苦荞[Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn]是一种著名的特色杂粮作物，其营养价值高，富含蛋白质（9.3%～11.7%）、脂肪（1.7%～2.6%）、淀粉（71.6%～72.6%）等营养成分，并且含其他禾谷类作物所没有的生物黄酮类功能成分[1-3]。近年来，随着人们生活水平的提高和健康意识的增强，苦荞加工制品越来越深受消费者的青睐，其市场前景广阔，开发潜力巨大[4]。黄酮类物质是植物中一类具有重要生理活性的次生代谢物，与植物防御反应密切相关，具有抗菌、抗氧化、调节血脂、降血糖和降血压等多种生理活性[5-12]。因此，提高苦荞中黄酮类化合物的含量具有重要意义。
众多研究表明，在适宜条件下，生物诱导子可促进酚酸类、黄酮类、萜类、生物碱，以及皂甙类等化合物的合成，其被认为是提高植物次生代谢物含量的有效途径，已被广泛应用于提高植物次生代谢物合成积累的研究中[13-14]。刘冉等[15]研究发现100 mg/L壳聚糖溶液能提高红松幼苗中多酚物质含量；金海红等[16]认为酵母细胞壁多糖能促进杭白菊中黄酮类物质的合成积累；张国利等[17]研究发现3种真菌多糖诱导子均能促进桑黄胞内黄酮类成分的积累。海藻酸钠是从褐藻类的海带或马尾藻中提取的一种天然多糖，海藻酸钠及其水解物对植物生长发育与次生代谢物的合成积累具有一定调节作用[18-22]。目前，尚未见关于海藻酸钠诱导苦荞黄酮类物质合成积累的研究报道。因此，本试验选用不同浓度的海藻酸钠溶液对苦荞种子进行诱导处理，着重研究海藻酸钠对苦荞芽黄酮类物质合成积累的影响规律，为提高苦荞芽品质提供一种新的方法和途径。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
西荞1号：由成都大学-农业农村部杂粮加工重点实验室提供。
海藻酸钠：成都市科隆化学品有限公司；芦丁：四川省维克奇生物科技有限公司；槲皮素：上海源叶生物科技有限公司；甲醇（色谱级）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；无水甲醇、氯化钠、冰乙酸、三氯化铝、乙酸钾（分析纯）：成都市科龙化工试剂厂。
LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；RXZ-300B人工气候箱：宁波东南仪器有限公司；ESJ210-4B电子分析天平：龙腾电子有限公司；KQ-5200DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；岛津LC-20A型高效液相色谱：日本Shimadzu；Biotek Synerey HTX多功能酶标仪：美国伯腾仪器有限公司；H2050R冷冻离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；DGG-9246A电热恒温鼓风干燥箱：上海齐欣科学仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 海藻酸钠溶液诱导处理及萌发方法
采用胚根生长抑制法[23]，选取大小均一、黑色饱满健康的苦荞籽粒（西荞1号），经清洗、消毒、晾干，置于等量不同质量浓度（0、50、100、200、300、400 μg/mL）的海藻酸钠溶液中浸泡12 h，以去离子水为对照组。将浸泡后的苦荞籽粒置于铺有2层纱布1层滤纸的培养皿内，于70%～75%湿度人工气候箱中25℃恒温培养（12 h光照，12 h黑暗）。待培养至10 d后收获，测定其发芽率、芽长、根长、鲜重、干重，并将收获的苦荞芽烘干至恒重，打粉，冷冻保存于-20℃冰箱，待分析测定。每个处理做3次重复。
发芽率/%=（第10天种子总发芽数/试验总种子数）×100
1.2.2 海藻酸钠溶液对苦荞芽黄酮含量的测定
称取苦荞芽粉末50 mg，加入5 mL、70%的甲醇，40℃超声处理30 min，过滤，收集上清液作为样品提取液备用。
1）采用三氯化铝比色法[24]在420 nm下测定样品提取液的总黄酮含量。以芦丁质量浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得到芦丁质量浓度与吸光度的关系曲线的回归方程：Y=18.576 X-0.001，R2=0.999 6。根据回归方程计算苦荞芽提取物中的总黄酮含量。
