西林小黄姜又名细肉姜、火姜，姜科属植物，草本多年生单子叶植物姜的地下根茎，一种常见的香辛调味料和传统中医药材[1-2]。其根、茎、皮、肉皆为淡黄色，肉质致密，姜香浓郁，辛辣味浓，益脾胃、除湿消痞、止咳祛痰的功效优良，辛辣与香味和药效都优于大种生姜，故又被称为“火姜”，是广西百色市西林县著名特产，已评为中国国家地理标志产品[3-4]。
姜油（ginger oils）是生姜的主要深加工产品，根据不同的提取方法和产品特性分为精油（essential oils）和油树脂（oleoresin）两大类，能充分反映生姜的感官特性及生物活性，不仅是食品工业的主要原料，还用于医学和洗化用品的开发，另外作为终端消费品也有广阔的市场前景[1，5-7]。
姜油的香气由大量的活性香气成分构成，通过刺激或者激活嗅觉器官，产生了各种各样的香气[8]，可以作为质量评价的理论依据，也决定着不同的开发前景，而且是加工工艺改良的重要依据[9]。顶空-固相微萃取（headspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）作为香气物质主要测定方法之一，具有装置简单，操作简便、采样快速、重现性良好和避免了非挥发成分对色谱柱的污染等优点，同时结合气相色谱质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）可将定性与定量于一体，已广泛用于挥发性成分测定[10]。并且，近几年研究发现其在研究葡萄籽油[11]、茶油[12]、蒜油[13]以及金枪鱼油[14]等多种油样的香气方面也有很好的应用。而姜油关于此方面的研究较少，仅在2015年，刘娜等[15]采用HS-SPME探究不同产地姜油树脂香气，发现主要香气成分均为莰烯、β-萜品烯、α-蒎烯、水芹烯和β-水芹烯，但是含量差别较大。
因此，本研究采用HS-SPME对小黄姜不同姜油的萃取条件进行单因素优化，并结合GC-MS技术手段定性定量，以期全面分析其挥发性香气物质，为小黄姜的开发利用提供数据基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
小黄姜干姜片：西林县富源植物开发有限公司；无水乙醇、石油醚、无水硫酸钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
MND-628多功能养生料理机：福到家；98-II-B电子调温电热套：天津市泰斯特仪器有限公司；RE-5299旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；萃取头及手动进样手柄：上海安谱实验科技股份有限公司；Scion.TQ气相色谱-质谱联用仪：美国布鲁克美国布鲁克道尔顿公司。
1.2 试验方法
1.2.1 原料制备
精油：粉碎干姜过40目筛，称取90 g，水蒸馏物料比1∶16（g/mL），提取至得油体积不再增加，收集上层澄清透明黄色精油，无水硫酸钠干燥，4℃保存备用。
油树脂：粉碎干姜过40目筛，称取90 g，索氏提取料液比为1∶8（g/mL），分别使用石油醚在85℃、无水乙醇在95℃条件下提取至回流液无色透明，旋蒸浓缩（温度50℃）至恒重，得石油醚提取的油树脂和无水乙醇提取的油树脂，4℃保存备用。
1.2.2 萃取针头的老化
使用气相质谱仪进样口作为老化装置，氦气吹扫保持环境惰性，老化时间及温度按照Supelco公司的推荐条件进行，85 μm PA，老化温度28 0℃，老化时间0.5 h。50 μm DVB/CAR/PDMS，老化温度 270 ℃，老化时间 1 h。100 μm PDMS，老化温度 250℃，老化时间0.5 h。
1.2.3 样品萃取
将样品置于15 mL样品瓶中聚四氟乙烯隔垫密封，使用老化后SPME萃取纤维头在室温（28℃）进行吸附，快速插入GC-MS进样口250℃，解吸一段时间，进行GC-MS检测分析。
1.2.4 萃取条件的优化
1.2.4.1 萃取头的优化
分别称取精油（gingeressentialoils，GEO）0.1500g、石油醚油树脂（oleoresin extracted by petroleum ether，PEEO）、无水乙醇油树脂（oleoresin extracted by absolute ethanol，AEEO）各 0.400 0 g于 15 mL 样品瓶中，使用萃取头（100μmPDMS、50/30μmDVB/CAR/PDMS、85μm PA）分别萃取精油2 min、油树脂5 min，在进样口解析3 min进行优化，优化指标为定性香气成分的总峰面积和峰数。
1.2.4.2 萃取时间的优化
分别称取精油0.150 0 g，油树脂（PEEO、AEEO）0.400 0 g于15 mL样品瓶中，使用确定的最佳萃取头，分别萃取精油（2、3.5、5、6.5 min）和油树脂（5、7.5、10、12.5 min），在进样口解析3 min进行优化，优化指标为定性香气成分的总峰面积和峰数。
1.2.4.3 解析时间的优化
分别称取精油0.150 0 g，油树脂（PEEO、AEEO）0.400 0 g于15 mL样品瓶中，使用已确定最佳萃取头和萃取时间，在进样口解析（1、2、3、4 min）进行优化，优化指标为定性香气成分的总峰面积和峰数。
