淮山（Dioscorea opposita Thunb.）又名山药，是薯蓣科薯蓣属多年生薯蓣的块茎[1]。淮山作为传统的药食兼用食物，在我国有着上千年的食用历史，中医认为淮山有补脾养胃、生津益肺、固肾涩精的药用功效[2-3]。乳酸菌是一类能利用糖类发酵产生乳酸的革兰氏染色阳性细菌，部分乳酸菌已被证明具有抗氧化、提高机体免疫力、改善乳糖不耐症和防治腹泻等功效[4-8]。我国现有的乳酸菌发酵产品形式多样，其中大部分为乳制品，包括发酵乳、酸奶、奶酪等；而针对果蔬进行乳酸菌发酵的研究也有一些报道，比如马铃薯、紫甘薯、胡萝卜等[9-12]。植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）是目前较为常用的两种具有益生作用的乳酸菌[13-14]。在果蔬自然发酵过程中，植物乳杆菌属于优势菌种，具有较强的产酸能力和良好的耐酸性能；嗜热链球菌来源于动物体内，容易适应肠道环境，便于人体消化[15-16]。
目前关于乳酸菌发酵淮山的研究较少，且主要是采用单一菌种，而以淮山为单一原料，采用复合菌种进行发酵的研究鲜有报道[17-18]。利用复合菌种进行发酵可以丰富相关产品中有益菌种类及其活性物质，本文采用植物乳杆菌和嗜热链球菌组成的复合菌种对淮山进行发酵，并对发酵工艺进行优化，旨在为淮山复合益生菌发酵产品的开发提供试验依据。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
1.1.1 材料
淮山：产自湖南双峰县；嗜热链球菌、植物乳杆菌：由湖南农业大学食品科学技术学院保藏。
1.1.2 试剂
M17肉汤（生化试剂）：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；MRS肉汤、技术琼脂粉（均为生化试剂）：广东环凯微生物科技有限公司；α-1，4-葡萄糖水解酶（1.0×104U/g）、α-淀粉酶（3700 U/g）：北京索莱宝科技有限公司；蔗糖、柠檬酸、无水乙酸钠、无水乙醇、乙酸、氯化钠、蒽酮、浓硫酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；磷酸盐缓冲液：福建厦门海标科技有限公司；葡萄糖标准品：上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
GI54DWS型自动压力蒸汽灭菌器：致微（厦门）仪器有限公司；HPX-30085-Ⅲ型恒温恒湿箱：上海新苗医疗器械制造有限公司，PHS-3E型pH计：上海仪电科学仪器有限公司；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司；WFJ 7200型可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；Centrifuge 5804 R高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司。
1.3 方法
1.3.1 复合乳酸菌发酵淮山工艺流程
新鲜淮山→清洗→去皮→切片→护色（0.2%柠檬酸）→热烫→磨浆[料液比 1∶4（g/mL）]→糊化（95℃，30 min）→酶解（55℃，3 h）→添加蔗糖→高压蒸汽灭菌→接种→发酵
1.3.2 复合乳酸菌发酵淮山工艺单因素试验
单因素试验的因素固定水平为：发酵时间14 h、发酵温度40℃、蔗糖添加量3%、菌株接种量5%、菌株接种体积比（嗜热链球菌∶植物乳杆菌）1∶1，在此基础上每次改变一个因素的水平值，考察发酵时间（10、12、14、16、18 h）、发酵温度（36、38、40、42、44 ℃）、蔗糖添加量（1%、2%、3%、4%、5%）、菌株接种量（3%、4%、5%、6%、7%）和菌株接种体积比（1∶2、1∶1.5、1∶1、1.5∶1、2∶1）对活菌数和 pH 值的影响。
1.3.3 复合乳酸菌发酵淮山工艺正交试验
根据单因素试验的结果，选取发酵时间（A）、菌株接种量（B）和发酵温度（C）进行正交试验，考察其对复合乳酸菌活菌数的影响，确定发酵的最佳工艺条件。因素水平表见表1。
表1 因素水平表
Table 1 Factors and levels of the experiment
水平 因素A发酵时间/h B菌株接种量/% C发酵温度/℃1 12 4 40 2 14 5 42 3 16 6 44
1.3.4 发酵过程中多糖含量的测定
综合单因素和正交试验结果，在最优发酵条件下对淮山进行发酵。在发酵过程中，每隔3 h对发酵液中的多糖含量进行测定，并绘制24 h内多糖含量的动态变化曲线。
1.3.5 指标分析测定
pH值的测定：采用pH计直接测定。
活菌数的测定：采用平板菌落计数法。
多糖含量的测定参考蒽酮硫酸法[19]，具体操作如下。
