鱼肝油是一种从深海鱼的肝脏中提炼出来的脂肪油，富含维生素A、维生素D3及多种不饱和脂肪酸，研究显示鱼肝油中的n-3系列脂肪酸具有提高免疫力、预防和治疗心脑血管疾病的功效[1-3]。其中二十二碳六烯酸（docoxahexaenoic acid，DHA）除有以上功效外，还具有促进婴幼儿智力发育、提高记忆力、抗衰老以及防治过敏性皮炎等作用[4]。但是大量研究表明富含不饱和脂肪酸的油脂极易在加工、贮藏和食用过程中发生脂质氧化，所产生的氧化产物不仅对色泽、风味和质地等食品感官品质造成不良影响，而且还会降低食品的营养价值[5-6]。因此抑制脂质氧化成为脂类食品的重要问题。
迷迭香（Rosmarinus officinalis L.）是目前广泛应用的天然香料植物之一，已被证实具有抗菌、消炎、抗肿瘤等多种生理活性功能[7-8]。因其具有良好的抗氧化活性，且安全性高，被广泛用作动植物油脂、油炸面制品、肉及加工肉制品等食品的添加剂[9-11]。因此，本试验分别采用 FeSO4/VC和偶氮二异庚腈[2，2'-azobis（2，4-dimethylvaleronitrile），AMVN]诱导鱼肝油氧化，研究迷迭香提取物对鱼肝油氧化的抑制作用，同时测定迷迭香提取物对模拟胃肠道消化过程中脂质氧化的抑制作用，以期为控制脂质氧化提供新思路和新发展。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
鱼肝油：挪威Nycomed有限公司；迷迭香：亳州市雅丽百花茶有限公司；胃蛋白酶（50 000 U/mL）、胰酶（800 U/mL）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：美国Sigma公司；偶氮二异庚腈（AMVN）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；VC、FeSO4·7H2O：天津市大茂化学试剂厂；丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒：南京建成生物工程研究所；胆汁盐：上海源叶生物科技有限公司。
Agilent7890B型气相色谱仪、HP-88色谱柱（100 m×0.25 mm×0.2 μm）：美国 Agilent Technologies有限公司；Multiskan GO型全波长酶标仪：美国Thermo Fisher Scientific公司；VCX750型超声仪：美国Sonics公司；C012型多功能料理机：九阳股份有限公司；HH-S6型电热恒温水浴锅：北京科伟永兴仪器有限公司；XD-52AA型旋转蒸发仪：上海贤德实验仪器有限公司；BSA224S-CW电子天平：德国Sartorius公司。
1.2 试验方法
1.2.1 迷迭香提取物的制备
参考Andrade等[12]的方法，并略做修改。将迷迭香干叶用多功能料理机进行粉碎。称取100 g干粉，加入400 mL 80%乙醇溶液，混匀后室温（25℃）浸提2 h，过滤得上清液，连续提取2次，合并滤液，即得迷迭香粗提液。然后将粗提液于40℃旋转蒸发，所得浓缩液真空冷冻干燥24 h得到迷迭香提取物，研磨，过100目筛后置于-18℃冰箱备用。
1.2.2 鱼肝油脂肪酸含量测定
将鱼肝油进行甲酯化反应，采用气相色谱测定其脂肪酸含量[13]。气相色谱条件为色谱柱：HP-88（100 m×0.25 mm×0.2 μm）；进样口温度：270℃；检测器温度：280℃；载气：氮气（99.999%）；进样方式：分流进样[分流比 =（柱流量+分流出口流量）/柱流量，100∶1（体积比）]；升温程序：初温 100℃，保持 13 min，以10℃/min升至180℃，保持6 min，以1℃/min升至200℃，保持20 min，以4℃/min升至230℃，保持10.5 min；进样量：1.0 μL。
1.2.3 迷迭香提取物对FeSO4/VC诱导鱼肝油氧化的影响
配制终浓度为2 mg/mL的鱼肝油（乙醇溶解），加入 100 μL 不同浓度（终浓度分别为 10、20、50、100、200、500 μg/mL）的迷迭香提取物溶液，混匀后再分别加入终浓度为5 mmol/L的FeSO4和500 μmol/L的VC，反应总体积为1 mL，封口后于37℃水浴避光反应4 h。反应结束后，采用MDA试剂盒测定样品中MDA含量表示鱼肝油脂质氧化水平，结果表示为nmol/mL。
1.2.4 迷迭香提取物对AMVN诱导鱼肝油氧化的影响
配制终浓度为2 mg/mL的鱼肝油，加入100 μL不同浓度（终浓度分别为 10、20、50、100、200、500 μg/mL）的迷迭香提取物溶液，混匀后再加入终浓度为1 mmol/L的AMVN（甲醇溶解），反应总体积为1 mL，封口后于37℃水浴避光反应12 h。反应结束后，以MDA含量评价鱼肝油脂质氧化水平。
1.2.5 鱼肝油乳液制备
