芦笋（Asparagus officinalis）为百合科植物，又名石刁柏、龙须菜。其柔软多汁，风味独特，营养价值高，富含18种氨基酸、15种矿物质元素及多糖、胆碱、甾皂苷、叶酸、黄酮、芦丁等生物活性物质[1-2]，能够调节基体代谢，提高免疫力，对高血压、心脏病、白血病、胆结石、各种肿瘤等都有很好的预防和治疗作用，具有很高的医疗保健功能[3-5]，是名副其实的药食两用名贵蔬菜，享有“蔬菜之王”美称。据联合国粮食及农业组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）显示，我国芦笋收获面积和总产量常年位列世界第一，产值超过100亿元，已发展成为我国主要经济支柱产业[6]。
目前国内外对芦笋的营养价值和药理作用进行了广泛的研究，提出了芦笋的综合利用，在芦笋深加工方面已开发出速溶芦笋粉、芦笋饮料、芦笋胶囊等产品，然而芦笋制品的质量稳定性和成品率常受到本身膳食纤维的限制[7]。膳食纤维根据溶解性的不同，可分为可溶性膳食纤维（soluble dieary fibre，SDF）和不溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber，IDF）[8]，其中可溶性膳食纤维比不溶性膳食纤维有着更强的生理功能，如对结肠癌的防治效果、降低血液胆固醇含量等，且用途也更广[9-10]。目前常用提取可溶性膳食的方法主要有化学法（如酸碱处理[11]）、物理法（如挤压膨化法[12]、高压均质法[13]）、酶法[14]和发酵法[15]，其中酶法提取率较高且更为温和，符合发展环境友好型社会的主题，所以成为提取可溶性膳食纤维研究的热点方向。张少颖[7]、杨晓宽等[8]、田星等[16]、周驰[9]均采用酶法对芦笋中可溶性膳食纤维的酶解工艺进行了研究，然而近年来逐渐发展一些辅助方法，包括微波、超声、加压、超临界等物理技术[17]，其中超声波细胞破碎技术可以将电能通过换能器转换为声能，这种能量通过液体介质而变成一个个密集的小气泡，这些小气泡迅速炸裂，从而起到破碎细胞、提高可溶性膳食纤维素得率，缩短提取时间，提高工作效率的目的[18]。以此为创新点和突破点，本试验采用超声波-酶法协同提取绿芦笋中可溶性膳食纤维，通过Box-Behnken试验设计和响应面分析，获得最佳提取工艺条件，以期为绿芦笋资源的综合利用提供数据依据。
1 材料与方法
1.1 材料及试剂
绿芦笋：漯河市亿康工贸有限公司；氢氧化钠、柠檬酸、苯酚、浓硫酸（均为分析纯）：烟台市双双化工有限公司；纤维素酶（酶活力≥5 000.0 U/g）：索莱宝生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
i9双光束紫外可见分光光度计：济南海能仪器股份有限公司；KQ-300DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；FiveEasy Plus FE28 pH计：梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；SHB-Ш循环水式真空泵：郑州长城科工贸有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 绿芦笋可溶性膳食纤维提取及测定
1.3.1.1 粗可溶性膳食纤维的提取工艺
参考刘秀凤等[19]方法，略作修改。提取粗可溶性膳食纤维，具体工艺流程如下：
原料挑选、清洗→打浆→调节pH值→协同酶解→抽滤→醇沉→离心→沉淀物用80%乙醇洗涤3次→干燥→粗可溶性膳食纤维
操作要点：（1）原料挑选和清洗：挑选无弯曲畸形、无损伤、无病虫害、长度在20 cm左右，直径1.0 cm～1.5 cm的绿芦笋为试验材料，清洗干净后备用。（2）打浆∶按绿芦笋与水料液比1∶2（g/mL）进行打浆，当原料呈细小的纤维状，料液不黏，可均匀流动时停止搅打。（3）调节pH值：用2 mol/L柠檬酸逐滴加入至所需pH值，边加边振荡，将柠檬酸溶液与浆液混匀，避免局部酸性偏高影响结果的准确性。（4）酶解：向调pH值后的浆液中加入纤维素酶，放入超声波清洗机中，一定时间后取出得到酶解液。（5）醇沉：在上述酶解液中按照体积比1∶1加入0.5%氢氧化钠溶液，放入70℃水浴加热210 min，抽滤后往滤液中加入4倍体积的无水乙醇，充分混合后静置过夜，絮状沉淀析出。（6）洗涤：用80%乙醇溶液洗涤沉淀，去除残留还原糖[20]。
1.3.1.2 去蛋白
参考刘秀凤等[19]方法，采用Sevag法[21]去蛋白。
1.3.1.3 可溶性膳食纤维的测定
