柿叶（Diospyros kaki L.f.）是柿树新鲜或干燥的叶子[1]。《本草纲目》记载：“味苦、性寒、无毒，治咳嗽吐血，止渴生津”[2]。《中药大辞典》记载：“酸、涩、凉”，可用于治疗各种内出血[3]。柿叶营养丰富，尤其以多酚、黄酮、VC、多糖等含量较高[4]。除以上外，柿叶中还含有蛋白质、脂肪、纤维素、钙、铁等营养物质。现代药理研究表明[5]，柿叶中所含黄酮类、酚类、鞣质类等化合物具有抗氧化、抗菌、止血、减肥降脂、降血糖、保护心血管等作用。
植物在生长过程中体内活性物质的含量受到外界环境、营养状况以及生理状态等诸多因素影响，表现出一定的波动规律，而且同种植物不同活性成分的动态规律不同[6]。刘茂秀等[7]对库尔勒香梨不同生长时期叶片营养特征分析，结果表明香梨树处于不同土壤质地、不同季节条件下，其叶片营养元素的组成及含量有显著差异性。郝晴晴等[8]对国内17种柿叶研究，结果表明柿叶多糖、黄酮、多酚、VC含量等与采摘期和品种有关。费学谦等[9]研究也表明柿叶不同生长期VC、总酚和黄酮含量有显著差异性。气相色谱-质谱联用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）可对植物叶片提取物成分准确分析，提高植物成分的利用率。柿叶的乙醚提取物对酪氨酸酶具有较强的抑制作用，具有一定的美白功效[10]。崔翠等[11]研究发现柿叶中乙醇提取物对于思茅松毛虫体内的细菌有着极好的抑制作用，能够破坏其新陈代谢系统，进而起到防虫作用。柿叶中还含有大量人体所需的矿物质元素。柯范生等[12]对安溪油柿柿叶的营养成分分析，发现安溪油柿柿叶含有丰富的矿物质和微量元素。目前，柿叶主要研究也仅限于成分提取工艺优化以及柿叶茶产品开发，不同生长时期成分动态变化鲜有研究，且对柿叶乙醇提取物成分和矿物质元素研究更少。柿叶有效成分及其营养物质不能得到充分利用，通过对柿叶乙醇提取物、矿物质元素及其成分动态变化分析，为柿叶合理利用及产品研发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 原料
采集自河北省石家庄市元氏县石榴山庄50年左右树龄大红袍柿叶。每一单株选择东南西北4个方位枝条叶片，每个方位取完整无虫蛀叶片20片，每个时期共采集240片。采集日期为2018年4月至9月。
1.1.2 试剂
磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、无水乙醇（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；甲醇（分析纯）：天津市百世化工有限公司；无水碳酸钠、考马斯亮G-250（分析纯）、抗坏血酸、盐酸、牛血清蛋白（优级纯）：天津欧博凯化工有限公司；浓硫酸、蒽酮试剂（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；福林酚（生化试剂）：北京索莱宝科技有限公司；没食子酸（生化试剂）：阿拉丁试剂有限公司。
1.1.3 仪器
HH-4数显恒温水浴锅：金坛市杰瑞尔电器有限公司；UV-5100B紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；FA2204B电子天平：上海市安亭电子仪器厂；DHG-9003BS电热恒温鼓风干燥箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；C21-SDC8E15电磁炉：浙江苏泊尔股份有限公司；7000B气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent公司；Optima 7000DV电感耦合等离子体发射光谱仪：美国PerkinElmer公司；410火焰原子吸收分光光度计：美国Shewood公司；FW-100高速万能粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司；RE52-AAA旋转蒸发仪：上海嘉鹏科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 样品处理
样品处理：将采摘的新鲜柿叶摊放2 h，放入烘箱内，50℃烘干至恒重（约5 h）。粉碎过40目筛，备用。
1.2.2 醇溶性物质测定
1.2.2.1 气相色谱-质谱联用测定乙醇提取物
样品处理：准确称取1.000 0 g的柿叶（5月15日采摘）粉末，用50 mL无水乙醇加热回流提取5 h，过滤，滤渣再用10倍无水乙醇回流提取1 h[13-14]。重复提取3次，合并滤液，减压浓缩至2 mL，待测。