将鱼肝油与Tween 20按10∶1（体积比）比例进行混匀，采用超声波在冰浴条件下对其进行均质，具体条件为：功率225 W，均质时间5 min，其中每工作4 s停顿2 s。
1.2.6 模拟胃肠道消化
参考Minekus等[14]的方法制备消化液并对鱼肝油乳液进行消化处理。
1）模拟胃液：各物质终浓度分别为6.9 mmol/L KCl、0.9 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L NaHCO3、47.2 mmol/L NaCl、0.1 mmol/L MgCl2·6H2O、0.5 mmol/L（NH4）2CO3，1 mol/L HCl溶液调节pH 3.0。
2）模拟肠液：各物质终浓度分别为6.8 mmol/L KCl、0.8 mmol/L KH2PO4、84 mmol/L NaHCO3、38.4 mmol/L NaCl、0.33 mmol/L MgCl2·6H2O，1 mol/L NaOH 溶液调节pH 7.0。
3）模拟胃消化样品制备：分别取150 mL模拟胃液、10 μL CaCl2溶液（0.3 mol/L）、22 mL 鱼肝油乳液、3.2 mL胃蛋白酶原液（50 000 U/mL）和 200 μL不同浓度（0、0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL）以去离子水为溶剂的迷迭香提取物溶液并混匀，用1 mol/L HCl调节pH 3.0，并用去离子水调整体积至200 mL。
4）模拟胃消化：将模拟胃消化样品于37℃、100r/min的水浴条件下进行消化反应，分别于0、3 h取样进行测定。
5）模拟肠消化样品制备：分别取55 mL模拟肠液、80 μL CaCl2溶液（0.3 mol/L）、100 mL 模拟胃消化样品、20 mL胰酶溶液（800 U/mL）、5 mL胆汁（160 mmol/L）和200 μL不同浓度的迷迭香提取物溶液并混匀，用1 mol/L NaOH调pH值至7.0，最后用去离子水补充至200 mL。
6）模拟肠消化：将上述模拟肠消化样品于37℃、100 r/min的恒温水浴锅中消化，分别于0、2 h取样进行测定。
1.2.7 丙二醛（MDA）含量测定
分别取100 μL模拟胃消化样品或肠消化样品，按照MDA试剂盒操作说明书进行测定。
1.3 数据统计分析
所有试验均做3次平行，试验结果以平均值±标准差表示。采用IBM SPSS 20.0软件进行数据分析，采用单因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）中的最小显著差异法（least significant difference，LSD）进行显著性分析，p＜0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 鱼肝油脂肪酸成分分析
采用气相色谱测定鱼肝油脂肪酸组成，结果见表1。
表1 鱼肝油脂肪酸组成
Table 1 Fatty acid composition of cod liver oil
成分含量/（g/kg）C8：0（辛酸） 0.119 C10：0（癸酸） 0.113 C12：0（月桂酸） 0.180 C13：0（十三烷酸） 0.097 C14：0（肉豆蔻酸） 24.500 C14：1n5（肉豆蔻烯酸） 0.445 C15：0（十五烷酸） 1.840 C16：0（棕榈酸） 65.100 C16：1n7（棕榈一烯酸） 45.300 C17：0（十七烷酸） 4.010 C18：0（硬脂酸） 13.500 C18：ln9c（油酸） 91.800 C18：2n6c（亚油酸） 14.400 C20：0（花生酸） 0.261 C18：3n6（γ-亚麻酸） 1.300 C18：3n3（α-亚麻酸） 5.770 C20：1（花生一烯酸） 83.800 C20：2（附子脂酸） 2.310 C20：3n6（顺-8，11，14-二十碳三烯酸） 0.457 C20：3n3（顺-11，14，17-二十碳三烯酸） 52.500 C20：4n6（花生四烯酸） 6.580 C20：5n3（二十二碳五烯酸） 56.300 C24：1n9c（神经酸） 2.290 C22：6n3（二十二碳六烯酸） 94.600
由表1可知，鱼肝油主要由油酸、花生一烯酸、棕榈酸、二十二碳六烯酸（DHA）、棕榈一烯酸、二十碳三烯酸、二十二碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和肉豆蔻酸等组成，含量分别为16.17%、14.76%、11.47%、16.67%、7.98%、9.25%、9.92%和 4.32%，其次还含有亚油酸、硬脂酸和α-亚麻酸，含量分别为2.54%、2.38%和1.02%。鱼肝油不饱和脂肪酸含量为80.67%，其中多不饱和脂肪酸为41.27%，单不饱和脂肪酸为39.40%；另外还含有19.33%的饱和脂肪酸。
2.2 迷迭香提取物对FeSO4/VC诱导鱼肝油氧化的影响
