杏鲍菇属于伞菌目、侧耳科、侧耳属[1]，因其营养丰富口感鲜美，具有草原牛肝菌之称[2]。杏鲍菇营养物质丰富，蛋白质、膳食纤维含量较多，脂肪、灰分含量少，是优质的蛋白来源。杏鲍菇蛋白的抗炎性、抗病毒性以及抗氧化性等功能已经得到研究人员证实[3-4]。杏鲍菇蛋白中具有人体必需氨基酸，在进入人体消化系统后生成分子量不同的肽，其中小分子肽对降血压、提高人体免疫力，以及预防癌症等均有良好的功效，已逐渐成为研究热点[5-6]。现已有研究人员对杏鲍菇蛋白的提取方式进行了研究，本文在已有研究的基础上将超声与纤维素酶解的方式结合在一起，通过响应面分析进一步优化杏鲍菇蛋白提取方式，显著提高了提取率，为下一步杏鲍菇蛋白功能活性研究奠定了基础[7-10]。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 材料与试剂
杏鲍菇：济南华联超市；考马斯亮蓝G-250染料试剂、牛血清蛋白标准品：美国Sigma公司；纤维素酶（400 U/mg）：上海源叶有限公司；氢氧化钠（片状）：国药集团化学试剂有限公司；盐酸（分析纯）：莱阳经济技术开发区精细化工厂。
1.1.2 仪器与设备
SHZ-A水浴恒温振荡器：上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；SB25-12DTb超声水浴锅、SCIENTZ-10N冷冻干燥机：宁波新芝生物科技股份有限公司；AR423CN电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；CR22GⅢ高速冷冻离心机：日本日立（HITACHI）公司；SG2便携式pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；UV-6100型紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；GZX-9240MBE电热鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；78HW-1型恒温磁力搅拌器：江苏省金坛市荣华仪器制造公司。
1.2 试验方法
1.2.1 杏鲍菇粉末的制备
将杏鲍菇清洗后切片，放入50℃电热鼓风干燥箱中烘干，使用高速粉碎机打粉后过100目筛，置于干燥器中保存。
1.2.2 杏鲍菇蛋白的提取
取定量杏鲍菇干粉，按照试验设计选取料液比、时间、温度、pH值，杏鲍菇粉末水提一定时间后8000r/min离心10min，取上清液，用考马斯亮蓝法测定蛋白含量。
1.2.3 牛血清蛋白标准曲线绘制
称取29.25 g NaCl固体溶于500 mL去离子水中，配置成0.15 mol/L NaCl溶液，0.1 g牛血清蛋白溶于1 000 mL去离子水中配置成100 μg/mL的标准蛋白溶液[11]。取 7 个干净的试管编号 0、1、2、3、4、5、6，向每只试管中分别加入 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 的标准蛋白溶液后，每只试管中分别加入 1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4 mL的NaCl溶液，再分别加入5 mL的考马斯亮蓝G-250溶液[12-13]，混匀后静置5 min，以0号试管作为空白对照，于595 nm处测定吸光值。得出线性方程为y=0.008 8x+0.008 3，相关系数R2=0.998 8。
1.2.4 指标的测定
杏鲍菇总蛋白含量采用凯氏定氮法测定；上清液中蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定；杏鲍菇蛋白提取率的计算：蛋白提取率/%=（上清液中蛋白含量/杏鲍菇总蛋白含量）×100[12]。
1.2.5 单因素试验设计
1.2.5.1 料液比对蛋白提取率的影响
杏鲍菇粉1 g，超声功率300 W，超声20 min，研究1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40（g/mL）料液比对杏鲍菇蛋白提取率的影响[14-17]。
1.2.5.2 超声功率对蛋白提取率影响
杏鲍菇粉 1 g，料液比 1∶30（g/mL），超声功率分别为 100、200、300、400、500 W，超声 20 min。
1.2.5.3 超声时间对蛋白提取率得影响
杏鲍菇粉 1 g，料液比 1 ∶30（g/mL），超声功率400 W，分别超声 10、15、20、25、30 min。
1.2.5.4 纤维素酶酶解时间对蛋白提取率的影响
向超声后的样品中添加杏鲍菇粉质量2%的纤维素酶，pH 7.0，酶解温度 20 ℃，分别酶解 25、30、35、40、45 min。