气相色谱条件：柱子初始温度50℃，保留3 min。以5℃/min升至150℃，保留3 min。再以10℃/min升至230℃，保留2.5 min。进样口温度：250℃。质谱连接线温度：250℃；载气（He）：1.0 mL/min；分流比：20 ∶1；进样量：1.0 μL[14-15]。
质谱条件：电离方式为EI源；电子能量：70 eV；电子源温度：250℃；加速电压：10kV；溶剂延迟时间：3min；扫描范围：30 aum～1 000 aum[16]。
1.2.2.2 多酚含量测定
以没食子酸为参比标准物，Folin-Denis法测定多酚含量。
1.2.2.3 黄酮含量的测定
以芦丁为参比标准物，参考马陶陶等[17]三氧化铝比色法测定黄酮含量。
1.2.3 水溶性物质测定
1.2.3.1 可溶性糖含量测定
参考梅为云等[18]方法测定可溶性糖含量。
1.2.3.2 VC含量的测定
参考刘绍雄等[19]紫外分光光度计快速测定法测定VC含量。VC测定原料为鲜叶。
1.2.3.3 蛋白质含量的测定
参考高国赋等[20]方法测定柿叶中蛋白质含量。
1.2.4 矿物质元素含量测定
样品前处理方法：称取柿叶（5月15日采摘）粉末0.500 0 g（精确到0.000 1 g）置于锥形瓶中，放数粒玻璃珠，加10 mL混合酸（即硝酸8 mL，高氯酸2 mL），浸泡24 h。24 h后于电热板上消解，先低温40℃加热1.5 h左右；升温至90℃保持1 h；升温至120℃保持3 h。若变棕黑色，再加混合酸，若不变色则无需加酸。继续升温至140℃～150℃保持1 h～2 h，最后升温至180℃直至冒白烟（注意不要使液体蒸干），至消化液呈无色透明或略带黄色，取下冷却，转入25 mL容量瓶中，用水洗涤容器，将洗液合并于容量瓶中，定容至刻度，摇匀，备用。同法同时制备试剂空白溶液，并用国家标准物质小麦粉进行质量控制[21-23]。该方法中所用水均为超纯水。
1.3 数据分析
用Micosoft Excel 2017进行数据记录。SPSS17.0软件对数据进行单因素方差分析，Duncan法进行差异显著性检验，显著性水平为0.05。使用Origin8.0软件作图。
2 结果与分析
2.1 乙醇提取物成分分析
总离子流图见图1，成分分析见表1。
图1 柿叶乙醇提取物的总离子流色谱图
Fig.1 Total ion flow spectrograph of ethanol extract from persimmon leaves
表1 柿叶乙醇提取物成分分析表
Table 1 Component analysis of ethanol extracts from persimmon leaves
编号 保留时间/min 分子式 英文名称 化合物 分子量 百分含量/%13.19C2H4O2 acetic acid 乙酸 606.16 2 3.99 C5H10O 3-methyl-Butanal 3-甲基-正丁醛 86 1.49 3 4.17 C5H10O 2-methyl-Butanal 2-甲基-正丁醛 86 1.49 4 5.43 C6H14O2 1，1-diethoxy-ethane 乙醛二乙缩醛 118 1.17 5 10.54 C6H10O4 ethanedioic acid，diethyl ester 乙二酸二乙酯 146 16.54 6 10.8 C9H20O2 1，1-diethoxy-pentane 异戊醛二乙缩醛 160 1.26 7 12.19 C5H8O4 ethyl hydrogen malonate 丙二酸单乙酯 132 1.16 8 13.57 C6H8O4 2，3-dihydro-3，5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one 2，3-二氢-3，5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮144 1.63 9 13.9 C4H6O4 3，4-dihydroxytetrahydro-2-furanone 3，4-二羟基四氢-2-呋喃酮 118 4.57 10 14.7 C6H6O3 5-hydroxymethyl-2-furancarboxaldehyde 5-羟甲基-2-糠醛 126 1.85 11 15.22 C8H14O6 （+）-diethyl L-tartrate （+）-二乙基L-酒石酸盐 206 6.94 12 15.5 C9H20Si 1-methyl-1-（3-methylbutyl）oxy-1-silacyclobutane 1-甲基-1-（3-甲基丁基）氧基-1-硅烷 172 1.74 13 15.98 C8H16S 2-butyltetrahydro-thiophene 