多糖（polysaccharide）是指由10个或10个以上单糖通过缩合而形成的链状结构的物质，广泛分布于植物、动物、微生物和海洋生物中，对生物的代谢、细胞生长等生命活动有着至关重要的作用[1]。研究表明，多糖具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗血栓、降血糖等多种生物活性[2-3]。
蓝靛果，学名蓝靛果忍冬（Lonicera aerulea L.），又名黑瞎子果，是一种新兴的小浆果，在我国，蓝靛果主要分布在东北、华北和西北地区。研究表明蓝靛果果实含有丰富的多酚（花色苷、黄酮）、多糖、维生素、矿物质和微量元素等多种活性物质，具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗炎、降血糖等功效[4-7]。目前，国内外针对蓝靛果果实的研究主要集中在多酚类如黄酮类、花色苷等，对于蓝靛果多糖的研究鲜有报道[8-9]。
超声波辅助法是利用超声波的空化作用、机械作用以及热效应对原料中的有效成分进行提取，与传统的溶剂提取法相比，能够大大提高提取效率[10]。本文以蓝靛果果实为原料，利用响应面法优化超声波辅助蓝靛果多糖提取工艺，并进一步测定其清除自由基（DPPH·、O2-·）能力。本试验不仅拓展蓝靛果果实的研究领域，而且为进一步研究蓝靛果果实多糖提供了理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
蓝靛果果实：黑龙江省农科院牡丹江农科所；大孔吸附树脂D4006：南开大学化工厂；所用试剂均为国产分析纯。
JY92-IIV型超声破碎仪：宁波新芝生物科技股份有限公司；FDU-1100型冷冻干燥机：东京理化机械株式会社；WFJ-7200型可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 蓝靛果果实多糖的制备
称取一定量蓝靛果果实匀浆，按照一定的液料比加入去离子水，混匀后，置于一定时间、一定功率的超声波条件下进行提取。提取液过滤、浓缩、醇沉（体积分数60%乙醇溶液），4℃冰箱静置过夜，抽滤，冻干，即得粉红色的蓝靛果果实粗多糖。参考课题组前期工作[11]，选取大孔树脂D4006对粗多糖进行初步纯化，得到蓝靛果多糖（blue honeysuckle polysaccharide，BHP）。采用苯酚-硫酸法测定多糖含量[12]。紫外检测表明蓝靛果多糖不含多酚和花色苷。
1.2.2 超声波法辅助提取蓝靛果果实多糖的单因素试验
准确称取蓝靛果果浆10.0 g，放入500 mL烧杯中，在其他条件相同的情况下，采用不同液料比10∶1、20 ∶1、30 ∶1、40∶1、50 ∶1（mL/g），超声波功率（200、300、400、500、600 W），提取时间（20、30、40、50、60 min）进行超声波辅助提取试验，以多糖得率为响应值，研究不同提取条件对提取效果的影响。蓝靛果果实多糖得率计算公式：
式中：w为蓝靛果果实质量，g；c为由标准曲线计算所得蓝靛果果实多糖浓度，mg/mL；v为溶液体积，mL。
1.2.3 响应面优化超声法辅助提取工艺研究
根据单因素试验的结果，以提取时间（X1）、液料比（X2）和超声功率（X3）为考察的变量，多糖的得率为响应值，通过Box-Behnken设计三因素三水平响应面分析试验，优化超声波辅助提取蓝靛果多糖的工艺，采用Design-Expert软件分析数据，建立三元二次模型进行拟合分析，模型拟合公式如下：
式中：Y是因变量；β0为常系数；βi为线性系数（主效应）；βii为二次系数；βij是两因素交互作用系数。
1.2.4 蓝靛果果实多糖清除自由基活性测定
参照文献[13]，测定不同浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）蓝靛果多糖对DPPH·和O2-·清除活性，VC为阳性对照。
1.3 数据处理
所有试验数据均以3次试验结果的平均数标准误差（mean±SD）表示，采用DPS 6.5分析软件对单因素试验的各因素进行比较分析，采用Design-Expert 7.0软件进行响应面试验设计和分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
单因素对多糖得率的影响见图1。
图1 单因素对多糖得率的影响
Fig.1 Effects of singal-factor on polysaccharides yield
