鲈鱼具有生长速度快、抗病能力强、适应性强等特点，既能在淡水中养殖又能在海水中生存。鲈鱼肉质细嫩，味道鲜美，备受消费者喜爱，是许多国家重要的经济鱼类[1]。研究发现，鲈鱼含有多种营养成分，富含人体所需的必需氨基酸、维生素B、维生素D、DHA等，含有多种微量元素如锌、钙、铁、磷等[2]。近年来，市场对鲈鱼的需求每年都在增加。然而目前鲈鱼以鲜销为主，对鲈鱼的加工目前只局限于较为初级的速冻品，产品形式比较单一，缺乏更精更深的加工，鲈鱼多元化制品有待进一步开发[3]。
鱼糜制品具有口感好、低固醇、高蛋白、低脂肪等优点，受到消费者青睐，市场前景广阔。内源酶活性对食品安全与品质有重要影响，鱼肉水分含量较高，所含内源酶类较多，不仅影响其凝胶能力，而且极其容易变质腐败[4]。目前通常采用添加剂来改善肉糜制品的凝胶特性，常用的添加剂有转谷氨酰胺酶（transglutaminase，TGase）、水溶性凝胶、多糖类、非肉类蛋白质等[5-7]。然而，减少非肉组分的添加是凝胶类肉制品行业面临的一个挑战。由于肌原纤维蛋白是形成肉类凝胶的主要大分子，内源酶对蛋白分子的降解是鱼肉凝胶劣化的重要原因，因此筛选合适的蛋白酶抑制剂是解决蛋白凝胶劣化提高肉糜品质的一个有效途径[8]。重组荞麦胰蛋白酶抑制剂（recombinant buckwheat trypsin inhibitor，rBTI）是一个相对分子质量为7.9 kDa的小分子蛋白，特异抑制胰蛋白酶的活性，具有很好的热稳定性及酸碱稳定性[9]。近期研究表明，rBTI还可以延缓秀丽隐杆线虫的健康寿命[10-11]，具有良好的应用前景。目前用于食品领域的酶抑制剂均为小分子化合物，有关多肽或蛋白类的酶抑制剂在食品科学的应用研究尚属空白。本研究综合评价蛋白酶抑制剂对鱼糜凝胶特性及稳定机制的影响，将为其在肉制品的应用提供一定理论依据。
1 材料与方法
1.1 菌种、材料与仪器
大肠杆菌（E.coli M15 pQE30-BTI）：山西大学生物技术研究所蛋白质工程实验室构建保存；胰蛋白酶（250 U/mg）、硫酸卡那霉素（kanamycin sulfate，Kan）、氨苄青霉素（ampicillin，Amp）、三羟甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethy）methyl aminomethane，Tris]、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、Ni2+-NAT亲和材料、咪唑、牛血清白蛋白、醋酸、盐酸、二甲基亚砜、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）所用试剂：生工生物工程（上海）股份有限公司；苯甲酰-DL-精氨酰-对硝基苯胺（N-benzoyl-DL-arginine-4-nitroanilide hydrochloride，BAp－NA）、Folin-酚试剂：北京索莱宝科技有限公司。
新鲜鲈鱼（大口黑鲈）：山西省太原市田合活鲜水产市场。
TU-1810紫外分光光度计：上海美普达仪器有限公司；G154DS高压蒸汽灭菌锅：上海辅泽商贸有限公司；THZ-C-1恒温振荡培养箱：太仓市实验设备厂；JY92-IIDN超声破碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司；HC-2518R高速冷冻离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；BSA224S精密电子天平、PB-10精密pH计：德国Sartorius公司；BioLogicLP低压液相层析系统：美国Bio-Rad公司；INFINITY 3026凝胶成像系统：法国Vilber Lourmat公司；TMS-PRO物质分析仪：北京盈盛恒泰科技有限责任公司；FA-25高速组织匀浆机：上海弗鲁克科技发展有限公司；IMS-30全自动雪花制冰机：常熟市圣海电器有限公司；NS800分光测色仪：深圳市三恩驰科技有限公司；JYS-A800绞肉机：九阳股份有限公司。