2）参考王静波等[25]的试验方法，采用反向高效液相色谱法测定苦荞芽中芦丁和槲皮素的含量。色谱条件为色谱柱：Diamonsil-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为A：1%冰乙酸溶液，B：纯甲醇；洗脱程序见表1；流速：1.0 mL/min；检测波长：360 nm；进样量：10 μL；柱温35℃。分别以芦丁和槲皮素溶液浓度为纵坐标，峰面积为横坐标，绘制标准曲线，得到芦丁质量浓度与峰面积的关系曲线：Y=21 583 389.282 4X+288 644.574 9，R2=0.994 1；得到槲皮素质量浓度与峰面积的关系曲线：Y=10 208 431.250 0X+195 254.400 0，R2=0.998 7。根据各物质的回归方程，即得各样品的芦丁和槲皮素的浓度。
表1 梯度洗脱程序
Table 1 Gradient elution program
时间/min A 1%冰乙酸/% B纯甲醇/%0 50 50 8.00 45 55 18.00 50 50 20.00 结束
1.3 试验数据统计与方法
试验数据为3次重复，结果以平均值±标准差表示。采用SPSS19.0和Microsoft Office Excel 2010等软件进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 海藻酸钠溶液对苦荞种子发芽率的影响
图1为不同浓度海藻酸钠溶液对苦荞发芽率的影响。
图1 不同浓度海藻酸钠溶液对苦荞种子发芽率的影响
Fig.1 Effects of sodium alginate at different concentrations on the seed germination rate of tartary buckwheat
不同字母表示在P<0.05水平上有显著差异。
由图1可知，在一定供试浓度（50μg/mL～200μg/mL）范围内，与空白对照组相比，随着海藻酸钠溶液浓度的增加，苦荞种子的发芽率呈逐渐增加趋势。在其供试浓度为200 μg/mL时，苦荞种子的发芽率达到最大值91.33%，为对照组80.00%的1.14倍。当海藻酸钠溶液的处理浓度进一步增大时（300μg/mL和400μg/mL），苦荞种子的发芽率略呈下降趋势，其主要原因可能为在适宜浓度范围内，海藻酸钠溶液能有效诱导苦荞种子内α-淀粉酶、蛋白酶等水解酶的合成，进而促进苦荞种子的萌发；当采用更高浓度的海藻酸钠溶液进行诱导处理时，其对苦荞种子内相关水解酶无明显增强活性，甚至还具有一定的抑制作用。这与他人报道的关于海藻酸钠溶液对玉米和水稻种子的萌发生长诱导效应基本一致[26]。
2.2 海藻酸钠溶液对苦荞芽生长的影响
图2和图3分别描述了海藻酸钠溶液对苦荞芽根长、芽长和生物量（鲜重、干重）的影响。
结果表明，经海藻酸钠溶液诱导处理后，苦荞芽的根长和芽长均比对照组有所提高，苦荞芽的根长介于5.06 cm～6.05 cm之间，芽长介于3.38 cm～4.00 cm之间。对于苦荞芽的生物量而言，苦荞芽的生物量随着海藻酸钠溶液浓度的增加呈现先增加后降低的趋势。在200 μg/mL浓度处理下能显著提高苦荞芽的鲜重和干重，分别为6.30 g/100株和0.91 g/100株，为对照组的1.34倍（4.70 g/100株）和1.10倍（0.83 g/100株）。相关研究表明，低浓度的海藻酸钠溶液能提高大豆、玉米、水稻的株高和生物量，而高浓度的海藻酸钠溶液对其生长则呈现出一定的抑制作用，其主要原因可能是适宜浓度的诱导子能改善幼苗的光合作用性能，能提高植物产物的积累量；当诱导子浓度较高时会诱导植物的抗性反应而造成细胞生长受阻[26-29]。
图2 不同浓度海藻酸钠溶液对苦荞芽根长和芽长的影响
Fig.2 Effects of different sodium alginate concentrations on the root and bud length of tartary buckwheat sprout
同一指标字母相同表示差异不显著，P＞0.05。
图3 不同浓度海藻酸钠溶液对苦荞芽生物量的影响