2-丁基四氢-噻芬 144 1.19 14 16.94 C6H6O3 1，2，3-benzenetriol 连苯三酚 126 3.91 15 17.16 C6H12O6 D-allose D-阿洛糖 180 1.27 1617.89C12H22O11 sucrose 蔗糖 3425.65 17 18.58 C6H10O5 1，6-anhydro-á-D-glucopyranose α-D-吡喃葡萄糖-1，6-脱水山梨糖醇 162 4.12 18 19.26 C12H27O4P diethyl octyl ester phosphoric acid 磷酸二乙酯 266 1.23 19 19.86 C8H32O16 à-D-glucopyranoside α-D-吡喃葡萄糖 504 1.17 20 20.37 C8H16O6 Ethyl à-d-glucopyranoside 乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷 208 2.3 21 21.14 C18H32O16 à-D-glucopyranoside α-D-吡喃葡萄糖 504 1 22 21.88 C6H14O6 galactitol 半乳糖 182 1.84
续表1 柿叶乙醇提取物成分分析表
Continue table 1 Component analysis of ethanol extracts from persimmon leaves
编号 保留时间/min 分子式 英文名称 化合物 分子量 百分含量/%23 22.33 C13H24O 1，5，9，9-tetramethyl-spiro[3.5]nonan-5-ol 1，5，9，9-四甲基 - 螺[3.5]壬烷-5-醇 196 1.09 24 24.26 C16H32O2 n-hexadecanoic acid 棕榈酸 256 9.04 25 24.85 C18H36O2 ethyl ester hexadecanoic acid 棕榈酸乙酯 284 1.24 2627.35C20H40O phytol 植醇 2965.21 27 27.68 C16H28O2 oxacycloheptadec-8-en-2-one 黄葵内酯 252 2.93 28 27.86 C18H30O2 linolenic acid 亚麻酸 278 8.74
由图1和表1分析结果可知，柿叶（5月15日采摘）乙醇提取物种类较多。图1中各峰的鉴定主要通过NIST05谱库检索，并根据有机化合物的质谱断裂一般规律和文献报道的数据分析确定，利用峰面积归一化法计算峰面积的相对含量[24]。由表1可知，共鉴定出柿叶中含有28种化学成分，占总成分97.93%。从化合物类型来看，柿叶乙醇提取物主要成分是酸类、酯类和糖类。酸类含量最高占23.94%（样品干重），主要成分是亚麻酸和棕榈酸。酯类和糖类含量较高分别占23.0%和18.32%。从类别种类来看，糖类最为丰富，共检测出8种糖类，其中蔗糖含量最高占5.65%。醛类和酯类分别检测出5种。李羽晗等[5]对陕西榆林柿叶用柱色谱和重结晶法进行分离纯化，采用气相色谱-质谱联用法测定醇提取物，研究发现柿叶含有14种醇提取化合物。结果具有差异性原因可能与品种、环境因素和提取方法有关。
2.2 矿物质元素含量分析
柿叶矿物质元素成分分析见表2。
表2 柿叶矿物质元素成分分析
Table 2 Analysis of mineral elements in persimmon leaves mg/g
矿物质元素 含量Al 0.65 Ca 91.56 K 23.85 Fe 0.62 Mg 1.67 Mn 0.034 Cu 0.007
由表2可知，柿叶（5月15日采摘）共检测出7种矿物质元素，包括Ca、K、Mg 3种常量元素和Cu、Fe、Mn 3种微量元素，还有少量Al元素。柿叶中矿物质元素含量大小顺序是 Ca＞K＞Mg＞Al＞Fe＞Mn＞Cu。Ca元素含量最高，约为91.56 mg/g。K和Mg含量较高，约为23.85 mg/g和1.67 mg/g。Cu元素可以维持铁的生理代谢。Fe参与氧的运输和储存，促进人体的发育。Mn对人体的生长发育、生殖、胆固醇的合成、碳水化合物和脂肪代谢等都起着重要作用。与祖庸等[25]对陕西省商洛地柿叶采取火焰原子吸收法测定矿物质元素的研究结果相近。柿叶可为人体提供生理所需的矿物质元素。
2.3 不同生长期黄酮含量的变化
不同时期柿叶黄酮含量见图2。
图2 不同时期柿叶黄酮含量
Fig.2 Flavonoids in persimmon leaves at different stages
字母不同表示组间具有显著性差异（P<0.05）。
