几丁质（chitin）是由N-乙酰氨基葡萄糖通过β-（1，4）键连接的线性多糖[1]，也是地球上含量仅次于纤维素的天然多糖生物大分子[2]，但因其不溶于水和一般有机溶剂，难以开发利用其商业价值[3]。壳聚糖（chitosan）是几丁质脱乙酰度大于55%的产物[4]，也是目前已知唯一的碱性多糖[5]。壳聚糖分子链上存在的游离氨基使其溶解性能优于几丁质[6]。此外，壳聚糖还具有良好的降解性和生物相容性，对人体无害，并且具有抑菌、降血压、降胆固醇和抗癌等作用，广泛应用于食品、医药、农业、化工、化妆品和环境治理等领域[7-10]。
目前，壳聚糖的制备方法有化学热碱法和生物酶法[11]。热碱法是工业上最常用的方法，即向40%的氢氧化钠或氢氧化钾中加入几丁质后70℃加热制备壳聚糖[12]。该方法虽操作简单，但存在反应时间长、产品脱乙酰度不稳定和排放物污染环境等缺点[13]。生物酶法利用几丁质脱乙酰酶（chitin deacetylase，CDA）催化几丁质脱乙酰制备壳聚糖[14]，其反应条件温和，产品的脱乙酰度稳定、可控，最为关键的是生产过程绿色环保[15]。CDA在碳水化合物活性酶数据库（www.cazy.org）中属于碳水化合物脂酶家族4（carbohydrate esterase family 4，CE4）[16]。来自海洋节杆菌 Arthrobacter sp.AW19M34-1的CDA（ArCE4）是目前已知唯一可以催化不溶性几丁质脱去乙酰基的细菌CDA，易于在大肠杆菌中可溶性表达[17]。但是，重组ArCE4稳定性和活性容易受温度、pH值和其它外界因素的影响，增加了壳聚糖生产成本。
固定化酶技术为提高CDA稳定性提供了有效的解决途径。固定化酶技术将游离酶制作成具有催化活性但不溶于水的固相酶，提高了生物酶的稳定性[18]。游离酶经过固定后还易于从产物中分离，可以循环使用，降低了生产成本[19]。海藻酸钠包埋法是最常用和最有效的酶固定方法之一[20]，该法不会对酶的构象产生影响，并且酶活回收率高，但包埋条件对酶活影响较大[21]。基于此，本研究设计单因素试验与响应面试验对海藻酸钠包埋固定ArCE4的工艺进行优化，并研究固定化酶的酶学性质和操作稳定性。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
重组Arthrobacter sp.CDA：江苏海洋大学海洋生物酶工程实验室制备保存；海藻酸钠、氯化钙（calcium chloride，CaCl2）：国药集团化学试剂有限公司；戊二醛（glutaric dialdehyde，GA）：阿拉丁试剂有限公司；对硝基-N-乙酰苯胺：上海博微生物科技有限公司。所用试剂皆为分析纯。
1.2 仪器与设备
电热恒温水浴锅（HW·SY）：海源仪器厂；高速冷冻离心机（日立CR 22G）：日本HITACHI公司；新世纪紫外可见分光光度计（T6）：北京普析通用仪器有限责任公司。
1.3 方法
1.3.1 固定化酶的制备
参考王静等[22]以海藻酸钠为载体、戊二醛为交联剂对L-阿拉伯糖异构酶固定的方法，对CDA进行固定。将海藻酸钠溶液与酶液按2∶1（体积比）混合，搅拌均匀。用5 mL注射器将上述混合溶液以缓慢速度滴入CaCl2溶液中，形成尺寸相似的固定化酶凝胶颗粒。4℃静置硬化一段时间，用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）与超纯水洗涤凝胶颗粒。干燥后加入一定浓度的GA溶液，25℃振荡交联数十分钟后，用PBS与超纯水洗涤凝胶颗粒，4℃保存在PBS中用于后续试验。
1.3.2 单因素试验优化固定条件
以30.0 g/L的海藻酸钠，30.0 g/L的CaCl2，静置硬化4 h，0.05%的GA溶液，振荡交联30 min为基本条件，分别对海藻酸钠浓度、CaCl2浓度、静置硬化时间、GA浓度和振荡交联时间进行单因素优化。
1.3.3 响应面法优化固定条件