1.2.5.5 纤维素酶酶解pH值对蛋白提取率的影响
向超声后的样品中添加杏鲍菇粉质量2%的纤维素酶，酶解温度20℃，酶解时间30 min，酶解pH 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0。
1.2.5.6 纤维素酶酶解温度对蛋白提取率的影响
向超声后的样品中添加杏鲍菇粉质量2%的纤维素酶，酶解pH 7.0，酶解时间30 min，酶解温度25、30、35、40、45、50 ℃。
1.2.5.7 纤维素酶添加量对蛋白提取率的影响
纤维素酶酶解pH 7.0，酶解时间30 min，酶解温度20℃，纤维素酶添加量为杏鲍菇粉质量的1%、2%、3%、4%、5%[18-20]。
1.2.6 响应面试验设计
在单因素试验基础上，选取具有显著影响的功率（A）、时间（B）、料液比（C）、纤维素酶添加量（D）为自变量，杏鲍菇蛋白提取率为响应值（Y），使用Design-Expert 8.0.5b软件Box-Behnken中心组和试验设计原理，进行四因素三水平响应面分析，建立杏鲍菇蛋白提取率的二次多项式数学模型[21-22]。试验因素及编码水平见表1。
表1 试验因素与水平表
Table 1 Experimental factors and level table
水平D纤维素酶添加量/%-1 300 10 1∶15 1 0 400 20 1∶20 2 1 500 30 1∶25 3因素A功率/W B时间/min C料液比/（g/mL）
1.3 数据分析
使用Excel和Design-Expert 8.0.5b进行数据分析和绘图。
2 结果与分析
2.1 杏鲍菇蛋白提取率影响因素的研究
2.1.1 料液比对杏鲍菇蛋白提取率的影响
不同料液比对杏鲍菇蛋白提取率的影响见图1。
图1 料液比对杏鲍菇蛋白提取率的影响
Fig.1 Effect of ratio of material to liquid on protein extraction rate of Pleurotus eryngii
分析图1得出，随着液体体积增大，蛋白提取率增加，在料液比1∶30（g/mL）时提取率最大，此后随液体体积的增大蛋白提取率呈下降趋势。在液体体积较低时杏鲍菇粉扩散作用较弱，蛋白提取率低；当液体体积较高时，蛋白与溶液之间的浓度差较小不利于蛋白溶出。因此选择料液比1∶30（g/mL）进行下一步试验。
2.1.2 超声功率对蛋白提取率的影响
不同超声功率对蛋白提取率的影响试验结果见图2。
分析图2得出，杏鲍菇蛋白提取率在100 W～400 W范围内，随超声功率的提高逐渐增大，在超声功率400W时达到最大，此后超声功率提高，蛋白提取率下降。在随着超声功率增大的过程中，超声破碎杏鲍菇的细胞壁使其细胞中的蛋白溶出，蛋白提取率增加；超声功率继续增大，超声破坏已溶出的蛋白质，蛋白提取率降低。
2.1.3 超声时间对蛋白提取率的影响
不同超声时间对蛋白提取率的影响试验结果如图3所示。
图2 超声功率对杏鲍菇蛋白提取率的影响
Fig.2 Effect of ultrasonic power on protein extraction rate of Pleurotus eryngii
图3 超声时间对杏鲍菇蛋白提取率的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic time on protein extraction rate of Pleurotus eryngii
在10 min～20 min范围内，随着超声时间的延长，蛋白提取率增大，在20 min时达到最大，随着时间继续增加，蛋白提取率降低。超声前期杏鲍菇细胞破碎蛋白溶出，提取率升高；后期超声过程中，破碎已溶出的蛋白，同时超声时间过长产生热量对蛋白具有破坏作用，故提取率降低。
2.1.4 纤维素酶酶解时间对蛋白提取率的影响
不同纤维素酶酶解时间对杏鲍菇蛋白提取率的影响试验结果如图4所示。
图4 纤维素酶酶解时间对杏鲍菇蛋白提取率的影响
Fig.4 Effect of cellulase hydrolysis time on protein extraction rate of Pleurotus eryngii
在25 min～35 min范围内，随着酶解时间的增加，蛋白提取率增大，在35 min时达到最大，随后呈现下降的趋势。随着时间继续增加，纤维素酶进一步对破碎后的杏鲍菇细胞壁进行水解，蛋白质溶出，提取率升高；时间增加，凝集沉淀，提取率降低。
2.1.5 纤维素酶酶解pH值对蛋白提取率的影响
不同纤维素酶酶解pH值对杏鲍菇蛋白提取率的影响试验结果如图5所示。
图5 纤维素酶酶解pH值对蛋白提取率的影响
Fig.5 Effect of cellulase hydrolysis pH value on protein extraction rate