由图2可看出不同生长期柿叶黄酮含量变化趋势。5月中旬含量最高，为12.14 mg/g。5月下旬至8月中旬黄酮含量呈显著下降趋势。柿树5月开花，6月结果，7月～8月柿树幼果迅速膨大，8月后柿果开始缓慢生长。黄酮含量在8月初有所上升可能因为果实生长缓慢，黄酮含量得到有效积累。在现有的研究中对柿叶黄酮动态变化研究较少，主要集中在功能性及其提取方法的研究。从图2中可以清晰看出黄酮含量在不同生长时期的变化，为柿叶黄酮类产品开发和有效利用提供理论依据。
2.4 不同生长时期柿叶多酚含量变化
不同时期柿叶多酚含量见图3。
多酚是植物体内重要活性物质，具有多种保健功能，包括抗氧化、抑菌、降血脂和血糖，抗动脉粥样硬化等[26]。由图3可知，柿叶不同生长时期多酚含量变化趋势，在5月中旬多酚含量达到最高水平，为224.49 mg/g。5月中旬后多酚含量呈显著下降趋势。因此，从多酚利用角度考虑，5月中旬是柿叶的最佳采收期。韩卫娟等[27]对不同品种柿叶总酚含量年动态变化分析表明，总酚在7～8月份含量达到最高水平。吴玉林等[28]对安溪油柿叶采用紫外分光光度法测定总酚含量在9月份达到最高水平。其结果有差异性，可能与品种、地理环境等因素有关。
图3 不同时期柿叶多酚含量
Fig.3 Polyphenol content in persimmon leaves at different stages
字母不同表示组间具有显著性差异（P<0.05）。
2.5 不同生长时期柿叶VC含量变化
不同时期柿叶VC含量见图4。
图4 不同时期柿叶VC含量
Fig.4 VCcontent in persimmon leaves at different stages
字母不同表示组间具有显著性差异（P<0.05）。
柿叶几乎是所有植物叶中片中VC含量最高的[29]。从图4中可以看出，不同生长时期VC含量具有显著性差异（P<0.05）。7月初VC含量达到最高水平，平均为19.15 mg/g。7月后VC含量显著下降，9月初含量最低，为10.88 mg/g。郝晴晴等[8]采用紫外分光光度法测定17种国内柿叶VC含量，结果分析表明5月VC含量达到最高水平。结果具有差异性，可能与品种、地理环境等因素有关。
2.6 不同生长时期柿叶可溶性糖含量变化
不同时期柿叶可溶性糖含量见图5。
图5 不同时期柿叶可溶性糖含量
Fig.5 Soluble sugar content in persimmon leaves at different stages
字母不同表示组间具有显著性差异（P<0.05）。
可溶性糖是柿叶甜醇滋味的重要组成成分，同时糖类物质在热加工过程中还可以转化成香气物质，如甜香、薯香、焦糖香等[30]。由图5可知，不同生长时期可溶性糖有显著差异性（P<0.05），柿叶可溶性糖含量全年在17.28 mg/g～55.96 mg/g波动。5月含量最高，6月和8月含量较高。5～6月是柿叶生长发育最快时期，柿树6～8月开花并结果。开花期和柿果发育期生物量增加较快造成可溶性糖稀释效应，所以6月和8月可溶性糖含量低于5月份。
2.7 不同生长时期柿叶蛋白质含量变化
不同时期柿叶蛋白质含量见图6。
图6 不同时期柿叶蛋白质含量
Fig.6 Protein content of persimmon leaves at different stages
字母不同表示组间具有显著性差异（P<0.05）。
由图6可知，蛋白质含量在生长周期波动比较大，并且不同生长时期蛋白质含量有显著差异性（P<0.05）。8月中旬蛋白质含量达到最高水平4.66 mg/g。5月份出现增长可能与季节性转变和生长发育有关。7～8月采摘区有三分之一雨期，7月含量升高可能是因为阳光和雨水充足有利于柿叶营养吸收。8月含量下降可能是因为果实积累抑制叶子营养成分的吸收。从蛋白利用角度考虑，8月初是柿叶的最佳采收期。
3 结论
通过气相色谱-质谱联用对柿叶乙醇提取物进行分析，共鉴定28种化学成分，占总成分97.93%。酸类是构成柿叶风味的主要物质，其次是酯类和糖类，分别占23.94%、23.0%和18.32%。柿叶中矿物质元素含量大小顺序是 Ca＞K＞Mg＞Al＞Fe＞Mn＞Cu。Ca元素含量最高，约为91.56 mg/g。不同生长时期成分含量变化趋势不同，8月中下旬蛋白质含量最高，平均含量为4.66 mg/g。5月黄酮、多酚和可溶性糖含量最高，平均含量分别为224.49、14.02 mg/g和48 mg/g。7月初VC含量最丰富，平均含量为19.15 mg/g。结果表明，5月份适合加工成多酚、黄酮和可溶性糖功能性产品。7月适合加工为富含VC的功能性产品，8月适合加工成富含蛋白质功能性产品。
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