基于单因素试验结果，选取对固定化CDA酶活影响较大的海藻酸钠浓度、CaCl2浓度和静置硬化时间为考察因素，以CDA的酶活为考察指标，根据Box-Behnken原理设计三因素三水平响应面试验，试验设计见表1。使用Design-Expert.V8.0.6.1软件对结果进行响应面回归分析。
表1 响应面法分析因素及水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiment
水平 因素A海藻酸钠浓度/（g/L）B CaCl2浓度/（g/L）C硬化时间/h-1 27 27 1.7 0 30 30 2 1 33 33 2.3
1.3.4 最优条件验证试验
分析响应面法试验数据得到最优的CDA固定条件，用该条件进行5次重复验证，测定固定化CDA的相对酶活，取其平均值与预测值比较。
1.3.5 固定化CDA酶学性质的测定
1.3.5.1 热稳定性
将固定化酶和游离酶分别置于 20、30、40、50、60℃水浴锅中保温2 h后，于30℃进行酶促反应，测定酶活性以研究固定化酶的热稳定性。
1.3.5.2 pH值稳定性
将固定化酶和游离酶分别置于pH 3～9的缓冲液中保存20 h后，于30℃进行酶促反应，测定酶活性以研究固定化酶的pH值稳定性。
1.3.5.3 操作稳定性
将固定化酶在相同条件下连续操作10次，测定相对酶活。
1.3.6 CDA酶活性的测定
参考来蒋丽等[23]测定CDA酶活性的方法并稍作修改。试管中加入3 mL 0.05 mol/L pH 7.0的PBS和1 mL 200 mg/L的对硝基-N-乙酰苯胺溶液，30℃预处理15min后加入1mL酶液，酶促反应30min，沸水浴终止酶促反应，5000r/min离心15min，取上清液在400nm处测定上清液吸光值。空白对照组添加1 mL灭活酶液，其余不变。
固定化酶活性的测定是以0.5 g固定化酶代替1 mL游离酶，酶促反应30 min后取出固定化酶颗粒终止反应。以添加0.5 g用灭活酶液制作的固定化酶颗粒为空白对照。
1.3.7 数据处理与分析
每组试验设置3组平行试验，用平均值±标准方差的形式表示试验结果，并用SPSS Statistics 25.0软件对结果进行统计学分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 海藻酸钠浓度对固定化酶活性的影响
海藻酸钠浓度对固定化酶活性的影响见图1。
图1 海藻酸钠浓度对固定化酶活性的影响
Fig.1 Effect of sodium alginate concentration on the immobilized enzyme
如图1所示，固定化酶活性随着海藻酸钠浓度的增加而升高，当浓度达到30.0 g/L时酶活性最高；随着海藻酸钠浓度继续升高，酶活性显著降低。这可能因为当海藻酸钠浓度过低时，与CaCl2反应形成的凝胶颗粒孔径大，CDA包埋不紧密，易流失，所以酶活性低；当浓度过高时，溶液黏度大，与CDA溶液混合时酶液分散不均匀，并且制成的凝胶颗粒形状不规则，有拖尾，影响CDA与底物结合，所以酶活性降低。
2.1.2 CaCl2浓度对固定化酶活性的影响
CaCl2浓度对固定化酶活性的影响见图2。
图2 CaCl2浓度对固定化酶活性的影响
Fig.2 Effect of CaCl2concentration on the immobilized enzyme
如图2所示，当CaCl2浓度为30.0 g/L时，固定化酶活性最高。推测原因为Ca2+浓度过低时，凝胶交联度低，颗粒不易形成，酶包埋不紧密，流失过多，所以酶活性低；Ca2+浓度过高时，凝胶过度交联，颗粒表面布满Ca2+，网状结构孔径小，阻碍酶与底物结合，所以酶活性低。
2.1.3 硬化时间对固定化酶活性的影响
硬化时间对固定化酶活性的影响见图3。
图3 硬化时间对固定化酶活性的影响
Fig.3 Effect of solidifying time on the immobilized enzyme
如图3所示，硬化2 h时，固定化酶活性最高；继续硬化，酶活性降低。说明硬化时间过长会导致交联过度，凝胶颗粒表面网状结构孔径小，CDA包埋过于紧密，底物难以与其结合。
2.1.4 GA浓度对固定化酶活性的影响