样品处理：吸取发酵液20 mL于100 mL锥形瓶中，超声1.5 h，沸水加热1 h；加入1 mL 10%α-淀粉酶溶液和0.5 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液于锥形瓶中，60℃水浴酶解1 h，再加0.4 mL 5%α-1，4-葡萄糖水解酶溶液，55℃酶解1 h，沸水灭酶；取5 mL上述溶液，加入 95%乙醇 20 mL，4℃放置 12 h，离心（5 000 r/min，10 min）；残渣用80%乙醇洗涤，重复3次，残渣即为粗多糖，加20 mL蒸馏水复溶。
样品测定：吸取样品溶液和蒸馏水各1mL于10mL具塞试管中，冰水浴条件下向试管中加入6 mL蒽酮硫酸试剂，沸水中反应15 min，取出摇匀，冷水中静置7 min，490 nm处测吸光值。
2 结果与分析
2.1 不同发酵条件对淮山发酵的影响
2.1.1 发酵温度对pH值和活菌数的影响
发酵温度对pH值和活菌数的影响见图1。
图1 发酵温度对pH值和活菌数的影响
Fig.1 Effects of fermentation temperatures on pH value and viable count
过低或过高的温度都会导致细胞内酶活下降，影响产酸能力和发酵速度，不利于乳酸菌的生长。从图1可以看出，发酵温度对活菌数和pH值的影响较大，在36℃～42℃的范围内，随着温度的升高，活菌数呈现不断增加的趋势，并在42℃条件下活菌数达到最大值（8.23±0.02）lg（CFU/mL），继续升高温度时，活菌数开始下降；pH值则随发酵温度的升高不断降低，后趋于稳定。嗜热链球菌属于嗜热型微生物，细胞内的酶和蛋白质具有较强的抗热性，能在50℃以内的温度下生长；但植物乳杆菌属于嗜温微生物，温度高于40℃时，细胞内酶的催化能力会大大降低，甚至会导致其丧失催化活性，从而影响菌株的正常生长[20]。因此，本试验选择42℃作为适宜发酵温度。
2.1.2 发酵时间对pH值和活菌数的影响
发酵时间对pH值和活菌数的影响见图2。
图2 发酵时间对pH值和活菌数的影响
Fig.2 Effects of fermentation time on pH value and viable count
发酵时间会影响乳酸菌发酵产酸量及发酵的完全程度[21]。在发酵过程中，乳酸菌利用淮山浆液中的糖作为碳源，在对数生长期内快速增长，同时产生大量有机酸。当有机酸积累到一定程度后，乳酸菌活力下降，同时基质中的营养物质被大量消耗，营养物比例逐渐失衡，使得其走向衰亡期。从图2可以看出，随着发酵时间的延长，活菌数先增加后减少，而pH值则呈现持续降低的趋势。发酵14 h后，活菌数达到最高，为（8.43±0.06）lg（CFU/mL）。因此，在本试验条件下，复合乳酸菌发酵淮山的适宜发酵时间为14 h。
2.1.3 菌株接种量对pH值和活菌数的影响
菌株接种量对pH值和活菌数的影响见图3。
图3 菌株接种量对pH值和活菌数的影响
Fig.3 Effects of inoculation amount on pH value and viable count
接种量会影响菌株进入对数生长期的速度和菌株的生长周期[20]。从图3可以看出，在菌株接种量增加的过程中，乳酸菌的活菌数呈现先增后减的趋势，当接种量为4%时，活菌数达到最大值（8.89±0.03）lg（CFU/mL），此时pH值为4.05±0.01。菌株接种量较低时，乳酸菌繁殖基数小，活菌数增长缓慢，而加大接种量则能有效缩短延滞期，也能使淮山浆液中的营养物质被充分利用；但另一方面，淮山浆液所能提供的营养物质又是有限的，接种量过大会使得营养物质被过快消耗，同时产生大量的代谢产物，导致部分乳酸菌缺乏生长所需的能量，生长受到限制并提早进入衰亡期[22]。综合考虑，本试验选择4%作为复合乳酸菌发酵淮山的适宜菌株接种量。
2.1.4 蔗糖添加量对pH值和活菌数的影响
蔗糖添加量对pH值和活菌数的影响见图4。
从图4可以看出，随着蔗糖添加量的增加，乳酸菌的活菌数呈现先增后减的趋势，在蔗糖添加量为2%～4%的范围内，活菌数的变化波动较小。在此条件下，复合乳酸菌发酵淮山的适宜蔗糖添加量为3%。
嗜热链球菌和植物乳杆菌均能利用蔗糖作为碳源；但在氮源含量不变的情况下，单方面提高蔗糖添加量容易造成基质中的碳氮比失衡，从而导致乳酸菌提早衰亡；此外，蔗糖含量过高会造成高渗透压环境，对乳酸菌有一定的脱水作用，可抑制其生长[4，23]。
图4 蔗糖添加量对pH值和活菌数的影响
Fig.4 Effects of sucrose content on pH value and viable count
2.1.5 菌株接种体积比对pH值和活菌数的影响
菌株接种体积比对pH值和活菌数的影响见图5。
图5 菌株接种体积比对pH值和活菌数的影响
Fig.5 Effects of strain inoculation volume ratio on pH value and viable count
