蓝莓内生真菌分离纯化及其生物抗性初步研究

植物内生真菌是指植物生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各组织器官内的真菌[1]。可通过产生抗生素类物质、水解酶、植物生长调节剂、植物生长激素类物质，与病原菌竞争营养物质、诱导植物产生抗性等方式拮抗植物病害[2-3]。分离纯化内生真菌并分析其对植株病原体的生物抗性，可以简单有效的筛选出具有抗菌活性的菌株，进一步鉴定其抗菌活性成分可以为开发绿色生物农药提供理论依据[4-8]。

截止2019年底，贵州蓝莓种植面积已达18万亩，随着产量增大，贮运期蓝莓果实腐败造成的经济损失及大量使用化学农药引起的农残超标问题不容忽视，开发绿色农药或绿色保鲜剂已经成为产业发展亟待解决的一大问题。而目前越橘属植物内生真菌及其生物抗性的研究主要集中于药用越橘属植物内生真菌及其对人类致病菌抗菌活性[9-13]。因此，本研究选择蓝莓作为研究材料，分离纯化蓝莓茎、叶及果实中内生真菌并通过对峙实验及菌丝生长试验初步研究蓝莓内生真菌生物拮抗活性，以期为开发绿色生物农药及保鲜剂提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

“粉蓝”蓝莓树叶、树枝及果实：贵州省麻江县蓝莓种植基地；蓝莓果实病害菌（青霉Penicillium、枝孢属Cladosporium、尖小丛壳菌Glomerella acutata、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea、葡萄球菌Staphylocccus）：贵州省果品创新中心，储存于贵阳学院；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextroseagar，PDA）：青岛海博生物技术有限公司；乙酸乙酯：天津市富宇精细化工有限公司；Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒（SK8259-50次）、DNA Marker DL2000、引物 ITS1/ITS4：生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 仪器与设备

DH5000BII电热恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；Microfug ®20Rcentrifuge高速冷冻离心机：美国贝克曼库尔特有限公司；T100TMThermal Cycler PCR：美国伯乐有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 内生真菌的分离纯化

蓝莓茎、叶、果实采回后自来水冲洗除去表面泥土，无菌滤纸吸干表面水分；各组织依次用0.1%升汞、75%酒精浸泡消毒各3 min，用无菌水漂洗3次，无菌滤纸吸干表面水分，置于超净工作台吹干。用无菌剪刀将植物组织剪切为0.2 cm×0.2 cm组织块，每4个组织块一组，接种于PDA平板，置于28℃恒温培养箱培养，待菌丝从组织块周围长出后，挑取单菌落转移至另一PDA平板，连续传代培养至菌落形态单一。根据菌落培养特征将分离纯化的内生真菌划分为不同的形态型[14]。

1.3.2 rDNA-ITS序列扩增

使用上海生工Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒（CAS B518259）提取内生真菌基因组DNA，以基因组DNA为模板，使用rDNA-ITS序列通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTC CGCTTATTGATATGC-3′）进行rDNA-ITS序列扩增。20 μL 反应体系：2×Taq Master Mix 10 μL、DNA 模板1 μL、ITS1 和 ITS4 引物各 1 μL，ddH2O 补足至 20 μL。反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃终延伸10 min[15]。

PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测序结果利用美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的多序列比对工具碱基局部对准检索工具（basic local alignment search tool，BLAST）在序列数据库GenBank中作相似差异性分析，下载同源性较高的序列，使用最大似然法（maximum likelihood，MI）分析亲缘关系。MI分析采用MEGA7进行，bootstrap重复值1500、选用Kimura 2-parameter model、得到系统发育树后使用iTOL v4在线软件进行整理。将病原菌的亲缘分析结果与其形态特征、培养性状结合起来对其进行鉴定[16]。

1.3.4 内生真菌拮抗特性筛选

采用平板对峙法分析蓝莓内生真菌对蓝莓病害菌拮抗特性。将内生真菌菌饼接种至PDA平板中央，在其左右等径3 cm处各接种1病原真菌菌饼作为处理组；另取PDA平板在距离平板中心左右3 cm各接种1病原真菌菌饼作为对照；处理组与对照组均接种5个平行，将所有接种PDA平板置于28℃恒温培养箱中培养；待对照组病原菌生长至平板中央时，测量各病原真菌菌落生长半径。根据以下公式计算抑菌率：抑菌率/%=[（对照组半径-处理组半径）/对照组半径]×100[17]。