由图1a可知，在10 min～40 min范围内，随着时间的增长，多糖得率先增加，随后逐渐降低，40 min时达到最大值。多糖得率降低的原因可能是随着时间的进一步延长，超声波的空化作用使多糖发生降解使得率降低[14-15]。因此选取40 min作为提取的最佳时间，得率为（8.05±0.08）%。图1b结果显示，多糖得率随着液料比的增大呈上升趋势，当液料比为40∶1（mL/g）时，多糖得率最高为（8.26±0.09）%，随后，开始降低。这可能是由于液料比增大，超声波的空化作用会减弱，不利于多糖的提取；当溶剂适宜时，多糖溶出最多，得率最高[16]。因此选取40∶1（mL/g）作为提取的最佳液料比。超声功率对多糖得率的影响见图1c，随着超声功率的升高，得率先增加再减小，可能是超声功率的增大，多糖会产生降解 [17-18]。在300 W的条件下得率最高为（8.30±0.08）%，因此选取400 W作为提取的最佳超声功率。
2.2 响应面优化分析
2.2.1 响应面分析结果
响应面试验设计结果如表1所示。
表1 Box-Behnken设计方案及蓝靛果果实多糖得率
Table 1 Box-Behnken design and yield of the polysaccharides from blue honeysuckle fruits
序号 X1提取时间/min X2液料比/（mL/g）X3超声功率/W 多糖得率/%1-1（30） 1（50∶1） 0（300） 6.93±0.07 2 0（40）-1（30∶1） 1（400） 7.81±0.22 3 0 1 1 7.49±0.11 4 1（50） 0（40∶1）-1（200） 7.22±0.21 5 0 0 0 8.37±0.09 6 0 1-1 7.79±0.09 7 0 0 0 8.32±0.12 8 1 1 0 7.46±0.11 9 0 0 0 8.31±0.15 10 0 0 0 8.35±0.04 11-1 0 1 6.83±0.09 12 0 0 0 8.35±0.12 13 1 0 1 7.46±0.09 14 0-1-1 7.40±0.17 15 1-1 0 6.87±0.10 16-1-1 0 7.38±0.13 17-1 0-1 6.31±0.09
用软件Design-Expert 8.0.6统计软件对响应面试验设计结果进行多元回归拟合、方差分析及显著性检验，得到的回归方程如下所示：
响应面试验结果方差分析如表2所示。
表2 多糖得率方差分析
Table 2 Variance analysis of the polysaccharides yield
注：**P<0.0001，差异极显著；*P<0.05，差异显著。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 5.98 9 0.66 13.50 0.001 2 *X1 0.30 1 0.30 6.18 0.041 9 *X2 0.006 1 0.006 0.11 0.747 7 X3 0.095 1 0.095 1.92 0.208 2 X1X2 0.27 1 0.27 5.49 0.051 6 X1X3 0.02 1 0.02 0.40 0.548 1 X2X3 0.13 1 0.13 2.56 0.153 6 X12 3.59 1 3.59 72.98 <0.000 1 **X22 0.28 1 0.28 5.62 0.049 6 *X32 0.90 1 0.90 18.20 0.003 7 *残差 0.34 7 0.049失拟项 0.34 3 0.11 190.13 <0.000 1 **纯误差 0.002 4 4 0.000 6总回归 6.33 16
由表2可知，回归模型在统计学上差异极显著（P<0.000 1），失拟项和变异系数的数值表明该试验结果与数学模型具有较好拟合度，可用该模型对超声波辅助提取蓝靛果果实多糖进行预测。另外，由方差分析可知，各个因素间交互作用对多糖得率影响的显著程度为X1X2>X2X3>X1X3。影响蓝靛果多糖提取率大小因素依次为：提取时间>超声功率>液料比。
2.2.2 模型准确性分析
模型准确性分析见图2。
由图2a可知，数据点基本集中在一条直线上，残差符合正态分布规律；由图2b可知，各个残差的分布分散且无规则，都在合理的极限范围内，说明残差数据正常。真实值和拟合值的关系如图2c所示，二者的数据点均集中在一条直线附近，试验结果与模型拟合值比较接近。综上可知，本试验建立的模型合理，适合优化超声提取蓝靛果果实多糖。
2.2.3 边际效应分析
单因子边际效应曲线见图3。