1.2.5 气相色谱-质谱条件
1.2.5.1 气相色谱条件
色谱柱：BR-5ms（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：初始温度50℃保持1 min，以3℃/min升至150℃，保持2 min；再以20℃/min升至250℃，保持2 min；载气为氦气，流量 1.20 mL/min，压力 2.4 kPa；分流比10∶1；进样口温度250℃。
1.2.5.2 质谱条件
电离方式EI，电子能量70 eV，传输线温度250℃，离子源温度230℃，质量扫描范围30 m/z～550 m/z，扫描间隔1 s。
1.3 数据处理
定性分析：通过与NIST11谱库进行检索，要求正、反匹配度都大于800给予确认作为定性结果。定量分析：面积归一化法。
2 结果与分析
2.1 萃取头的优化
萃取头是影响HS-SPME效果的最大因素。不同材料、不同厚度涂层的萃取头，极性存在差异，萃取结果也明显不同[16]。研究表明，精油主要由单萜和倍半萜烯组成，油树脂除精油成分还含有姜酚，姜烯酚和姜油酮等酚类物质[17-18]。因此，试验选取100μmPDMS（小分子挥发性非极性物质），50 μm DVB/CAR/PDMS（C3～C6大范围分析），85μmPA（极性半挥发物质，酚类）萃取头进行优化。不同萃取头对HS-SPME萃取效果的影响见表1。
表1 不同萃取头对HS-SPME萃取效果的影响
Table 1 Extraction efficiencies of HS-SPME with different SPME fibers
萃取头 GEO PEEO AEEO总峰面积（Ab·s） 峰种数 总峰面积（Ab·s） 峰种数 总峰面积（Ab·s） 峰种数85 μm PA 1.52×1011 32 9.61×1010 25 8.22×1010 16 50 μmDVB/CAR/PDMS 1.01×1010 10 2.75×109 6 2.67×109 2 100 μm PDMS 7.90×1011 41 2.86×1011 38 1.63×1011 32images/BZ_176_1171_1325_1191_1356.pngimages/BZ_176_1692_1325_1712_1356.png
结果如表1所示，可以看出不同的萃取头对姜油萃取效果差别显著。萃取头100 μm PDMS萃取精油和油树脂所得物质总峰面积最大，种类数最多，萃取效果明显高于另两种萃取头，这与shao等[19]的研究结果相一致。因此，选取100 μm PDMS作为后续试验的萃取头进行优化。
2.2 萃取时间的优化
HS-SPME分析挥发性有机物时，萃取平衡所需时间较短，10 min之内一般可达最高吸附量；分析复杂基质及半挥发性有机物时，30 min至60 min才能达到平衡[20]。姜油属浓缩成品，风味浓郁，在前期试验基础上，在参数优化基础上，萃取时间分别设定为精油：2、3.5、5、6.5 min，油树脂：5、7.5、10、12.5 min 进行优化。萃取时间对HS-SPME萃取效果的影响见图1。
图1 萃取时间对HS-SPME萃取效果的影响
Fig.1 Extraction efficiencies of HS-SPME with different extraction time
结果如图1A所示，随着吸附时间的增长，GEO的总峰面积先增加后减少，但有效峰个数在增加后出现波动。可见延长吸附时间，有利于达到萃取平衡，但时间过长，萃取柱吸附已经达到饱和，样品瓶中大量的低沸点物质竞争吸附会导致高沸点低含量的物质所占百分比发生变化，使总峰面积和有效峰个数出现波动。对比3.5 min与6.5 min的物质发现，6.5 min多吸附的3种物质含量极低，仅稍大于0.1%，但因为时间的增长导致一些对姜风味起重要作用的物质含量降低。又经单因素方差分析发现，2 min的总峰面积与3.5 min的存在极显著差异（P＜0.01），与6.5 min的存在显著差异（P＜0.05）。综合考虑，确定3.5 min为最佳吸附时间。
如图1B所示，随着吸附时间的增长，PEEO总峰面积不断增加，有效峰个数先增加然后保持不变。经单因素方差分析发现仅7.5 min与10 min的总峰面积存在显著差异（P＜0.05）。考虑到7.5 min时峰型分离的更好，有利于物质定量。因此，确定7.5 min为最佳吸附时间。
如图1C所示，随着吸附时间的增长，AEEO总峰面积先增加后减少，有效峰个数先增加然后保持不变。可能由于萃取柱吸附达到饱和，延长一定的吸附时间，挥发物重新达到平衡过程时总峰面积会稍有波动。经单因素方差分析发现吸附时间改变，仅5 min的总峰面积与12.5 min的存在显著差异（P＜0.05）。考虑到7.5 min峰数已达最大，峰型分离的更好，有利于物质定量。因此，确定7.5 min为最佳吸附时间。
2.3 解析时间的优化结果
在HS-SPME萃取富集完成后，萃取头需要在GC进样口解吸进样。当进样口温度一定时，解吸时间过长，可能会破坏萃取头的涂层材料，大大缩短使用寿命。反之解析时间过短，则不能完全解吸，不仅会降低GC-MS分析结果准确性，还可能污染萃取头影响后续试验[21-22]。因此，在优化参数基础上，对不同解吸时间1、2、3、4 min 进行优化。