1.2 方法
1.2.1 rBTI的制备与纯化
将含pQE30-BTI质粒的M15菌接种于LB液体培养基（含 50 μg/mL Kan 和 100 μg/mL Amp），37℃、180 r/min振荡培养至对数期，加入诱导剂IPTG（终浓度为0.5 mmol/L），诱导4 h后，6 000 r/min离心收集菌体。用缓冲液（Tris-HCl pH 7.5，20 mmol/L）重悬菌体，超声破碎菌体，在80℃水浴中加热30 min后，12 000 r/min离心20 min，收集上清液，即为重组荞麦胰蛋白酶抑制剂（recombinant buckwheat trypsin inhibitor，rBTI）粗品。
rBTI的纯化采用Ni2+亲和层析柱，在液相层析系统上进行。先用缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH7.5）平衡 Ni2+亲和柱，将离心后的粗蛋白上样于Ni2+亲和柱，流速设定为1 mL/min，用平衡缓冲液充分洗脱未结合的杂蛋白后，分别用含80 mmol/L和300 mmol/L咪唑的缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH7.5）洗脱亲和柱。收集各洗脱峰并进行抑制活性测定及SDS-PAGE分析。
1.2.2 rBTI抑制胰蛋白酶活性的测定
按照Erlanger等的方法[12]，在试管中加入3.2 mL测活缓冲液（pH 8.0，100 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L CaCl2）、50 μL 胰蛋白酶溶液、100 μL rBTI，37 ℃温浴5 min后，加入17 μL 底物BApNA（0.15 mol/L，溶剂为二甲基亚砜）启动反应，37℃水浴加热10 min后加入0.5 mL体积分数为33%的醋酸终止反应，在410 nm下测定由产物对硝基苯胺产生的吸光值。空白组加样顺序为先加入0.5 mL 33%的醋酸，后加rBTI。对照组以100 μL的测活缓冲液代替rBTI。胰蛋白酶活力单位定义为410 nm处吸光度值每分钟内增加0.001。抑制1单位胰酶所需抑制剂的量定义为一个抑制活力单位。
rBTI浓度测定按照Jagota的方法进行[13]。以牛血清白蛋白为标准溶液，用Folin-酚法测定蛋白浓度，得到标准曲线线性回归方程y=0.001x+0.004 2（R2=0.996 1），式中：x为蛋白浓度，mg/mL；y为 410 nm 处吸光度值。测定rBTI反应后的吸光度值，利用标准曲线计算其浓度。
1.2.3 鲈鱼鱼糜凝胶的制备
将购买的新鲜鲈鱼处死并进行预处理，去除鱼鳞、鱼鳍和鱼皮，剔除可见的骨头。将已处理好的鱼肉放在绞肉机中初步斩拌3 min，加入食盐（2.5%）及rBTI，rBTI浓度梯度为 0 ‰、0.02 ‰、0.04 ‰、0.08 ‰、0.12‰。再次使用高速组织匀浆机（16 000 r/min）进行斩拌后，将鲈鱼鱼糜灌装于直径为2.5 mm的聚乙烯醇管中，1 500 r/min离心20 min，采用二段式加热法进行处理，即将鱼糜于40℃水浴保温30 min后转入90℃水浴加热20 min。完成后使用冰水迅速冷却形成鱼糜凝胶，置于4℃保存[14]。
1.2.4 rBTI对鱼糜凝胶蒸煮损失率的影响
将斩拌好的鱼糜放置在离心管中1 500 r/min离心20 min，记离心后鱼糜和聚乙烯醇管的总质量为m，同1.2.3采用二段式水浴加热，制成鱼糜凝胶，在4℃下隔夜放置。取出后在室温25℃下平衡4 h，将管重记为m1，将鱼糜凝胶表面水分擦去，记其质量为m2，按照公式（1）计算蒸煮损失率[15]。
式中：m为鱼肉肉糜与聚乙烯醇管总质量，g；m1为管重，g；m2为肉糜凝胶质量，g。
1.2.5 rBTI对鱼糜凝胶白度的影响