GA浓度对固定化酶活性的影响见图4。
图4 GA浓度对固定化酶活性的影响
Fig.4 Effect of glutaric dialdehyde concentration on the immobilized enzyme
如图4所示，当GA浓度为0.025%时，固定化酶活性最高；当GA浓度增加时，酶活性显著降低。这可能因为适当浓度的GA可以强化海藻酸钠分子与CDA的交联，增加固定化CDA的稳定性，而高浓度的GA溶液会使蛋白质变性，从而导致丧失酶活性。
2.1.5 交联时间对固定化酶活性的影响
交联时间对固定化酶活性的影响见图5。
图5 交联时间对固定化酶活性的影响
Fig.5 Effect of cross-linking time on the immobilized enzyme
如图5所示，固定化酶活性随着交联时间的增加而提高，当交联时间为30 min时，酶活性最高；继续延长交联时间，酶活性降低。这是因为在GA的作用下，CDA与海藻酸钠凝胶活性位点进行结合，当结合位点达到饱和时，GA开始影响CDA的酶活，导致酶活性降低。
2.2 响应面试验结果
2.2.1 响应面数据分析
试验设计与结果见表2。
对结果进行响应面分析，得到固定化酶活性（U）对海藻酸钠浓度（A）、CaCl2浓度（B）和静置硬化时间（C）的三元二次回归方程为：
表2 响应面法试验设计与结果
Table 2 Design and results of response surface experiment
试验号 A海藻酸钠浓度/（g/L）酶活/（U/mL）1 33 30 2.3 1.608 2 27 30 2.3 1.338 3 30 33 2.3 1.06 4 30 30 2 1.944 5 30 27 1.7 1.163 6 30 30 2 2.028 7 33 33 2 1.044 8 27 30 1.7 1.912 9 27 27 2 1.328 10 33 27 2 1.286 11 30 30 2 1.9 12 27 33 2 1.791 13 30 30 2 2.119 14 33 30 1.7 1.487 15 30 27 2.3 1.234 16 30 30 2 2.192 17 30 33 1.7 1.728 B CaCl2浓度/（g/L）C硬化时间/h
回归方程的方差分析见表3。
表3 回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance in regression model
注：*表示差异显著，P＜0.05；** 表示差异极显著，P＜0.01。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型浓度 2.23 9 0.25 15.13 0.000 8 **A海藻酸钠浓度0.11 1 0.11 6.83 0.034 8 *B CaCl2浓度0.047 1 0.047 2.86 0.134 7 C硬化时间 0.14 1 0.14 8.42 0.022 9 *AB 0.12 1 0.12 7.6 0.028 2 *AC 0.12 1 0.12 7.39 0.029 9 *BC 0.14 1 0.14 8.34 0.023 4 *A2 0.16 1 0.16 9.5 0.017 8 *B2 0.98 1 0.98 59.87 0.000 1 **C2 0.28 1 0.28 17.16 0.004 3 **残差 0.11 7 0.016失拟项 0.056 3 0.019 1.29 0.391 6纯误差 0.058 4 0.015总差 2.34 16
对测得的固定化酶活性进行方差分析，模型的P值=0.000 8＜0.01，差异极显著，失拟项的P值=0.391 6＞0.05，差异不显著。表明该模型与试验数据拟合合理，回归方程有较高可信度，误差小，能够用来对固定化酶的酶活性进行预测。模型中一次项A和C、二次项A2与交互项AB、AC和BC对固定化酶活性影响显著，二次项B2和C2对固定化酶活性影响极显著。说明各固定条件对固定化酶活性影响并非线性关系。