采用苯酚－硫酸法测定。
1）标准曲线的绘制：参考周驰等[9]方法。分别量取浓度为 0.25 mg/mL的葡萄糖标准溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于10 mL具塞试管中，蒸馏水定容至1.0 mL。加入5%苯酚溶液1.0 mL，振荡摇匀，加硫酸5.0 mL，摇匀，室温（25±1）℃放置 30 min，定容至10 mL，摇匀，于490 nm波长下测定吸光度。计算得标准曲线回归方程为：Y=35.249X-0.037 1（R2=0.993）。
2）可溶性膳食纤维样液的制备：用适量蒸馏水溶解去蛋白的可溶性膳食纤维，并定容到250 mL，备用。
3）可溶性膳食纤维样液的测定：取1 mL待测样液，加入1 mL 5%苯酚，摇匀，加入5 mL浓硫酸，静置30 min，定容至10 mL，在490 nm处测定吸光值，根据标准曲线计算可溶性膳食纤维含量。
1.3.2 超声-酶法协同提取可溶性膳食纤维条件的确定
1.3.2.1 单因素试验
1）纤维素酶添加量对SDF含量的影响
固定超声功率270 W，酶解时间60 min，酶解温度50℃，pH值4.5，考察纤维素酶添加量（0%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%、0.14%、0.16%）对SDF含量的影响，每组试验重复3次。
2）超声时间对SDF含量的影响
固定酶添加量0.06%、微波功率270 W、酶解温度50 ℃、pH 值 4.5，考察超声时间（0、20、40、60、80、100、120、140、160、180 min）对 SDF 含量的影响，每组试验重复3次。
3）pH值对SDF含量的影响
固定酶添加量0.06%、超声功率270 W、酶解时间120 min，酶解温度 50 ℃，考察 pH 值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）对 SDF 含量的影响，每组试验重复3次。
4）微波功率对SDF含量的影响
固定酶添加量0.06%、酶解时间120 min、酶解温度 50 ℃、pH 值 4.5，考察微波功率（0、120、150、180、210、240、270、300 W）对 SDF 含量的影响，每组试验重复3次。
1.3.2.2 响应面优化试验设计
根据单因素试验结果，选取纤维素酶添加量、超声时间、pH值、超声功率为考察因子，SDF含量为响应值，利用Design Expert进行Box-Behnken试验设计，优化超声协同酶解工艺条件。
1.4 数据分析
数据为3次重复的平均值。采用Origin8.6软件作图，使用Design-Expert 8.0软件进行响应面试验数据处理及结果分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 纤维素酶添加量对SDF含量的影响
纤维素酶添加量对SDF含量的影响见图1。
图1 纤维素酶添加量对SDF含量的影响
Fig.1 Effects of cellulase addition on SDF content
由图1可知，随着纤维素酶添加量的增加，SDF含量呈先上升后下降趋势，当纤维素酶添加量为0.06%时，SDF含量达到最大值7.135 mg/g。SDF含量随着纤维素酶添加量的继续增加呈下降趋势，此与田星等[16]研究的一致，可能是加入过量酶液导致一些SDF含量会被水解[16，22]的缘故。故确定纤维素酶最佳添加量为0.06%。
2.1.2 超声时间对SDF含量的影响
超声时间对SDF含量的影响见图2。
图2 超声时间对SDF含量的影响
Fig.2 Effects of ultrasonic time on SDF content
由图2可知，随着超声时间的延长，SDF含量呈先上升后下降趋势，当超声时间达120 min时，SDF含量达到最大值6.236 mg/g。下降的原因可能是随着超声时间的延长，超声波产生的剪切和空化作用切断SDF之间相连的键，使部分SDF降解[23]，生成不易被乙醇沉淀的小分子物质[24]，导致SDF含量下降。故确定最佳酶解时间为120 min。
2.1.3 pH值对SDF含量的影响
pH值对SDF含量的影响见图3。
图3 pH值对SDF含量的影响
Fig.3 Effects of pH on SDF content
由图3可知，随着pH值的增加，SDF含量呈先上升后下降趋势，并在pH值为5时，SDF含量达到最大值6.305 mg/g。故确定最佳酶解pH值为5.0。
2.1.4 超声功率对SDF含量的影响