参照Benjakul等[15]的方法将鱼肉肉糜凝胶切成厚度为1.5 cm的小块，使用分光测色仪对鱼肉肉糜凝胶进行白度分析。用黑白板对分光测色仪进行校对后，测量鱼肉肉糜凝胶的L*（亮度）值、a*（红色/绿色）值和b*（黄色/蓝色）值。每个试验组取3块切割后的凝胶进行测量，取平均值，按照公式（2）计算样品白度值[16]。
式中：L*为亮度值；a*为红色/绿色值；b*为黄色/蓝色值。
1.2.6 rBTI对鱼肉肉糜凝胶质构的影响
将鱼糜凝胶分切成边长为1.5 cm的正方体，用TMS-PRO食品物性分析仪对凝胶质构进行分析。
1.2.6.1 采用针型探头测定样品的穿刺力及黏附性
起始力：0.1N；穿刺速度：15mm/s；穿刺距离：5mm；回程速度：30 mm/s；回程距离：8 mm。
1.2.6.2 采用球型探头测定凝胶硬度
起始力：0.1N；穿刺速度：15mm/s；穿刺距离：5mm；回程速度：30 mm/s；回程距离：8 mm。
1.2.7 rBTI对鱼肉肉糜凝胶三氯乙酸-溶解肽的影响
参考Hartree等的方法测定凝胶三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）-溶解肽含量[17]。取 1.1 g鱼肉肉糜凝胶，加入10 mL刚配制好的三氯乙酸溶液（50 g/L），使用高速组织匀浆机22 000 r/min匀浆5 min后于4℃静置1 h以溶解可溶性多肽，8 000 r/min离心20 min后，取上清液用Folin-酚法进行多肽含量测定。
1.2.8 rBTI对鱼肉肉糜凝胶蛋白的影响
参考Marino等的方法制备肉糜凝胶蛋白样品[18]。取3.0 g鱼糜凝胶，加入27 mL SDS溶液（50 g/L，85℃）。使用匀浆机以16 000 r/min的速度匀浆2 min，在85℃下浸提蛋白1 h，8 000 r/min离心20 min，取上清液进行SDS-PAGE分析。采用10%的分离胶和4%浓缩胶，浓缩胶和分离胶电压分别为80 V与100 V。电泳停止后，用考马斯亮蓝染色液染色30 min，换脱色液，直至分离胶背景清晰后，用凝胶成像系统拍照记录。
1.2.9 数据统计分析
每个试验重复3次，采用SPSS 17.0进行方法分析和显著性检验，多重比较采用Duncan检验，P＜0.05表示显著性差异。
2 结果与分析
2.1 rBTI的制备与纯化
rBTI带有His×6标签，可以用Ni2+亲和柱纯化，结果见图1。
图1 rBTI亲和层析纯化图谱
Fig.1 Affinity chromatography of rBTI
1、2、3 为蛋白峰。
按照1.2.2方法对各蛋白峰抑制活性测定，发现蛋白峰1和2无抑制活性，而蛋白峰3抑制活性很强，对胰蛋白酶的抑制率达80%，表明穿透峰1和80 mmol/L咪唑洗脱下的均为杂蛋白，300 mmol/L咪唑洗脱下的为目的蛋白。对纯化后的rBTI进行了SDS-PAGE鉴定，结果见图2。
图2 rBTI的SDS-PAGE图谱
Fig.2 SDS-PAGE pattern of rBTI
M.标准蛋白（Marker）；1.纯化后的 rBTI。
在SDS-PAGE图谱上仅出现一个蛋白条带，表明经Ni2+亲和柱一步纯化，便得到了高纯度的rBTI（表观纯度＞95%）。
2.2 rBTI对鱼糜凝胶蒸煮损失率的影响
蒸煮损失率是评判肉糜凝胶持水性好坏的重要指标，rBTI对鱼糜凝胶蒸煮损失率的影响见图3。
由图3可知，随着rBTI添加量的增加，凝胶的蒸煮损失率呈逐步下降的趋势。当rBTI添加量为0.02‰时，鱼糜凝胶的蒸煮损失率即发生了显著下降（P＜0.05），继续增加rBTI添加量至0.04‰，蒸煮损失率虽有下降趋势，但变化不明显（P＞0.05）。再继续增加rBTI添加量，蒸煮损失率显著下降（P＜0.05），当添加量为0.12‰时，鱼糜凝胶的蒸煮损失率从对照组的3.3%下降至1.68%。以上结果表明添加rBTI能有效降低鱼糜凝胶的蒸煮损失率，提高凝胶的持水性。其原因可能是rBTI改善了鱼糜凝胶的三维网状结构，使结构变得紧密，从而保留了更多的水分。
图3 rBTI对鱼糜凝胶蒸煮损失率的影响
Fig.3 Effect of rBTI on the cooking loss rate of surimi gel