2.2.2 响应面优化结果与分析
响应面3D图可以直接反映各固定条件间的交互作用对固定化CDA酶活的影响。等高线图可以体现出各因素交互作用的强弱，椭圆形的等高线表示相互作用显著；越接近正圆，交互作用越不显著。各因素对固定化酶活性的影响见图6。
图6 各因素对固定化酶活性的影响
Fig.6 Interaction effect on activity of immobilized enzyme
如图6所示，海藻酸钠浓度和CaCl2浓度之间以及海藻酸钠和硬化时间之间交互作用较强，而CaCl2浓度和硬化时间之间交互作用较弱。结合各因素交互作用对CDA相对酶活性影响的响应面图和回归模型，优化海藻酸钠包埋法固定CDA的条件，结果为海藻酸钠浓度27.8 g/L、CaCl2浓度31.0 g/L、静置硬化1.84 h。各因素取最优值后预测固定化酶活性可达2.13 U/mL。
2.3 最优固定条件验证结果
5 次重复试验的结果为 1.98、2.07、2.27、2.01、2.19 U/mL，平均值为2.10 U/mL，与预测值2.13 U/mL相比偏差极小，表明模型可信度高。
2.4 固定化酶的酶学性质
2.4.1 热稳定性
固定化酶与游离酶的热稳定性见图7。
图7 固定化酶与游离酶的热稳定性
Fig.7 Thermal stability of immobilized enzyme and free enzyme
由图7可知，CDA适合储存在低温环境中，随着储存温度的升高，损失的酶活性越多。当储存温度为45℃时，游离酶几乎没有酶活性，固定化酶还保留最高酶活20.05%的酶活性。该结果表明CDA的固定化可以提高其温度稳定性。
2.4.2 pH值稳定性
固定化酶与游离酶的pH值稳定性见图8。
图8 固定化酶与游离酶的pH值稳定性
Fig.8 pH stability of immobilized enzyme and free enzyme
由图8可知，CDA储存在pH 7的缓冲液中效果最佳。pH 3条件下放置20 h后，游离酶几乎没有酶活性，固定化酶还保留最高酶活36.70%的活性；pH 9时，游离酶还保留最高酶活32.60%的活性，而固定化酶还保留最高酶活52.70%的活性。该结果表明经过固定后的CDA，pH值稳定性有所提高。
2.4.3 操作稳定性
固定化CDA的操作稳定性见图9。
图9 固定化CDA的操作稳定性
Fig.9 The operation stability of immobilized CDA
如图9所示，固定化酶活性随循环操作次数的增加而降低。这是因为连续操作使凝胶强度降低，酶漏失过多，导致酶活性降低。固定化酶在连续操作6次后，酶活性依然保持最高酶活性的60.39%。
3 结论
本试验使用海藻酸钠包埋法对CDA进行固定，通过设计单因素试验和响应面试验对固定条件进行优化，得到最优条件：海藻酸钠浓度为27.8 g/L，CaCl2浓度为31.0 g/L，硬化1.84 h，GA浓度为0.025%，交联30 min。重复试验验证了优化结果，与预测值偏差较小。通过对比固定化酶和游离酶的酶学性质，发现固定化酶的热稳定性和pH值稳定性相较于游离酶有明显提升。固定化酶的操作稳定性研究表明，在连续操作6次后，固定化酶活性依然保持最高酶活的60.39%。CDA是催化几丁质脱乙酰制备壳聚糖的酶，提高几丁质脱乙酰的稳定性可以降低成本，提高壳聚糖制备效率。本研究为固定化CDA催化制备壳聚糖的工业应用奠定了试验基础。
[1] RINAUDO M.Chitin and chitosan:properties and applications[J].Progress in Polymer Science,2006,31(7):603-632
[2]黄国宏.壳聚糖及其衍生物在食品工业中的应用[J].食品研究与开发,2015,36(8):131-134
[3] XI Y,PAN P L,YE Y X,et al.Chitin Deacetylase Family Genes in the Brown Planthopper,Nilaparvata Lugens(Hemiptera:Delphacidae)[J].Insect Molecular Biology,2015,23(6):695-705