经研究发现在不同的解析时间条件下，姜油的峰数均未发生改变，GEO、PEEO和AEEO的峰数分别为44、41、44。而解析时间对总峰面积影响较大，如图2所示。GEO的总峰面积在1 min～3 min内一直处于上升趋势，4 min时有所降低，证明3 min时已基本解吸完全，因此，确定3 min作为精油的最佳解析时间。PEEO和AEEO的总峰面积，在2 min之前随时间的增加而增加，2 min后缓慢下降。因此，确定2 min作为油树脂最佳解吸时间。
图2 解析时间对HS-SPME萃取效果的影响
Fig.2 Extraction efficiencies of HS-SPME with desorption time
2.4 姜油挥发性成分的分析鉴定
最佳萃取条件下3种姜油的总离子流图，如图3所示。
图3 姜油挥发性香气成分的HS-SPME-GC-MS总离子流图
Fig.3 GC-MS total ion current chromatogram of aroma volatiles extracted from ginger oil by HS-SPME
由图3可以看出，在最佳条件下，姜油挥发性香气成分分离度好、峰型尖锐、对称性好、无过饱和状态。
在不同姜油中，同种香气成分出峰时间差异不大，组成和含量存在显著差异，对其进行检索并计算相对百分含量，汇总结果如表2所示。
表2 姜油挥发性香气成分的鉴定结果及相对百分含量
Table 2 Volatile aroma compounds and relative content from ginger oil
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续表2 姜油挥发性香气成分的鉴定结果及相对百分含量
Continue table 2 Volatile aroma compounds and relative content from ginger oil
注：—表示未在对应样品中检索到该成分。
中文名称 英文名称 分子式GEO PEEO AEEO保留时间/min相对百分含量/%images/BZ_179_1520_469_1535_506.png保留时间/min相对百分含量/%images/BZ_179_1887_469_1902_506.png保留时间/min相对百分含量/%α-香柑油烯 α-Bergamotene C15H24 — — 28.553 0.19±0.01 28.545 0.40±0.01 γ-榄香烯 γ-Elemene C15H24 — — 29.682 0.15±0.01 29.676 0.29±0.01反-α-香柑油烯 trans-α-Bergamotene C15H24 — — — — 29.862 0.16±0.01 β-法呢烯 （E）-β-Famesene C15H24 — — 30.771 0.31±0.01 30.769 0.52±0.02（+）-香橙烯 Aromandendrene C15H24 — — 30.950 0.21±0.01 30.945 0.37±0.00（-）-α-衣兰烯 （-）-α-muurolene C15H24 — — — — 31.634 0.21±0.01 α-姜黄烯 α-Curcumene C15H22 31.943 1.10±0.01 31.938 2.96±0.13 31.945 5.50±0.19 α-芹子烯 α-Selinene C15H24 — — — — 32.195 0.06±0.00姜烯 （-）-Zingiberene C15H24 32.617 4.67±0.11 32.622 18.40±0.73 32.642 32.51±0.13（E，E）-α-法呢烯 α-Farnesene C15H24 33.006 0.60±0.04 33.011 2.45±0.08 33.019 4.46±0.05 β-红没药烯 β-Bisabolene C15H24 33.115 0.73±0.03 33.120 2.63±0.12 33.126 4.79±0.06 δ-杜松烯 δ-Cadinene，（+）- C15H24 — — 33.501 0.16±0.01 33.509 0.35±0.01 β-倍半水芹烯 β-Sesquiphellandrene C15H24 33.772 1.25±0.03 33.773 4.37±0.17 33.783 8.00±0.10（Z，E）-α-法呢烯 （Z，E）-α-Farnesene C15H24 — — — — 33.890 0.14±0.01