小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
2.3 rBTI对鱼糜凝胶白度的影响
rBTI对鱼糜凝胶白度的影响见图4。
小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。图4 rBTI对鱼糜凝胶白度的影响
Fig.4 Effect of rBTI on gel whiteness of surimi gel
由图4可知，改变rBTI添加量对鱼糜凝胶的白度值并未产生显著影响（P＞0.05）。目前常用于凝胶的添加剂如淀粉、魔芋胶等，在加工过程中易产生褐变，严重影响产品白度[19]。本试验中所用rBTI为纯品，而且rBTI对热稳定，在加工过程中不会发生褐变反应，不会改变凝胶本身的色素累积，能很好地保留鱼糜凝胶的白度值。
2.4 rBTI对鱼糜凝胶穿刺力的影响
rBTI对鱼糜凝胶穿刺力的影响见图5。
图5 rBTI对鱼糜凝胶穿刺力的影响
Fig.5 Effect of rBTI on gel penetration force of surimi gel
小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
由图5可知，随着rBTI添加量的增大，鱼糜凝胶的穿刺力会逐渐提高。当rBTI添加量为0.02‰时，凝胶的穿刺力较未添加rBTI组有所提高，但并未表现出显著性差异（P＞0.05）。当rBTI添加量达到0.04‰时，凝胶的穿刺力较未添加rBTI组显著提高（P＜0.05）。随着rBTI添加量增加，鱼糜凝胶的穿刺力提高，表明rBTI可以提高肉糜凝胶内部结构的紧密度。rBTI添加量为0.04‰、0.08‰以及0.12‰三组之间的穿刺力没有出现显著差别（P＞0.05），因此rBTI添加量为0.04‰时即可有效改善鱼糜凝胶的穿刺力。
2.5 rBTI对鱼糜凝胶黏附性的影响
rBTI对鱼糜凝胶黏附性的影响见图6。
图6 rBTI对鱼糜凝胶黏附性的影响
Fig.6 Effect of rBTI on gel adhesion of surimi gel
小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
由图6可知，随着rBTI使用量的增大，鱼糜凝胶的黏附性呈现先下降后上升的趋势。在黏性下降阶段，鱼糜凝胶结构的稳定较差，在黏性上升阶段，凝胶结构逐步紧密而稳定，品质得到改善。rBTI添加量在0‰～0.04‰时，鱼糜凝胶的黏附性呈下降趋势。与未添加rBTI组相比，当rBTI含量为0.02‰时，凝胶的黏附性有所降低，但无显著性差异（P＞0.05），当rBTI添加量为0.04‰时，出现显著性差异（P＜0.05）。当rBTI添加量在0‰～0.04‰时，鱼糜凝胶的劣化作用大于rBTI对内源酶的抑制作用，凝胶的劣化作用为主要优势，劣化使得肉糜凝胶内部黏性降低。rBTI添加量在0.04‰～0.12‰时，鱼糜凝胶的黏附性呈上升趋势。rBTI添加量为0.08‰时，凝胶的黏附性虽有提高，但较0.04‰组无显著性差异（P＞0.05），然而当rBTI添加量提高至0.12‰时，凝胶黏附性较0.04‰组及0.08‰显著增高（P＜0.05），表明当rBTI添加量大于0.04‰，尤其添加量为0.12‰时，鱼糜凝胶内部结构的紧密度显著提高。因此，随着rBTI添加量增加，提高了蛋白质的黏结作用，表现为凝胶黏附性增大。
2.6 rBTI对鱼糜凝胶强度的影响
rBTI对鱼糜凝胶强度的影响见图7。
图7 rBTI对鱼糜凝胶强度的影响
Fig.7 Effect of rBTI on the strength of surimi gel
小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