超声功率对SDF含量的影响见图4。
图4 超声功率对SDF含量的影响
Fig.4 Effects of ultrasonic power on SDF content
由图4可知，随着超声功率的增大，SDF含量呈先上升后下降的趋势，并在超声功率为150 W时，SDF含量达到最高6.034mg/g。当功率超过150 W时SDF呈下降的趋势，可能由于超声作用钝化了酶的活性，甚至造成酶失活[25]，同时超声的空化作用可能破坏SDF的结构[26]，从而影响了SDF含量。故确定最佳超声功率为150 W。
2.2 响应面优化试验
2.2.1 响应面试验设计与结果
根据单因素试验结果，选取纤维素酶添加量（X1）、超声时间（X2）、pH 值（X3）、超声功率（X4）为考察因子，SDF含量为响应值，根据Box-Benhnken原理设计并进行响应面试验。试验因素水平设计见表1，试验方案及结果见表2。
表1 Box Behnken分析因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design
编码水平时间/min X3pH值 X4超声功率/W－1 0.04 100 4.5 120 0 0.06 120 5.0 150 1 0.08 140 5.5 180因素X1酶添加量/% X2超声
表2 Box Behnken试验方案与结果
Table 2 Box-Behnken design matrix and corresponding results
序号 X1酶添加量SDF含量/（mg/g）1 0 －1 0 －1 5.622 2 0 1 1 0 6.755 3 0 1 －1 0 4.600 4 0 0 1 －1 6.946 5 －1 0 －1 0 5.446 6 0 1 0 1 5.813 7 0 －1 1 0 7.042 8 0 0 0 0 7.824 9 1 0 0 1 6.356 10 0 0 0 0 8.782 11 0 1 0 －1 4.68 12 0 0 0 0 8.096 13 1 0 －1 0 5.989 14 －1 0 0 －1 4.009 15 0 0 0 0 8.479 16 －1 0 0 1 3.084 17 0 0 －1 1 6.882 18 0 －1 0 1 5.669 19 －1 －1 0 0 3.818 20 0 0 1 1 7.633 21 1 0 1 0 8.335 22 －1 1 0 0 3.962 23 0 0 0 0 7.824 24 1 1 0 0 3.85 25 0 －1 －1 0 6.483 26 －1 0 1 0 5.781 27 1 0 0 －1 4.664 28 0 0 －1 －1 6.547 29 1 －1 0 0 6.851 X2超声时间 X3pH值 X4超声功率
2.2.2 回归模型的建立及显著性检验
利用Design Expert 8.0软件对试验数据进行多元回归拟合，得到可溶性膳食纤维含量，对以上4个因素的二次多项回归方程为：
为说明回归方程的有效性以及各因素对响应值（Y）影响程度，因此对回归方程进行方差分析，结果如表3所示。
表3 回归方程方差分析
Table 3 Variance analysis for regression equation
注：* 表示差异显著，P<0.05；**表示差异极显著，P＜0.01；*** 表示差异高度显著，P＜0.001。
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 66.24 14 4.73 21.03<0.000 1 ***X1酶添加量 8.24 1 8.24 36.64<0.000 1 ***X2超声时间 2.83 1 2.83 12.57 0.003 2 **X3pH值 3.57 1 3.57 15.87 0.001 4 **X4微波功率 0.73 1 0.73 3.27 0.092 3 X1X2 2.47 1 2.47 10.99 0.005 1 **X1X3 1.01 1 1.01 4.49 0.052 4 X1X4 1.71 1 1.71 7.61 0.015 4 *X2X3 0.64 1 0.64 2.83 0.114 6 X2X4 0.29 1 0.29 1.31 0.271 5 X3X4 0.03 1 0.03 0.14 0.716 1 X12 26.81 1 26.81 119.18<0.000 1 ***X22 17.83 1 17.83 79.27 <0.000 1 ***X32 8.72×10-5 1 8.72×10-50.000 4 0.984 6 X42 11.18 1 11.18 49.71 <0.000 1 ***残差 3.15 14 0.22失拟项 2.43 10 0.24 1.374 0.407误差项 0.71 4 0.18总变异 69.39 28