从图5可以看出，嗜热链球菌比例的增加会导致活菌数呈现先增后减的趋势，并且在菌株接种体积比为 1∶1 时，活菌数达到最大值（8.63±0.04）lg（CFU/mL），此时pH值为4.34±0.01。
嗜热链球菌和植物乳杆菌之间存在种间共存关系，并且嗜热链球菌属于其中的优势菌种[24]。接种后，嗜热链球菌生长很快，较早进入对数生长期并且大量产酸，使得发酵体系的pH值快速下降，并会刺激植物乳杆菌的生长；但当接种比例过高时，嗜热链球菌会迅速消耗基质中的营养物质，影响后期植物乳杆菌的生长，导致复合菌株之间的促生长能力降低和活菌总数下降。因此本试验选择菌株接种体积比为1∶1进行下一步研究。
2.2 复合乳酸菌发酵淮山工艺优化
为了进一步优化发酵工艺，根据单因素试验的结果，选取发酵时间、发酵温度和菌株接种量进行正交试验，考察它们对乳酸菌活菌数的影响。正交试验结果见表2。
表2 正交试验结果
Table 2 The results of orthogonal test
（CFU/mL）1 1 1 1 1 7.91 2 1 2 2 2 7.66 3 1 3 3 3 7.62 4 2 1 2 3 7.95 5 2 2 3 1 8.28 6 2 3 1 2 8.46 7 3 1 3 2 8.18 8 3 2 1 3 8.59 9 3 3 2 1 8.11 K1 23.19 24.04 24.96 24.30 K2 24.69 24.53 23.72 24.30 K3 24.88 24.19 24.08 24.16 k1 7.73 8.01 8.32 8.10 k2 8.23 8.18 7.91 8.10 k3 8.29 8.06 8.03 8.05 R 0.56 0.17 0.41 0.05因素主次 A＞C＞B最优方案 A3B2C1编号 A发酵时间B菌株接种量C发酵温度 空白 活菌数/lg
由表2可知，对发酵体系中活菌数的影响因素依次为A>C>B，最佳方案为A3B2C1，即发酵时间16 h、菌株接种量5%、发酵温度40℃。在最优条件下进行3组重复验证试验，试验结果表明发酵结束后体系中乳酸菌活菌数为（8.62±0.02）lg（CFU/mL）。与正交试验结果基本相符，证明结果可信。黄天等[21]采用Lactobacillus plantarum P-8和Bifidobacterium lactis V9发酵淮山，在发酵时间19.1 h、发酵温度37℃的条件下活菌数可达到8.63 lg（CFU/mL）；刘聪慧等[10]采用保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌和动物双歧杆菌发酵马铃薯，在接种量5%、各菌种间接种体积比为1∶1、发酵温度40℃的条件下活菌数可达到8.97 lg（CFU/mL），本试验取得了与之相近的研究结果。
2.3 发酵过程中多糖含量的动态变化
发酵过程中多糖含量的动态变化见图6。
淮山多糖是淮山中主要的活性成分，包含均多糖、杂多糖和糖蛋白，其中均多糖主要由葡萄糖构成，杂多糖主要由葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖等单糖构成[2，25]。嗜热链球菌在发酵过程中能利用乳糖、果糖、蔗糖和葡萄糖产酸，植物乳杆菌在发酵过程中能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、纤维二糖、木糖、果糖等产酸[4，26]。从图6可以看出，随着发酵时间的延长，发酵体系中的多糖含量呈现不断下降的趋势。这可能是因为淮山多糖在乳酸菌发酵过程中被水解利用[4]。在发酵前期，乳酸菌生长处于延滞期，对营养物质的利用较低，此时淮山多糖含量变化不大；在发酵3 h～15 h内乳酸菌活菌数呈现对数增长，多糖含量则显著降低；在发酵15 h之后乳酸菌的活菌数趋于稳定，而多糖含量的变化也同样趋于稳定，说明乳酸菌活菌数的增加与淮山多糖的减少密切相关，证明乳酸菌可以利用淮山多糖作为其营养物质。
图6 发酵过程中多糖含量的动态变化
Fig.6 Dynamic change of polysaccharide content during fermentation
不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
3 结论
本试验结果表明，以植物乳杆菌和嗜热链球菌组成的复合乳酸菌在单一的淮山浆液中能很好地进行发酵，活菌数超过8.00 lg（CFU/mL）；通过工艺优化，确定了较优的工艺条件，提高了发酵体系中的活菌总数；同时，发酵过程中多糖含量的动态变化证明乳酸菌可以利用淮山多糖，为淮山复合乳酸菌发酵产品的研究和开发提供参考和依据。
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