由表2可知，GEO共鉴定出44种挥发性香气成分，其中萜烃类20种（77.98%），酯类3种（0.70%），酮类6种（2.17%），醛类4种（10.93%），醇类11种（8.22%），主要为β-水芹烯（24.72%）、α-蒎烯（22.28%）、莰烯（10.95%）、α-柠檬醛（5.56%）、β-柠檬醛（4.99%）、月桂烯（4.81%）、姜烯（4.67%）等。PEEO共鉴定出41种香气成分，其中萜烃类22种（77.64%），酯类3种（0.71%），酮类5种（1.43%），醛类 3种（4.71%），醇类 8种（15.52%），主要为 β-水芹烯（18.44%）、姜烯（18.40%）、莰烯（15.48%）、桉叶油醇（11.81%）、α-蒎烯（5.32%）、β-倍半水芹烯（4.37%）等。AEEO共鉴定出44种香气成分，其中萜烃类25种（74.88%），酯类4种（1.26%），酮类3种（1.06%），醛类3种（3.13%），醇类9种（19.68%）主要为姜烯（32.51%）、桉叶油醇（14.52%）、β-水芹烯（10.20%）、β-倍半水芹烯（8.00%）、α-姜黄烯（5.53%）、β-红没药烯（4.79%）、（E，E）-α-法呢烯（4.46%）等。
不同姜油的挥发性香气成分存在一定差异。其中，GEO中未检测到油树脂中的δ-榄香烯、乙酸香茅酯、（+）-香橙烯、香柑油烯，β-法呢烯等12种香气成分，而大量研究表明姜精油含有这些成分[23-24]，经分析这些成分集中在GC-MS出峰靠后的时间段，因此，这可能与成分的含量、挥发性以及萃取头的萃取平衡等因素相关。而三环烯、α-蒎烯、甲基庚烯酮等12种香气成分均只在其中一种油树脂中检测到，可能与两种溶剂极性差别有关。此外，姜辣素类物质是油树脂主要成分，使其呈现特征辛辣风味，但是在PEEO、AEEO顶空固相微萃取的整个优化过程中均未检测到，这与文献中姜酚、姜烯酚沸点高不具有挥发性相一致[25-27]。
3 结论
本研究采用HS-SPME以总峰面积和峰数为优化指标对萃取头、萃取时间和解析时间进行优化，确立常温下萃取小黄姜3种姜油香气成分最佳条件为：GEO0.1500g，采用100μmPDMS萃取头，萃取3.5min，解析 3 min；PEEO、AEEO 均为 0.400 0 g，采用 100 μm PDMS萃取头，萃取7.5 min，解析2 min。最佳条件下GEO、PEEO、AEEO 分别测定出 44、41、44 种香气成分，含量最高的物质均为萜烃类，也含有少量酯、酮、醛和醇。3种姜油在组成和含量均具有一定差异，使得呈香各具特色。其中GEO主要为β-水芹烯、α-蒎烯、莰烯、α-柠檬醛、β-柠檬醛、月桂烯、姜烯等；PEEO 主要为 β-水芹烯、姜烯、莰烯、桉叶油醇、α-蒎烯、β-倍半水芹烯等；AEEO主要为姜烯、桉叶油醇、β-水芹烯、β-倍半水芹烯、α-姜黄烯、β-红没药烯、（E，E）-α-法呢烯等。
[1] 孙亚青.姜精油的提取、分析及纯化研究[D].北京：中国农业大学,2004
[2] Azian M N,Kamal A,Azlina M N.Changes of cell structure in ginger during processing[J].JOURNAL OF FOOD ENGINEERING,2004,62(4):359-364
[3] 黄皓,周生茂,尚小红,等.西林火姜健康组培苗快繁体系的建立[J].长江蔬菜,2016(20):25-29
[4] 沈伟,岑湘涛,韦海婷,等.西林火姜枸杞复合型饮料的研制[J].农产品加工,2019(24):1-3
[5] 李录久,刘荣乐,陈防,等.生姜的功效及利用研究进展[J].安徽农业科学,2009,37(30):14656-14657
[6] 孙静,张秀云,方涛,等.姜油树脂提取新工艺集成研究[J].中国调味品,2019,44(4):172-176
[7] Munda S,Dutta S,Haldar S,et al.Chemical Analysis and Therapeutic Uses of Ginger(Zingiber officinale Rosc.)Essential Oil:A Review[J].JOURNAL OF ESSENTIAL OIL BEARING PLANTS,2018,21(4):994-1002
[8] 肖作兵,朱建才,牛云蔚,等.香气成分的协同作用研究进展[J].食品科学技术学报,2018,36(4):1-7
[9] 黄雪松,陈雅雪.GC-MS法比较鲜姜与干姜的风味物质[J].中国食品学报,2007(5):133-138
[10]Da Porto C,Decorti D,Natolino A.Separation of aroma compounds from industrial hemp inflorescences(Cannabis sativa L.)by supercritical CO2extraction and on-line fractionation[J].Industrial Crops and Products,2014,58:99-103
[11]Bail S,Stuebiger G,Krist S,et al.Characterisation of various grape seed oils by volatile compounds,triacylglycerol composition,total phenols and antioxidant capacity[J].FOOD CHEMISTRY,2008,108(3):1122-1132