pH 4.0时，杏鲍菇蛋白提取率最低，因为该pH值位于杏鲍菇等电点附近，蛋白凝集沉淀，提取率最低。pH 6.0时蛋白提取率最高，此时纤维素酶活性最大，蛋白质-水相互作用增强，溶解性提高；此后，随pH值增大，纤维素酶活性降低，提取率降低。
2.1.6 纤维素酶酶解温度对蛋白提取率的影响
不同纤维素酶酶解温度对蛋白提取率影响试验结果如图6所示。
图6 纤维素酶酶解温度对杏鲍菇蛋白提取率的影响
Fig.6 Effect of cellulase hydrolysis temperature on protein extraction rate of Pleurotus eryngii
分析图6可以看出，杏鲍菇蛋白提取率呈现先升高后下降趋势，温度30℃时，提取率最高，纤维素酶活性最大；温度继续升高，纤维素酶活性下降，杏鲍菇蛋白受热分解，提取率下降。
2.1.7 纤维素酶添加量对蛋白提取率的影响
不同的纤维素酶添加量对杏鲍菇蛋白提取率的影响试验结果如图7所示。
图7 纤维素酶添加量对杏鲍菇蛋白提取率的影响
Fig.7 Effect of cellulase addition on protein extraction rate of Pleurotus eryngii
随着纤维素酶添加量的增加，蛋白提取率呈现先升高后下降的趋势，在添加量为2%时蛋白提取率最高，在一定的料液比情况下随纤维素酶增加蛋白提取率升高，纤维素酶添加量增大，总固形物含量上升，杏鲍菇粉扩散作用减弱，同时纤维素酶扩散作用降低，蛋白提取率降低。
2.2 响应面试验设计分析与提取工艺优化
2.2.1 二次回归方程模型的建立
固定纤维素酶酶解时间35 min，纤维素酶酶解pH 6.0，纤维素酶酶解温度30℃，以有显著影响的功率、时间、料液比、纤维素酶添加量为自变量，杏鲍菇蛋白提取率为响应值，试验设计与试验结果见表2[8，21-23]。
表2 响应面试验设计及结果
Table 2 Response surface experiment design and results
序号 A B C D 蛋白提取率/%1 1 0 1 0 32.8 2-1-1 0 0 34.2 3 0 0 0 0 39.6 4-1 0 0-1 31.2 5 0-1 0-1 33.6 6 0 0 1 1 31.5 7 0 1 1 0 34.8 8 0-1-1 0 30.7 9 0 0 0 0 36 10 0 1 0 1 29.6 11 0 0 1-1 30.1 12-1 0 0 1 28 13 0 0-1-1 27.8 14 0-1 0 1 31 15 0 0-1 1 22.8 16 1 0 0-1 30.1 17 0 1-1 0 22 18 0 0 0 0 35.8
续表2 响应面试验设计及结果
Continue table 2 Response surface experiment design and results
序号 A B C D 蛋白提取率/%19-1 0 1 0 28.6 20-1 1 0 0 30.9 21 1 0-1 0 23.7 22 0 1 0-1 30.4 23 0 0 0 0 35.2 24-1 0-1 0 28 25 1 0 0 1 30.6 26 0 0 0 0 38.6 27 1-1 0 0 33.4 28 1 1 0 0 28.5 29 0-1 1 0 30.4
采用Design-Expert 8.0.5b数据分析软件进行试验结果的回归分析，得到关于蛋白提取率（Y）以及A、B、C、D 的回归模型：Y=37.04-0.067A-1.34B+2.77C-0.81D-0.15AB+2.12AC+0.92AD+3.27BC+0.45BD+1.60CD-3.22A2-2.03B2-5.44C2-3.75D2。
回归模型方差分析如表3所示。
该模型F=21.56，P<0.001，显示为杏鲍菇蛋白提取效果回归模型极显著；回归方程失拟项的F值为0.17表明失拟项与误差项相比效果不明显；决定系数R2=0.955 7，显示出此模型的拟合程度较好，能够使用该模型对杏鲍菇蛋白提取进行预测分析。
2.2.2 交互作用分析
在该模型A、B、C、D 4个因素中C因素效果极显著，B、D因素效果显著，A不显著；交互作用中，AB、AD、BD交互作用不显著，AC、CD交互作用显著，BC交互作用极显著；在二次项中A2、C2、D2效果极显著，B2效果显著；由F检验可以看出A、B、C、D四个因素对蛋白提取率的影响为C>B>D>A，即料液比>超声时间>纤维素酶添加量>超声功率。
表3 回归模型方差分析
Table 3 Regression model analysis of variance
注：*P<0.05，差异显著；**P<0.01，差异极显著。
