蛹虫草（Cordyceps militaris）又名北冬虫夏草[1]，它与珍贵的中药材冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）属于同属异种的真菌界植物，是药用及食用价值很高的虫菌复合体。蛹虫草含有虫草多糖、虫草素、核苷类、甾醇[2]类等多种营养成分。研究表明，蛹虫草可以增强人体的免疫功能[3]；抑制肿瘤组织的生长[4]；抑制神经系统、改善心脑血液循环、降血糖[5-6]等多种重要的生物学活性。具有很高的药用价值和食用价值，它的药效是各活性成分共同发挥作用的结果，且其疗效与其质量密切相关，因此建立准确的质量标准十分重要，本文在众多活性成分中选择了虫草素、腺苷和麦角甾醇进行同时测定，可以用于比较不同产地被测物的含量差异，并根据不同成分的含量进行选择，为全面客观地认识蛹虫草药材功效物质基础、丰富和发展蛹虫草药材多指标评价体系研究和蛹虫草的质量评价提供参考。
张铭雅等[7]建立色谱法-串联质谱方法同时对蛹虫草中虫草素、虫草酸、腺苷和肌苷的含量进行测定；常衬心等[8]建立了一种虫草麦角留醇含量检测及质量控制方法；林宏琳等[9]建立高效液相色谱-二极管阵列检测器（high performance liquid chromatography-serial presence detect，HPLC-SPD）法同时测定九苷肽蛹虫草软胶囊中还原型和氧化型谷胱甘肽的含量，但目前没有同时测定蛹虫草中虫草素、腺苷和麦角甾醇的相关文献。此外，高效液相同时测定法的应用十分广泛，可应用在环境保护学、植物生态学、食品科学等方面，且结果准确可靠，可用于多种领域中物质的定量分析，具有较大的实际应用价值。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
虫草素标准品（20161123）、腺苷标准品（1129A023）：索莱宝科技有限公司；角甾醇标准品（J26M6K1）：上海源叶生物科技有限公司；超纯水：延边大学药学院实验室；色谱甲醇（709292）：格瑞斯化工科技有限公司。其余试剂均为分析纯。蛹虫草：延吉市东市场，经延边大学药学院施溯筠副教授鉴定为蛹虫草。
DHG-9145A型电热鼓风干燥箱：常州诺基仪器有限公司；UNIQUE-R20超纯水机：厦门锐思捷水纯化技术有限公司；ISO-9001电子天平：上海良平仪器仪表有限公司；KQ5200E超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；80-2型离心沉淀器：上海耀特仪器科技有限公司；Hitachi Primaide高效液相色谱仪：天美（中国）科学仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 色谱条件
色谱柱为 DiamosilC18（4.6mm×250mm，5μm），流动相为甲醇-水梯度洗脱，0～15 min，20%甲醇；15 min～20 min，20%～100%甲醇；20 min～45 min，100%甲醇。体积流量1.0 mL/min，柱温30℃，进样量10 μL，检测波长260 nm。
1.2.2 溶液的配制
1.2.2.1 混合标准品溶液
精密称取虫草素1.54 mg、腺苷1.3 mg、麦角甾醇3.0 mg，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成单一标准品贮备液。分别精密量取适量上述单一标准品贮备液，制成每1 mL含虫草素51.33 μg、腺苷43.33 μg、麦角甾醇 100 μg的混合标准品溶液。
1.2.2.2 供试品溶液
取蛹虫草适量，烘干，粉碎过60目筛。精密称取蛹虫草粉末0.5 g，加入25 mL甲醇超声溶解，过滤，滤渣弃去，待滤液冷却至室温（23±2）℃后离心5 min（5 000 r/min），取上清液过0.45 μm微孔滤膜，得供试品溶液。
1.2.3 系统适应性试验
按1.2.1项下色谱条件，精密吸取上述混合对照品溶液、供试品溶液各10 μL注入高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪中，测定。
1.2.4 线性关系考察