由图7可知，当rBTI添加量为0.02‰时，鱼糜凝胶强度由1.017 N提高至1.196 N，较未添加rBTI组显著提高（P＜0.05），表明添加rBTI能够提高鱼糜凝胶的凝胶强度。当rBTI添加量为0.02‰、0.04‰、0.08‰时，凝胶强度有所提高，但差异不显著（P＞0.05），表明这3组rBTI添加量对鱼糜凝胶强度的影响作用相似。研究表明，黄鳍金枪鱼鱼子中提取的一种胰蛋白酶抑制剂、牛血清蛋白和卵清蛋白均能提高鱼糜凝胶的强度[20]。
2.7 rBTI对鱼糜凝胶TCA-溶解肽的影响
在肉糜凝胶加工过程中，温度、内源酶等均会引起蛋白质降解，尤其在40℃保温时，降解作用加剧[21]。三氯乙酸（TCA）-溶解肽的含量可以反映肉糜凝胶内部蛋白质的降解情况，rBTI对鱼糜凝胶TCA-溶解肽含量的影响见图8。
图8 rBTI对鱼糜凝胶TCA-溶解肽含量的影响
Fig.8 Effect of rBTI on the content of TCA-dissolved peptide in surimi gel
小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
由图8可知，TCA-溶解肽含量随着rBTI添加量的增多呈现下降趋势，说明添加rBTI可以抑制内源酶对鱼糜凝胶内部蛋白质的降解。当rBTI添加量为0.02‰时，凝胶TCA-溶解肽含量较未添加rBTI组下降了 96 μg/mL，差异显著（P＜0.05），表明 rBTI对鱼糜凝胶内源酶抑制效果显著。当rBTI添加量由0.04‰增加至0.12‰时，TCA-溶解肽含量变化不明显，表明rBTI添加量为0.04‰时对鱼糜凝胶内源酶的抑制作用已达最大程度。
2.8 鱼糜凝胶的SDS-PAGE分析
肌原纤维蛋白是维持肉糜凝胶结构的主要蛋白质，如肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC，分子质量为200 kDa）及肌动蛋白（actin，分子质量为43 kDa）等对凝胶的形成及稳定有重要影响。对鱼糜凝胶蛋白质进行SDS-PAGE分析，结果见图9。
图9 不同rBTI添加量鱼糜凝胶蛋白的SDS-PAGE图谱
Fig.9 SDS-PAGE pattern of surimi gel added with rBTI at different levels
M 为标准蛋白（Marker）；1～5道为 rBTI添加量为 0‰、0.02‰、0.04‰、0.08‰、0.12‰。
随着rBTI添加量的增多，鱼糜凝胶中的肌球蛋白重链以及肌动蛋白明显增多。SDS-PAGE结果与TCA-溶解肽结果一致，添加rBTI抑制了鱼肉肉糜中内源酶的活性，减弱了酶对肌肉纤维蛋白的水解，TCA-溶解肽含量较对照组降低。同时，更多肌肉纤维蛋白的保留有利于鱼糜凝胶的形成及维持结构稳定性，凝胶穿刺力及强度等指标较对照组显著提高。
3 结论
本试验通过诱导表达及亲和层析获得了高纯度的rBTI，检测了rBTI对鱼糜凝胶蒸煮损失率、白度、穿刺力、黏附性及凝胶强度的影响，并对其作用机理进行了初步探索。结果表明，rBTI对鱼糜凝胶的白度无显著影响，可以有效降低蒸煮损失率，提高保水性，并改善凝胶的质构特性。综合白度值、穿刺力、强度、TCA-溶解肽含量等指标，得出rBTI为0.04‰是最适合的添加量。通过TCA-溶解肽含量测定及SDSPAGE试验，分析rBTI通过抑制内源酶对肌球蛋白的降解从而维持鱼肉肉糜凝胶结构的稳定性。鱼糜在70℃保温时易形成劣化凝胶，严重降低凝胶品质。rBTI有极好的耐热性，对类胰蛋白酶有较强的抑制作用，今后可进一步研究rBTI对凝胶劣化的抑制作用及条件。
传统营养理论认为蛋白酶抑制剂是抗营养因子，有关蛋白酶抑制剂的报道多集中于对其灭活方法的研究[22]。然而，如今膳食中蛋白质普遍过剩，少量抑制剂引起的营养素吸收降低并不会妨碍人体健康，迄今为止还未有研究证明少量的蛋白酶抑制剂对人体有害。越来越多的报道表明蛋白酶抑制剂是膳食中重要的活性成分[23]。本文研究蛋白酶抑制剂对肉糜凝胶的影响及机理，拓宽了蛋白酶抑制剂的应用渠道，为鲈鱼鱼糜制品的开发提供了新的思路。
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