[12]Cao W,Lin L,Niu Y,et al.Characterization of Aroma Volatiles in Camellia Seed Oils(Camellia oleifera AbeL)by HS-SPME/GC/MS and Electronic Nose Combined with Multivariate Analysis[J].FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY RESEARCH,2016,22(4):497-505
[13]Wang Y,Wei K,Han X,et al.The Antifungal Effect of Garlic Essential Oil on Phytophthora nicotianae and the Inhibitory Component Involved[J].BIOMOLECULES,2019,9(10)632
[14]Zhang M,Li L,Song G,et al.Analysis of volatile compound change in tuna oil during storage using a laser irradiation based HSSPME-GC/MS[J].2019,120:108922
[15]刘娜,郝学财.不同产地姜油树脂香气成分及其指纹图谱研究[J].江苏调味副食品,2015(4):4-10
[16]王学敬,李聪,王玉峰,等.SPME-GC-MS法分析德州扒鸡挥发性风味成分的条件优化及成分分析[J].南京农业大学学报,2016,39(3):495-501
[17]An K,Zhao D,Wang Z,et al.Comparison of different drying methods on Chinese ginger (Zingiber officinale Roscoe):Changes in volatiles,chemical profile,antioxidant properties,and microstructure[J].Food Chemistry,2016,197:1293-1300
[18]于大胜,邓中国.姜精油和姜油树脂提取工艺研究进展[J].安徽农业科学,2010,38(31):17474-17476.
[19]Shao Y,Marriott P,Shellie R,et al.Solid-phase micro-extraction-Comprehensive two-dimensional gas chromatography of ginger(Zingiber officinale)volatiles[J].Flavour&Fragrance Journal,2003,18(1):5-12
[20]何晓曼,韭泽悟,孙琳娟,等.HS-SPME结合GC-MS分析麻婆豆腐中挥发性风味成分[J].食品工业科技,2017,38(5):297-303
[21]王珏.鲐鱼干制过程中营养和风味物质变化研究[D].杭州：浙江工商大学,2018
[22]魏长庆,周琦,刘文玉.HS-SPME-GC-MS分析新疆胡麻油挥发性成分的技术优化[J].食品科学,2017,38(14):151-157
[23]Singh G,Kapoor I P S,Singh P,et al.Chemistry,antioxidant and antimicrobial investigations on essential oil and oleoresins of Zingiber officinale[J].FOOD AND CHEMICAL TOXICOLOGY,2008,46(10):3295-3302
[24]Manuhara G J,Mentari G P,Khasanah L U,et al.Aqueous Extract Composition of Spent Ginger(Zingiber officinale var.Amarum)from Essential Oil Distillation[J].Iop Conference,2018,333:12-69
[25]Balachandran S,Kentish S E,Mawson R.The effects of both preparation method and season on the supercritical extraction of ginger[J].SEPARATION AND PURIFICATION TECHNOLOGY,2006,48(2SI):94-105
[26]战琨友,董灿兴,徐坤.生姜精油、浸膏和油树脂的提取及成分分析[J].精细化工,2009,26(7):685-690
[27]Oriani V B,Alvim I D,Paulino B N,et al.The influence of the storage temperature on the stability of lipid microparticles containing ginger oleoresin[J].Food Research International,2018,109:472-480