标准曲线浓度：取1.2.2.1项下单一标准品贮备液梯度稀释配制成虫草素浓度为 5、15、25、35、45、55、65 μg/mL，腺苷浓度为 5、10、15、20、25、30、35 μg/mL，麦角甾醇 25、50、100、150、200、250、300 μg/mL 的系列标准溶液，按1.2.1项下色谱条件进行测定，记录峰面积。分别以虫草素、腺苷和麦角甾醇标准品浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，绘制得到标准曲线。
1.2.5 精密度试验
取1.2.2.1项下的混合对照品溶液，按1.2.1项下色谱条件连续测定6次，记录峰面积。
1.2.6 重复性试验
按1.2.2.2项下方法制备供试品溶液，平行6份，按1.2.1项下色谱条件进行测定，计算含量。
1.2.7 稳定性试验
取同一批蛹虫草药材，按1.2.2.2项下方法制备溶液，分别于 0、2、4、8、10 h 进样，测定此批蛹虫草中虫草素、腺苷和麦角甾醇的峰面积。
1.2.8 加样回收率试验
精密称取已知含量的同一批样品适量，共9份，每3份为一组，分别精密加入低、中、高质量的对照品适量，按“1.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“1.2.1”项下色谱条件进样测定并计算加样回收率。
1.2.9 含量测定
取不同产地蛹虫草药材，按1.2.2.2项下方法制备供试品溶液，并按1.2.1项下色谱条件进行测定，采用标准曲线法计算含量（平行测定3组，取平均值）。
2 结果与分析
2.1 系统适应性试验
混合标准品和供试品高效液相色谱图见图1和图2。
图1 混合标准品高效液相色谱图
Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standards
1.腺苷；2.虫草素；3.麦角甾醇。
图2 供试品高效液相色谱图
Fig.2 HPLC chromatograms of sample
1.腺苷；2.虫草素；3.麦角甾醇。
结果如图1和图2，供试品溶液色谱图中，虫草素、腺苷和麦角甾醇的保留时间与相应标准品溶液色谱图一致，且其分离度均大于1.5。
2.2 线性关系考察
利用HPLC在1.2.1项色谱条件下对1.2.2.1项下单一标准品贮备液进行测定，以峰面积（Y）对各物质浓度（X）进行线性回归，得虫草素、腺苷和麦角甾醇的回归方程分别为Y=52 187X-135 932（R2=0.999）、Y=36227X-42375（R2=0.9992）、Y=9340.8X-29987（R2=0.999 4）。结果表明，虫草素、腺苷和麦角甾醇分别在5 μg/mL～65 μg/mL、5 μg/mL～35 μg/mL、25 μg/mL ～300 μg/mL线性关系良好。
2.3 精密度试验
对样品进行精密度试验，结果虫草素、腺苷和麦角甾醇峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为 0.97%、1.35%、1.20%，表明仪器精密度良好，符合试验要求。
2.4 重复性试验
对样品进行重复性试验，结果蛹虫草中虫草素、腺苷和麦角甾醇峰面积的RSD分别为0.98%、1.86%、1.69%，表明方法的重复性良好，符合试验要求。
2.5 稳定性试验
对样品进行稳定性试验，测定此批蛹虫草中虫草素、腺苷和麦角甾醇的峰面积，计算RSD分别为0.88%、1.18%、1.36%，表明供试品溶液中虫草素、腺苷和麦角甾醇在10 h内稳定。
2.6 加样回收率试验
对样品进行加样回收率试验，试验结果如表1。
表1 3种成分加样回收试验
Table 1 Recovery tests for three kinds of ingredients