1.3.5 内生真菌次级代谢产物提取

平板对峙实验筛选出的内生真菌在PDA平板上划线培养3 d～4 d，平板上挑取孢子接种于液体培养基，28℃摇床培养3 d，得到种子液。种子液以15%的比例接种于装有500 mL液体培养基锥形瓶中，放置于28℃恒温培养箱静置培养28 d。发酵液过滤，滤液用相同体积乙酸乙酯萃取两次，乙酸乙酯层45℃减压蒸干，使用 10%二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）配置成10 mg/mL储存液备用[18]。

1.3.6 内生真菌次级代谢产物拮抗特性筛选

用菌丝生长法测定该菌株次级代谢产物对病原真菌菌丝生长的抑制活性。无菌条件下，次级代谢产物粗提取制作的含药PDA平板中央接种病原真菌菌饼作为试验组，无药PDA平板接种病害菌作为阴性对照，所有处理和对照设置3个平行，置于28℃恒温培养。待阴性对照长满培养皿时，分别测量各病原菌的生长量，并根据以下公式计算抑制率：抑菌率/%=[1-（试验组菌斑直径÷阴性对照的菌斑直径）]×100[19]。

1.4 数据分析

采用IBM SPSS statistics 22软件（International Business Machines Corporation）对试验数据分析。

2 结果与讨论

2.1 蓝莓内生真菌分离纯化

蓝莓内生真菌的鉴定分布见表1。

从贵州麻江蓝莓种植基地的“粉蓝”蓝莓的不同部位健康组织（茎、叶、果实）的81个表面消毒组织块中共分离出41株内生真菌；茎、叶、果实各分离到8、14、19株，分离率分别为29.63%、51.85%、70.37%。形态学分类鉴定结果表明：41株内生真菌隶属于子囊菌门（Ascomycota）的 8个菌属，其中钉孢属（Passalora sp.）为优势属，占总数的26.8%；茎中发现枝孢属（Cladosporium sp.）、球腔菌属（Mycosphaerella sp.）、钉孢属（Passalora sp.）及刺盘孢属（Colletotrichum sp.），叶中发现枝孢属（Cladosporium sp.）、球腔菌属（Mycosphaerella sp.）、小球腔菌属（Leptosphaeria sp.）及钉孢属（Passalora sp.），月盾霉属（Peltaster sp.）、间座壳属（Diaporthe sp.）及苍白尾孢属（Pallidocercospora sp.）则仅分布在果实中，内生真菌的分布呈现器官特异性。Z J等[20]从云南野生越橘属植物中分离纯化出374株内生真菌，隶属于子囊菌门25个属，果实及茎内生真菌分布相似，与树叶内生真菌分布差异大，研究结果与本试验类似，但与规模化人工种植基地蓝莓样品相比，野生越橘属植物内生真菌多样性更为丰富。

2.2 蓝莓内生真菌菌株生物拮抗特性初步分析

将41株蓝莓内生真菌对5种蓝莓病害菌进行对峙试验，见表2。

对峙实验结果表明，有16株蓝莓内生真菌对至少1种蓝莓病害菌有抑菌活性，占分离菌株总数的39.02%；对青霉（Penicillium sp.）、枝孢属（Cladosporium sp.）、尖小丛壳菌（Glomerella acutata）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、葡萄球菌（Staphylococcus）表现出拮抗活性的内生真菌分别有9株、12株、13株、7株和9株；其中，对青霉（Penicilliumsp.）、枝孢属（Cladosporiumsp.）、尖小丛壳菌（Glomerella acutata）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、葡萄球菌（Staphylococcus sp.）拮抗活性最强的菌株分别为BF41抑制率21.143 8%±2.716 30%、BF27抑制率 54.236 1%±1.515 6%、BB01抑制率58.674 0%±2.639 8%、BL22抑制率 24.471 8%±1.235 2%和BF41抑制率61.421 9%±3.162 4%。内生真菌 BB01、BL22、BF27、BF40 及 BF41 对 5 个菌属蓝莓病害菌均表现出较强抑制作用，BF41分类鉴定为刺盘孢属Colletotrichum sp.，BF40分类鉴定为苍白尾孢属 Pallidocercospora sp.，BL22、BF27、BB01 分类鉴定为枝孢菌属Cladosporium sp.。

2.3 蓝莓内生真菌次级代谢产物生物拮抗特性初步分析

为进一步了解内生真菌 BB01、BL22、BF27、BF40及BF41次级代谢产物拮抗特性，使用乙酸乙酯提取了内生真菌发酵液中的次级代谢产物粗提取物，减压旋转蒸发后将其配成10 mg/mL储存液，使用菌株代谢产物制作浓度为 500、250、125、62.5、31.25 μg/mL 的系列含药平板用于菌丝生长试验，试验结果见图1。