[4] 宋巍,陈元维,史国齐,等.不同脱乙酰度壳聚糖的制备及结构性能的研究[J].功能材料,2007,38(10):1705-1708
[5] KHOR E,LIM L Y.Implantable applications of chitin and chitosan[J].Biomaterials,2003,24(13):2339-2349
[6] YIH,WUL-Q,BENTLEY W E,et al.Biofabrication with chitosan[J].Biomacromolecules,2005,6(6):2881-2894
[7] 岳燕霞,崔胜文,罗双群,等.复合可食性膜在果蔬保鲜中应用研究进展[J].食品研究与开发,2016,37(11):195-200
[8] 周佳升,潘熙,李云香,等.壳聚糖及其衍生物作为疫苗佐剂研究进展[J].动物医学进展,2020,41(4):104-109
[9]赵宇,曹琬晴,刘阳.聚合物纳米药物载体的研究进展[J].高等学校化学学报,2020,41(5):909-923
[10]莫亿伟,张付康,杨国,等.1-MCP和壳聚糖复合处理提高嵊州桃形李采后保鲜效果[J].果树学报,2017,34(1):75-83
[11]朱先玉,丛海花,尹恒.几丁质脱乙酰酶的特点及应用[J].渔业研究,2019,41(2):169-174
[12]ANDRES E,ALBESA-JOVE D,BIARNES X,et al.Structural basis of chitin oligosaccharide deacetylation[J].Angew Chem Int Ed Engl,2014,53(27):6882-6887
[13]吴媛媛,吕洋,白雪芳,等.酶解蟹壳制备几丁寡糖的初步研究[J].食品研究与开发,2008,29(10):13-16
[14]杨倩,刘建辉,蒋彤,等.几丁质脱乙酰酶的研究进展[J].食品研究与开发,2017,38(10):200-203
[15]孙玉英,张继泉,王淑军,等.蜡状芽孢杆菌几丁质脱乙酰基酶克隆和表达[J].食品研究与开发,2016,37(21):151-155
[16]ZHAO Y.Production and characterization of extracellular chitin deacetylase from Absidia corymbifera DY-9[J].Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry,2010,53(2):119-126
[17]TUVENG T R,ROTHWEILER U,UDATHA G,et al.Structure and function of a CE4 deacetylase isolated from a marine environment[J].PLoS One,2017,12(11):e0187544
[18]廖晓峰,于荣,梁华正,等.磷酸改性花生壳固定化α-淀粉酶研究[J].食品研究与开发,2016,37(9):29-33
[19]丁爱凤,黄卉卉,孙嘉文,等.响应面法优化固定化果胶酶制备黑莓汁工艺[J].食品研究与开发,2015,36(18):115-119
[20]汤鸣强,陈颉颖.海藻酸钠固定化米曲霉产果胶酶及其性质[J].食品研究与开发,2010,31(9):167-170
[21]韩志萍,叶剑芝,罗荣琼.固定化酶的方法及其在食品中的应用研究进展[J].保鲜与加工,2012,12(5):48-53
[22]王静,揣玉多,汤卫华,等.海藻酸钠包埋法固定L-阿拉伯糖异构酶的研究[J].食品研究与开发,2017,38(16):92-95
[23]来蒋丽,刘姝,胡晟源,等.一株产几丁质脱乙酰酶海洋细菌的筛选、鉴定及发酵优化[J].生物技术通报，2017，33(11):153-159