项目 样品含量/μg加入量/μg测得量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%虫草素 16.514 6 12.936 29.163 4 97.78 98.64 1.36 16.130 9 12.936 28.923 3 98.89 16.525 6 12.936 29.646 6 101.43 16.164 7 16.170 32.219 9 99.29 16.206 9 16.170 32.113 3 98.37 16.356 3 16.170 32.430 9 99.41 16.164 7 19.404 35.208 8 96.96 16.539 3 19.404 35.409 6 97.25 16.601 3 19.404 35.694 8 98.40腺苷 15.584 9 12.48 27.670 6 96.84 98.58 1.35 15.132 2 12.48 27.335 1 97.78 15.367 0 12.48 27.740 9 99.15 15.637 8 15.60 31.398 5 101.03 15.358 7 15.60 30.673 2 98.17 15.530 9 15.60 31.048 2 99.47 15.373 8 18.72 33.886 0 98.89 15.861 9 18.72 34.396 6 99.01 15.971 5 18.72 34.100 0 96.84麦角甾醇 91.375 9 72 162.699 1 99.06 99.11 2.89 90.435 1 72 160.836 7 97.78 92.566 7 72 163.393 1 98.37 90.412 4 90 179.827 4 99.35 92.581 9 90 182.761 9 100.02 93.783 9 90 180.003 9 95.80 90.299 7 108 193.763 7 96.74 94.581 9 108 199.061 1 105.86 93.957 0 108 200.736 6 98.87
2.7 含量测定
取不同产地的蛹虫草药材进行含量测定，结果如表2。
表2 样品含量测定
Table 2 Sample content determination
含量测定虫草素/（mg/g）腺苷/（mg/g）麦角甾醇/（mg/g）沈阳 0.82 0.78 4.64广东 0.5 1.9 5.8江苏 1.3 1.4 3.9
3 讨论与结论
纪晓朋[10]、任玉合等[11]和李怡霖[12]分别研究了光照度、光照时间、有色光照对蛹虫草的生长发育、活性成分、产量的影响，试验证明不同光源、光强、照射时间对其含量有所影响。李居宁等[13]研究表明蛹虫草菌丝及子实体生长对温度十分敏感，为提高其产量与质量可以实行变温管理。闫丽丽[14]阐述了培养基成分、培养介质、不同发育程度及外源物质添加等因素对蛹虫草生长发育、活性成分及产量的影响。
综上，虽然目前蛹虫草已经可以进行人工栽培，但子实体产量和品质与天然的蛹虫草在一定程度上有较大差别，其不同成分的含量也不同。本试验对3个不同产地蛹虫草中的虫草素、腺苷和麦角甾醇进行测定，3种蛹虫草样品中测得的含量各不相同，可能是样品的来源、生长环境等不同造成了一定差异。可以根据不同需求选择不同产地的蛹虫草进行使用：若想用于增强人体的免疫功能、减少病毒的传播、杀灭病菌等作用可以选择江苏省的蛹虫草，其虫草素含量较高；若用于改善心脑血液循环、抑制神经系统、抗辐射、抗癌、减毒可以选择广东省的蛹虫草，其腺苷和麦角甾醇的含量较高。
作者曾取“1.2.2.1”项下单一对照品贮备液分别在200 nm～400 nm波长范围内进行扫描，结果虫草素在260 nm波长处有最大吸收，腺苷在262 nm波长处有最大吸收，麦角甾醇在282 nm波长处有最大吸收，在260 nm处也有较大的吸收，为保证各指标成分均有适宜的灵敏度并减少干扰，最终本研究在260 nm处同时测定3种成分。甘宾宾等[15]表明甲醇-水提取体系比乙醇-水体系提取率更高，但在试验中发现，甲醇-水体积比7∶3提取时麦角甾醇未出峰，查阅江莉等[16]文献，选用甲醇对麦角甾醇进行提取，因此最终选用100%甲醇提取蛹虫草。等度洗脱操作简单但不能同时测定多种目标成分，选用甲醇和水梯度洗脱可以使目标成分之间的色谱峰分离度良好，同时进行多成分的有效测定，可通过同时测定3种成分的含量，为品质优良的药材筛选提供鉴定基础。
本文建立了高效液相法同时测定蛹虫草中虫草素、腺苷和麦角甾醇含量的方法，该方法有分离度好、准确性高，重复性好，结果稳定可靠等优点，且目标峰保留时间适中，可以快速、有效的测定蛹虫草中虫草素、腺苷和麦角甾醇的含量，具有良好的实用性，可作为蛹虫草的质量控制方法。
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