由图1可见，高浓度次级代谢产物含药平板（500μg/mL）对各病原菌均有良好的抑制效果（生长抑制率均超过90%）；5种次级代谢产物对青霉及灰葡萄孢菌的拮抗活性随浓度下降均显著降低（浓度低于62.5 μg/mL时，对青霉、灰葡萄孢菌抑制率均低于35%，浓度低于31.25 μg/mL时，对青霉、灰葡萄孢菌抑制率均低于15%）；随浓度降低对枝孢属、尖小从壳菌、葡萄菌仍具有较强拮抗活性的次级代谢产物分别是BF27[31.25μg/mL含药平板上菌丝生长抑制率为56.2865%±3.616 2%]、BB01[31.25 μg/mL 含药平板上菌丝生长抑制率为 40.808 6%±0.65 9%]、BF41[31.25 μg/mL 含药平板上菌丝生长抑制率仍为53.28 5%±2.1718%]。

过去研究证明枝孢属内生真菌可以产生枝孢素，其可能是一种新型的光谱抗细菌、抗真菌药物[21]；最新研究表明，海藻内生枝孢属真菌可产生纳米银离子、纳米金离子，其表现出显著的抗氧化活性及抗菌活性[22-23]；Li等从红花青藤刺盘孢属内生真菌Colletotrichum gloeosporioidesB12中分离出两种γ-丁内酯对4种病害真菌（B.cinerea，S.sclerotiorum，F.solaniandR.cerealis）的最小抑菌浓度为128 μg/mL[24]，LuoY等从红树林植物内生真菌Colletotrichum gloeosporioides中分离出3种新的聚酮类化合物具有良好的抗细菌活性[25]。本研究中枝孢属内生真菌（BL22、BF27、BB01），刺盘孢属内生真菌（BF41）及苍白尾孢属内生真菌（BF40）次级代谢产物粗提取物含药平板浓度为500 μg/mL时，对5种病害菌菌丝生长抑制率均超过90%，表现出显著的抗病害真菌活性，但其抗菌机制有待进一步研究。

2.4 具有生物拮抗活性蓝莓内生真菌rDNA-ITS序列系统发育分析

以5株内生真菌基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到500bp～550bp的rDNA-ITS序列，将测序得到的rDNA-ITS基因序列提交GeneBank获得登录号MN814007、MN814008、MN814009、MN814010及 MN814011。基于rDNA-ITS序列的蓝莓拮抗内生真菌聚类分析见图2。

将基因序列于GeneBank数据库Blast比对后，下载同源性超过90%的基因序列构建系统发育树，BF41鉴定为刺盘孢属Colletotrichum sp.，BF40鉴定为苍白尾孢属 Pallidocercospora sp.，BL22、BF27、BB01 鉴定为枝孢菌属Cladosporium sp.，与形态学鉴定结果一致，BB01、BL22、BF27、BF40 及 BF41 菌株均为该属新的菌种。

3 结论

本研究从贵州麻江蓝莓种植基地的“粉蓝”蓝莓的健康组织（茎、叶、果实）中分离出41株内生真菌，经分类鉴定，隶属于8个菌属，优势属为钉孢属（Passalora sp.）；与5株病害菌进行对峙实验分析内生真菌拮抗特性发现，有16株内生真菌对至少1种病害菌具有抑菌活性，其中 BB01、BL22、BF27、BF40 及 BF41 可抑制全部 5 种病害菌生长；提取 BB01、BL22、BF27、BF40及BF41内生真菌次级代谢产物粗提取物对病害菌进行菌丝生长试验，发现次级代谢产物粗提取物含药平板浓度为500 μg/mL时对5种病害菌菌丝生长抑制率均超过90%，表现出显著的抗病害真菌活性；采用PCR扩增内生真菌基因组rDNA-ITS序列构建系统发育树，BF41鉴定为刺盘孢属Colletotrichum sp.，BF40鉴定为苍白尾孢属 Pallidocercospora sp.，BL22、BF27、BB01则鉴定为枝孢菌属Cladosporium sp.，与形态学鉴定结果一致；将测序得到的rDNA-ITS基因序列提交GeneBank获得登录号MN814007、MN814008、MN814009、MN814010 及 MN814011，BB01、BL22、BF27、BF40 及BF41菌株均为该属新的菌种。

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