丙二醛是油脂中不饱和脂肪酸氧化分解所产生的次级氧化产物，是衡量脂质氧化的重要指标[15]。迷迭香提取物对FeSO4/VC诱导鱼肝油氧化的影响如图1所示。
图1 迷迭香提取物对FeSO4/VC诱导鱼肝油氧化的影响
Fig.1 Effect of rosemary extract on cod liver oil oxidation induced by FeSO4/VC
不同字母表示差异显著，p＜0.05；+表示添加；-表示不添加。
由图1可知，对照组鱼肝油氧化所产生的MDA含量很低，而经FeSO4/VC处理后，鱼肝油发生脂质氧化，MDA 含量显著升高至 385.39 nmol/mL（p＜0.05）；添加终浓度为10 μg/mL至500 μg/mL的迷迭香提取物能够有效抑制FeSO4/VC诱导的鱼肝油氧化。当迷迭香提取物终浓度为500 μg/mL时，鱼肝油氧化所产生的MDA含量显著降低了93.47%（p＜0.05）。以上结果表明迷迭香提取物能够有效抑制鱼肝油氧化，且抑制作用随其浓度的升高而增强。这与韩静静等[16]研究生育酚及其衍生物对FeSO4/VC诱导亚油酸氧化影响的结果相一致。
2.3 迷迭香提取物对AMVN诱导鱼肝油氧化的影响
AMVN[17]是一种脂溶性偶氮类化合物，热分解条件下会产生烷氧自由基，从而引发鱼肝油脂肪氧化的链式反应，加速油脂氧化。迷迭香提取物对AMVN诱导鱼肝油氧化的影响见图2。
图2 迷迭香提取物对AMVN诱导鱼肝油氧化的影响
Fig.2 Effect of rosemary extract on cod liver oil oxidation induced by AMVN
不同字母表示差异显著；+表示添加；-表示不添加。
由图2可知，鱼肝油经AMVN诱导后，发生较高程度的氧化反应，MDA生成量为38.63 nmol/mL。添加终浓度为10 μg/mL至500 μg/mL的迷迭香提取物能够有效抑制AMVN诱导的鱼肝油氧化。当迷迭香提取物添加量为500 μg/mL时，其MDA生成量较未添加迷迭香提取物时显著降低了60.16%，其抑制效果随着迷迭香提取物浓度的升高而显著增强（p＜0.05），这与迷迭香提取物对FeSO4/VC诱导鱼肝油氧化的影响相一致。
2.4 迷迭香提取物对模拟胃肠道消化过程中鱼肝油氧化的抑制作用
迷迭香提取物对模拟胃消化过程中鱼肝油氧化的影响见图3。
图3 迷迭香提取物对模拟胃消化过程中鱼肝油氧化的影响
Fig.3 Effects of rosemary extract on lipid oxidation of cod liver oil during in vitro gastric digestion
不同字母表示差异显著（p＜0.05）。
如图3所示，经模拟胃消化3 h后，对照组鱼肝油中MDA含量相较于0 h时显著升高了59.39%（p＜0.05），说明鱼肝油在模拟胃消化过程中发生了脂质氧化反应。添加终浓度为0.125 mg/mL～1.0 mg/mL的迷迭香提取物能够有效抑制鱼肝油在模拟胃消化过程中发生的氧化。在经模拟胃消化3 h后，当迷迭香提取物添加浓度为1.000 mg/mL时，MDA含量比对照组降低了41.28%（p＜0.05）。添加迷迭香提取物对模拟胃消化鱼肝油氧化的抑制作用随其添加浓度的升高而增强，呈良好的剂量-效应关系。
迷迭香提取物对模拟肠消化过程中鱼肝油氧化的影响见图4。
图4 迷迭香提取物对模拟肠消化过程中鱼肝油氧化的影响
Fig.4 Effects of rosemary extract on oxidation of cod liver oil during in vitro intestinal digestion
不同字母表示差异显著（p＜0.05）。
如图4所示，迷迭香提取物同样能够有效抑制鱼肝油在模拟肠消化过程中MDA的生成（p＜0.05）。经过2 h的消化，当迷迭香提取物添加浓度为1.000 mg/mL时，其MDA含量与对照组相比下降了46.62%（p＜0.05）。以上结果表明，迷迭香提取物能够显著抑制鱼肝油在模拟消化过程中发生的氧化反应，且其抑制效果随其添加浓度的升高而增强（p＜0.05），这与Mielnik等[18]得出的结论相类似。Keokamnerd等[19]也发现迷迭香提取物能有效抑制因鸡肉脂质氧化造成的硫代巴比妥酸值 （thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）含量的升高。这可能与迷迭香提取物中所富含的多酚类物质有关[20]。
3 结论
本试验结果表明，迷迭香提取物能够显著抑制自由基诱导的鱼肝油氧化以及鱼肝油在模拟胃肠道消化过程中发生的脂质氧化反应，其主要原因可能是迷迭香提取物具有较强的自由基清除能力。在今后的研究中应采用动物模型进一步评价迷迭香提取物对脂质氧化的影响及其主要活性组分的稳定性，从而为通过改善膳食结构来抑制脂质氧化提供科学理论依据。
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