酚提取液清除DPPH自由基能力在10.21%～50.37%之间，整体呈现先下降再上升的趋势。青果的总酚提取液对DPPH自由基的清除率最高，为50.37%，极显著（p＜0.01）高于其他3个时期；白果与黄红果之间无显著性差别；黄果的总酚提取液清除DPPH自由基能力最低，为10.21%，极显著（p＜0.01）低于其他3个时期。
图5 “橙色奇迹”黄树莓不同发育时期果实的总酚提取液清除DPPH自由基能力
Fig.5 The ability of total phenolic extracts from‘orange miracle’yellow raspberry fruit at different developmental stages to scavenge DPPH free radicals
不同小写字母表示0.05水平下差异显著；不同大写字母表示0.01水平下差异显著。
3 讨论与结论
植物对于活性氧有两套防御系统，分别为保护酶系统（SOD、CAT、POD等）以及天然的非酶自由基清除剂（酚类、胡萝卜素、维生素C等）[20]。本课题组前期研究表明“海尔特兹”红树莓果实发育过程中的SOD活性、CAT活性、POD活性最高的时期依次为深红果36.99 U/（g·min）FW，黄果41.12 U/（g·min）FW，青果9.83 U/（g·min）FW[13]；本研究中“橙色奇迹”黄树莓不同发育时期的果实中，黄红果的SOD活性最高，为35.58 U/（g·min）FW，白果的CAT活性最高，为11.69 U/（g·min）FW，青果的POD活性最高，为20.51 U/（g·min）FW；综上所述，“海尔特兹”红树莓和“橙色奇迹”黄树莓果实成熟过程中抗氧化酶活性的变化趋势一致，即SOD活性连续上升、CAT活性先上升后下降、POD活性持续下降；POD、CAT、SOD依次在果实发育初期、中期、后期的抗氧化能力最强；成熟果中较高的SOD活性增强了果实的抗氧化能力，降低了自由基对果实的伤害，同时提升了鲜食果实的营养保健价值，因此，在黄红果时期采摘可获得SOD酶活性高、抗氧化能力强的黄树莓果实。此外，本研究表明“橙色奇迹”黄树莓果实从青果到黄红果的发育过程中，总酚含量及其清除DPPH自由基的能力整体都呈现先下降再上升的趋势，青果的总酚含量及清除DPPH自由基的能力均为最高，因此在青果时期采摘可获得酚类物质含量高且抗氧化能力强的黄树莓果实；Giovana Bonat Celli等[18]研究表明在巴西樱桃红色品种的果实发育过程中，青果时期的总酚含量与清除DPPH自由基的能力均为最高；朱明涛等[19]研究表明桃果实中总酚含量和清除DPPH自由基的能力随着果实的发育呈现逐渐下降趋势；即黄树莓、巴西樱桃红色、桃在果实发育过程中均为青果（幼果）的总酚含量与清除DPPH自由基的能力最高，说明幼果通过酚类物质清除自由基起到抗氧化的作用，这为人类开发利用幼果酚类物质的药用价值奠定基础。
综上所述，抗氧化酶与抗氧化物质总酚是“橙色奇迹”黄树莓自身的两套不同的抗氧化机制，果实在不同的发育时期通过不同的抗氧化机制达到抗氧化目的，人们可根据需求确定采收期，本文可为“橙色奇迹”黄树莓果实抗氧化食品的研发以及适时采收提供一定的理论依据。
[1] 姜河，修英涛，蔡骞.我国树莓发展现状及产业化前景分析[J].辽宁农业科学，2006(2)：45-48
[2]侯帅.寒地树莓不同品种生物学特性及产量品质性状研究[D].北京：中国农业科学院，2013
[3] 杨静.树莓的产业化综合发展[J].食品研究与开发，2015，36(23)：5
[4] 李鹏举.绥化地区引种树莓农艺学性状调查及评价[D].哈尔滨：东北农业大学，2018
[5] 吴继军，肖更生，徐玉娟，等.红树莓与黄树莓挥发性成分差异研究[J].食品研究与开发，2014，35(22)：90-93
[6] 韩涛，赵宏伟，贾琰，等.孕穗期低温胁迫对寒地粳稻功能叶片SOD、POD 和 CAT 活性的影响[J].吉林农业科学，2015，40(6)：21-25
[7]Stanley R Terlecky，Laura J Terlecky，Courtney R Giordano.Peroxisomes，oxidative stress，and inflammation[J].World Journal of Biological Chemistry，2012，3(5)：93-97
[8] Ilahi I，Samar S，Khan I，et al.In vitro antioxidant activities of four medicinal plants on the basis of DPPH free radical scavenging[J].Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences，2013，26(5)：949-952
[9] 黄春辉，廖光联，谢敏，等.不同猕猴桃品种果实发育过程中总酚和类黄酮含量及抗氧化活性的动态变化[J].果树学报，2019，36(2)：174-184
[10]Noreen H，Semmar N，Farman M，et al.Measurement of total phenolic content and antioxidant activity of aerial parts of medicinal plant Coronopus Didymus[J].Asian Pacific Journal of Tropical Medicine，2017，10(8)：792-801
[11]Um M，Shin G J，Lee J W.Extraction of total phenolic compounds from yellow poplar hydrolysate and evaluation of their antioxidant activities[J].Industrial Crops and Products，2017，97：574-581
[12]夏乐晗，陈玉玲，冯义彬，等.不同品种杏果实发育过程中类黄酮、总酚和三萜酸含量及抗氧化性研究[J].果树学报，2016，33(4)：425-435
[13]李文欣，李程，史瑞基，等.不同品种红树莓果实发育过程中抗氧化性的研究[J].河北农业大学学报，2018，41(3)：67-71
[14]Teng H，Fang T，Lin Q Y，et al.Red raspberry and its anthocyanins：Bioactivity beyond antioxidant capacity[J].Trends in Food Science&Technology，2017，66：153-165
[15]张秀梅，刘玉革，朱祝英，等.不同成熟度桑葚果实和叶片的多酚、黄酮和抗氧化性研究[J].果树学报，2014，31(4)：660-666
[16]刘和平，张广明，胡会刚，等.桑果发育期生物活性物质含量及抗氧化酶活性的变化[J].现代食品科技，2018，34(11)：103-110，27
[17]周广志，鲁敏，安华明.刺梨果实发育过程中主要活性物质含量及其抗氧化性分析[J].食品科学，2018，39(22)：20-25
[18]Celli G B，Pereira-Netto A B，Beta T.Comparative analysis of total phenolic content，antioxidant activity，and flavonoids profile of fruits from two varieties of Brazilian cherry(Eugenia uniflora L.)throughout the fruit developmental stages[J].Food Research International，2011，44(8)：2442-2451
[19]朱明涛，余俊，高瑞汝，等.桃果实不同成熟期总酚含量的变化及其抗氧化活性[J].北方园艺，2017(5)：31-34
[20]潘瑞炽.植物生理学[M].北京：高等教育出版社，2012：322-323