图2 模型准确性分析
Fig.2 Accuracy analysis of model
a.残差的正态概率；b.残差和拟合值；c.拟合值和实际值。
图3 单因子边际效应曲线
Fig.3 Marginal effect curve of single factor
如图3所示，当提取时间、液料比和超声功率低于各自的临界编码值（0.10、0.05、0.12）时，多糖得率增加速率大于零，但呈下降的趋势，说明多糖得率随着各因素的增大而逐渐达到最大值；当三者分别取临界编码值时，多糖得率增长率均为零，即多糖得率达到最大；当高于临界编码值时，多糖得率增长率小于零，说明多糖得率开始下降并且下降的速率逐渐增大。由图3可知，各因素的变化程度的大小顺序为：提取时间>超声功率>液料比，与方差分析的结果一致。
2.2.4 交互效应分析
为了得到某两个因素同时对多糖得率Y值的影响，观察在其它因素条件固定不变情况下，某两个因素对多糖得率Y值的影响。用Design-Expert 8.0.6软件作出相应的响应面图，对这些因素中交互项之间的交互效应进行分析，如图4所示。
图4 各因素间的交互作用
Fig.4 Interaction among factors
由图4a可知，时间与液料比对多糖得率的交互影响呈抛物线形，说明时间与液料比的交互作用对多糖得率影响显著。由图变化趋势可知，当时间在35 min～45 min 之间某固定值，液料比在 32 ∶1（mL/g）～47∶1（mL/g）之间某固定值时，曲面有最高点，即在此区间某一固定条件，多糖得率有最值；图4b抛物线曲面显示超声功率和提取时间的交互作用对多糖得率的影响明显。当提取时间在35 min～47 min，功率在220 W～400 W范围内，多糖的得率比较高。由图4c可知，在液料比取 35 ∶1（mL/g）～45 ∶1（mL/g）、超声功率取270 W～380 W的范围内，多糖得率相对较大，且在此范围内，多糖得率可取最大值。当液料比一定时，随着超声功率的增大，多糖得率增大，超声功率继续增大，得率有下降的趋势；当超声功率一定时，随着液料比的增大，多糖得率先增大后减小。
经以上回归模型分析，蓝靛果果实多糖的最佳提取工艺为：提取时间 41.10 min，液料比 40.70∶1（mL/g），超声功率309.15W。结合生产实际，将各因素调整为提取时间 41 min，液料比 41 ∶1（mL/g），超声功率 310 W进行3次平行试验。在此条件下，多糖得率实际测量值（8.31±0.23）%与预测值8.36%接近，表明用响应面法优化超声波辅助提取蓝靛果果实多糖的工艺条件是可行的。
2.3 蓝靛果实多糖清除自由基活性
研究表明许多疾病的发生和发展同自由基密切相关，据报道，由过量自由基引起的疾病，已超过100余种，如高血压、糖尿病、癌症，类风湿关节炎、动脉粥样硬化以及老年痴呆等[19-21]。因此寻找高效、廉价、低毒天然抗氧剂，清除体内自由基，对治疗疾病和保护人体健康很有益处。
多糖BHP对DPPH·和O2-·两种自由基的清除效果见图5。
图5 蓝靛果多糖清除自由基能力
Fig.5 Scavenging activities of the polysaccharide on the radicals
由图5可知，当浓度在0.1 mg/mL～1.0 mg/mL时，多糖BHP对DPPH·的抑制能力随着浓度的增高而增大（P<0.05），在1.0 mg/mL时，抑制率达到最大（53.78±0.89）%，IC50为 5.40 mg/mL。当浓度在 0.1 mg/mL～0.4 mg/mL时，多糖BHP对O2-·的清除能力随着浓度的增高而增大（P<0.05）；在 0.4 mg/mL～1.0 mg/mL 时，BHP的清除能力随着浓度的增高变化较小，在1.0 mg/mL时，清除率达到最大（67.79±1.01）%，IC50为 0.28mg/mL。可知，蓝靛果多糖对2种自由基均有一定的清除作用，但清除能力均小于对照VC。
3 结论
响应面分析得到回归模型合理，试验结果与模型拟合值接近，适合优化超声辅助提取蓝靛果果实多糖。超声波辅助提取蓝靛果果实多糖最佳提取工艺条件为：提取时间 41 min，液料比 41 ∶1（mL/g），超声功率310 W，得率为（8.31±0.23）%。影响蓝靛果多糖提取率大小因素依次为：提取时间>超声功率>液料比。蓝靛果多糖BHP对DPPH·和O2-·均具一定的清除活性，IC50分别为 5.40、0.28 mg/mL。
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