Fig.3 Effects of sodium alginate at different concentrations on the sprout biomass of tartary buckwheat
同一指标不同字母表示在P<0.05水平上有显著差异。
2.3 海藻酸钠溶液对苦荞芽总黄酮含量的影响
图4为不同浓度海藻酸钠溶液对苦荞芽总黄酮合成积累的影响。
图4 不同浓度海藻酸钠溶液对苦荞芽总黄酮含量的影响
Fig.4 Effect of sodium alginate at different concentrations on the total flavonoid content of tartary buckwheat sprouts
不同字母表示在P<0.05水平上有显著差异。
由图4可知，海藻酸钠溶液能显著提高苦荞芽总黄酮的含量，且与其供试浓度紧密相关。在供试浓度200 μg/mL～300 μg/mL范围内时，苦荞芽总黄酮含量增加最为明显。其中，当供试浓度为200 μg/mL时，苦荞芽总黄酮含量达到最大值54.69 mg/g，为对照组49.38 mg/g的1.12倍。随着海藻酸钠溶液处理浓度的进一步增大（400 μg/mL），这种促进苦荞芽黄酮类成分积累的诱导效应有所减弱。导致这种现象的原因一方面可能是苦荞芽中积累的代谢物反馈抑制了该合成途径的关键酶——苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL），使合成受阻；另一方面也可能是由于产生的其他代谢物与海藻酸钠共同竞争结合植物细胞位点，使得诱导信号不被识别或传导，从而导致海藻酸钠溶液的诱导作用减弱[18，30-31]。
2.4 海藻酸钠溶液对苦荞芽芦丁和槲皮素的影响
芦丁、槲皮素混合标准品及苦荞芽提取物样品的高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）图分别如图 5（A）和图 5（B）所示。
图5 芦丁、槲皮素混合标准品及苦荞芽提取物的高效液相色谱图
Fig.5 HPLC analysis profiles of the mixture of rutin and quercetin（standards）and the extraction of tartary buckwheat sprouts
A.芦丁、槲皮素混合标准品；B.苦荞芽提取液；1.芦丁；2.槲皮素。
在该分析条件下，苦荞芽样品中的2种主要黄酮类成分（芦丁和槲皮素）的分离效果较好。经海藻酸钠溶液诱导处理后，苦荞芽中芦丁和槲皮素的含量得以明显提升。
海藻酸钠溶液对苦荞芽芦丁及槲皮素含量的影响见图6。
图6 海藻酸钠溶液对苦荞芽芦丁及槲皮素含量的影响
Fig.6 Effects of sodium alginate solutions on the rutin and quercetin content of tartary buckwheat sprouts
同一指标不同字母表示在P<0.05水平上有显著差异。
由图6可以看出，在供试浓度（50 μg/mL～400 μg/mL）范围内，苦荞芽中芦丁和槲皮素的含量均较对照组有所增加。其中，在供试浓度为200 μg/mL时，苦荞芽中的芦丁及槲皮素含量达到最大值，分别为43.77 mg/g和5.28 mg/g，是对照组中芦丁含量（39.45 mg/g）的1.11倍和槲皮素含量（3.25 mg/g）的1.62倍。
3 结论
本研究结果表明，在适宜浓度海藻酸钠溶液（50 μg/mL ～200 μg/mL）的诱导作用下，苦荞种子的发芽率、生物量及黄酮类物质的含量均较对照组有所增加，但随着海藻酸钠溶液浓度的进一步增加，苦荞芽的生长受到一定抑制，黄酮类物质的含量也有所降低。
通过试验得出：1）海藻酸钠溶液有助于提高苦荞种子发芽率、生物量及黄酮类物质的合成积累。2）海藻酸钠溶液的最佳诱导浓度为200 μg/mL。在该处理条件下，苦荞种子的发芽率为对照组的1.14倍、鲜重为对照组的1.34倍、干重是对照组的1.14倍、总黄酮含量比对照组提高10.75%、芦丁含量较对照组提高10.95%、槲皮素含量比对照组提高62.46%。本研究为促进苦荞种子萌发生长、黄酮类物质的合成积累，以及高品质苦荞芽的生产奠定了基础。
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