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 462.970 9 14 33.069 35 21.562 45 <0.000 1 **A功率 0.27 1 0.27 0.176 05 0.681 2 B时间 24.367 5 1 24.367 5 15.888 52 0.001 4 *C料液比 91.853 33 1 91.853 33 59.891 79 <0.000 1 **D纤维素酶添加量 7.840 833 1 7.840 833 5.112 515 0.040 2 *AB 0.64 1 0.64 0.417 304 0.528 7 AC 18.062 5 1 18.062 5 11.777 42 0.004 0 *AD 3.422 5 1 3.422 5 2.231 597 0.157 4 BC 42.902 5 1 42.902 5 27.974 03 0.000 1 **BD 0.81 1 0.81 0.528 15 0.479 4 CD 10.24 1 10.24 6.676 861 0.021 6 *A2 70.602 17 1 70.602 17 46.035 24 <0.000 1 **B2 28.924 13 1 28.924 13 18.859 61 0.000 7 *C2 189.087 6 1 189.087 6 123.292 1 <0.000 1 **D2 89.360 88 1 89.360 88 58.266 62 <0.000 1 **剩余 21.471 17 14 1.533 655失拟项 6.479 167 10 0.647 917 0.172 87 0.988 8纯误差 14.992 4 3.748总和 484.442 1 28 R2=0.955 7 R2Adj=0.911 4
2.2.3 响应面分析与优化
各因素交互作用对杏鲍菇蛋白提取率的响应面图见图8。
在图 8（a）～（c）中，响应面图的形状起伏越大，两个因素之间差异越明显。等高线图中，等高线形状趋近于椭圆形则交互作用明显，若等高线形状趋近于圆形则交互作用不明显。
图8（a）中，当超声时间以及纤维素酶添加量一定时，随超声功率以及料液比的变化，蛋白质提取率整体呈现先升高后下降的趋势，料液比变化幅度大于超声功率，提取率最高为35.7%。等高线图呈现椭圆形，交互作用显著。
图8 各因素交互作用对杏鲍菇蛋白提取率的响应面图
Fig.8 Response surface diagram of the interaction of various factors on the protein extraction rate of Pleurotus eryngii
图8（b）中，当超声功率与纤维素酶添加量一定时，随着超声时间与料液比的变化，蛋白提取率整体变化明显，响应面图中随着超声时间的变化蛋白提取率变化明显，先升高后下降的趋势明显，料液比变化幅度大于超声时间，提取率最高为36.7%。等高线图中呈现椭圆形，超声时间与料液比的交互作用极显著。
图8（c）中，当超声时间与超声功率一定时，随着料液比和纤维素酶添加量的变化，响应面图蛋白提取率整体变化明显，料液比变化幅度大于纤维素酶添加量，提取率最高为35.4%。等高线图呈现椭圆形，交互作用显著。
2.2.4 回归模型验证
Design-Expert 8.0.5b分析结果表明，最佳料液比为1∶30.31（g/mL）、超声功率398.7 W、超声时间 20.4 min、纤维素酶添加量1.92%。杏鲍菇蛋白提取率理论值为75.1%。根据实际修正为料液比1∶30（g/mL）、超声功率400 W、超声时间20 min、纤维素酶添加量2%，得到的杏鲍菇蛋白提取率为75.7%，相对偏差0.79%，可见该模型能够较好预测蛋白提取条件。
3 结论
对杏鲍菇蛋白提取的研究，从料液比、超声功率、超声时间、纤维素酶酶解时间、纤维素酶酶解pH值、纤维素酶酶解温度、纤维素酶添加量7个方面对杏鲍菇蛋白提取影响因素进行了研究，选取了4个具有显著影响效果的因素进行响应面分析，由F检验得出对杏鲍菇蛋白提取效果影响顺序为料液比>超声时间>纤维素酶添加量>超声功率。优化后得到最佳提取条件为料液比 1∶30（g/mL）、超声功率 400 W、超声时间 20 min、纤维素酶添加量2%。实际提取率75.7%，理论提取率75.1%，相对偏差0.79%，证明该模型可行，为杏鲍菇蛋白的提取提供了依据。杏鲍菇具有巨大的开发潜力，国内外学者对杏鲍菇的研究较少，因此，为了充分开发利用杏鲍菇，提高杏鲍菇深加工产业的发展仍需加大科研力度，完善杏鲍菇蛋白提取方法，符合工业生产要求，提高生产效率。
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