由表3可知，模型P<0.000 1，表明回归模型高度显著；失拟项P=0.407>0.05，表明模拟失拟项不显著，表明模型合适，即试验数据有意义。决定系数R2是参数变量和总变量的比值，也是检测数据合理性的指标。当R2接近1时，表明模型与真实数据拟合度好[27]。本试验模型回归相关系数R2=0.954 6，说明相关性较好；矫正决定系数R2Adj=0.909 2，表明90.92%的试验数据的变异性可用此回归模型来解释，可用此模型对SDF含量进行分析和预测。回归方程系数的显著性分析：X1、X12、X22、X42对 SDF 含量的影响达到高度显著水平，X2、X3、X1X2对 SDF 含量的影响达到极显著水平，X1X4对SDF含量的影响达到显著水平。各试验因素的主效应关系依次是：酶添加量（X1）＞pH 值（X3）＞超声时间（X2）＞超声功率（X4）。
2.2.3 响应面交互作用分析
由表3可知，交互项X1X2、X1X4P值分别为0.0051、0.015 4，表明酶添加量与超声时间之间的交互影响达到极显著水平，酶添加量与超声功率之间的交互影响达到显著水平。图5和图6分别是根据上述回归方程绘出的响应曲面图及等高线图。
图5 酶添加量（X1）和超声时间（X2）对SDF含量影响的响应面及等高线图
Fig.5 Response surface and contour map of the effects of cellulase addition（X1）and ultrasound time（X2）on SDF content
图6 酶添加量（X1）和超声功率（X4）对SDF含量影响的响应面及等高线图
Fig.6 Response surface and contour map of the effects of cellulase addition（X1）and ultrasonic power（X4）on SDF content
响应曲面图直观地反映了这些因素对绿芦笋SDF含量的影响。等高线的形状可反映出交互效应的强弱[27]，两因素交互作用越强，等高线越接近椭圆，而圆形则表示交互作用不明显，且等高线越密集表明该因素的影响效果越大[28]。由图5和图6可看出，各影响因素对SDF含量的影响不是简单的线性关系，各等高线均呈椭圆形，表明两因素间的相互影响较显著。从图5可以看出，随着酶添加量和超声时间的增加，SDF含量呈先快速增高后逐渐降低的趋势，且酶添加量的响应面曲面较超声时间陡峭，表明酶添加量比超声时间影响大；从图6中可以看出，随着酶添加量和超声功率的增加，SDF含量呈先增加后降低的趋势，同样酶添加量曲面较陡峭，影响大于超声功率。
2.2.4 响应面因素水平优化结果及模型验证
通过回归模型，采用Design Expert8.0软件优化酶解工艺，得到最佳条件为：纤维素酶添加量0.066%、超声113.59 min，pH5.48，超声功率 171.58 W，预测芦笋可溶性膳食纤维含量可达到8.825 mg/g。
为检测响应面法所得结果的可靠性，根据试剂操作和设备性能，将上述最优条件修正为：纤维素酶添加量0.065%、超声114 min，pH5.50，超声功率180 W，进行3次重复试验，在此条件下实际测得芦笋可溶性膳食纤维含量为（8.807±0.014）mg/g，比预测值稍低，但该值落在响应值的95%预测区间 [8.384 mg/g，9.266 mg/g]内，表明所建回归模型具有良好的预测效果。
3 结论
本研究采用超声-酶法协同提取绿芦笋可溶性膳食纤维工艺，基于单因素试验，采用Box-Behnken试验设计和响应面分析法，拟合了酶添加量、超声时间、pH值、超声功率等4个因素对绿芦笋可溶性膳食纤维含量的回归模型。最终得到影响芦笋可溶性膳食纤维含量的主次因素依次为：酶添加量＞pH值＞超声时间＞超声功率。根据模型及响应面分析，进行修正后的最佳提取工艺为：纤维素酶添加量0.065%、超声时间114 min，pH 5.50，超声功率180 W。在此条件下，提取芦笋可溶性膳食纤维得率最高，验证试验得到的得率为8.807 mg/g。绿芦笋可溶性膳食纤维提取工艺的优化，为绿芦笋废弃老茎的综合利用提供较好的理论依据和数据参考。
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