银杏（GinkgobilobaL.）为银杏科银杏属植物，银杏叶是银杏树的干燥叶，具有平喘、敛肺、活血化瘀、止痛等作用，在治疗炎症、血栓、高血脂症和心血管病方面应用广泛[1-2]。银杏叶化学成分复杂，种类繁多，其主要活性成分是黄酮类化合物和萜内酯类化合物[2-3]。多酚类化合物包括黄酮类、酚酸类、单宁类及花色苷类等[4]，广泛存在于植物的根、茎、叶，以及部分果实中，具有重要的生理活性和一定的保健作用。多酚类化合物分子结构中有很多的邻位酚羟基，捕获活性氧等自由基的能力较强[5]，有抗炎抗菌、抗氧化、抗衰老、抗癌、抗突变等多种生理和药理活性，可作为一种天然安全有效抗氧化剂来源[4，6-7]。
近年来，多酚的提取研究非常广泛，主要集中在坛紫菜[8-11]、天胡荽、龙爪稷、藜麦等植物、祁白术[12]等药材、以及各种水果和坚果[13-15]；银杏外种皮、果壳、叶片等常用来提取多酚，但在叶片中多酚含量较高[4，8，16-17]。多酚提取方法主要利用醇提法[4，17]，以及在醇提法基础上辅助以酶法、超声波、微波等手段来增强提取效果[8]，虽然超声波辅助提取效果略低于酶法，但优于微波法[8]。
过量的羟自由基会干扰机体正常的新陈代谢，引起DNA、蛋白质、脂类等生物大分子的氧化损伤，破坏正常细胞和组织，加速机体衰老，进而诱发心血管疾病、糖尿病、肿瘤等多种疾病及其并发症[16，18-19]。随着现代方便食品中抗氧化剂、防腐剂等添加剂的增多，体内原有的内源性自由基清除系统负荷日益增大，服用天然安全的外源性自由基清除剂来减轻过量自由基的损害，对于保持体内自由基平衡、维持身体健康是很有必要的[16]。同时，食品常用抗氧化剂如特丁基对苯二酚（tertbutylhydroquinone，TBHQ）和二丁基羟基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）等属于人工合成抗氧化剂，由于其具有一定的毒性，许多国家已经停止或严格限制其使用，寻找并开发利用安全有效的天然抗氧化剂已经引起广泛重视[18]。研究表明，银杏多酚具有很强的抗氧化能力，对羟自由基的清除效果较好[4，16]。因此，本研究以银杏叶为材料，以多酚提取率为指标，利用超声辅助乙醇提取银杏叶多酚，用响应面设计优化银杏叶多酚的提取工艺条件，并初步研究多酚对羟自由基的清除作用，以期为进一步开发利用银杏叶资源提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料与试剂
银杏叶：2018年7月采自延安大学校园内，新鲜、健康、无病虫害。
没食子酸标准品：上海化科实验器材有限公司；无水碳酸钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；福林酚试剂：上海源叶生物科技有限公司；其余均为国产分析纯。
1.1.2 仪器与设备
UV-2600型紫外可见分光光度计、AUX220型分析天平：日本岛津公司；KQ500B型超声波清洗仪：昆山超声仪器有限公司；FW-100D型植物粉碎机：北京科伟永兴仪器有限公司；RE-52CS型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；WG-71型电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 银杏叶多酚的提取工艺流程
银杏叶→清洗→烘干→粉碎→过筛→乙醇提取→过滤→浓缩→提取液
1.2.2 多酚含量的测定
银杏叶多酚的含量按文献[9]采用福林酚法，在波长765 nm处测定吸光度。以吸光度值为纵坐标、标准品没食子酸质量浓度为横坐标，绘制标准曲线A=0.082 5X+0.020 6（R2=0.998 2）。银杏叶多酚的提取率计算公式如下：
式中：E为银杏叶多酚提取率，%；m为银杏叶质量，g；v为提取液体积，mL；b 为多酚质量浓度，mg/mL。
1.2.3 单因素试验
通过单因素试验，在恒定超声功率（350 W）条件下，研究乙醇浓度、料液比、提取温度和超声时间对银杏叶多酚提取率的影响，确定超声辅助提取银杏叶多酚的最适工艺参数范围。
1.2.3.1 乙醇浓度的选择
准确称取1.0 g干燥的银杏叶粉末5份，分别加入25 mL浓度为60%、65%、70%、75%、80%的乙醇，在60℃的条件下超声回流30 min，研究乙醇浓度对银杏叶多酚提取率的影响。
1.2.3.2 料液比的选择
准确称取1.0 g干燥的银杏叶粉末5份，分别加入15、20、25、30、35 mL 浓度为 70%的乙醇，在 60℃的条件下超声回流30 min，研究料液比对银杏叶多酚提取率的影响。
1.2.3.3 提取温度的选择
准确称取1.0 g干燥的银杏叶粉末5份，分别加入25 mL 浓度为 70%的乙醇，分别在 50、55、60、65、70 ℃的条件下超声回流30 min，研究提取温度对银杏叶多酚提取率的影响。
1.2.3.4 超声时间的选择
准确称取1.0 g干燥的银杏叶粉末5份，分别加入25 mL浓度为70%的乙醇，在60℃的条件下超声回流20、25、30、35、40 min，研究超声时间对银杏叶多酚提取率的影响。
1.2.4 响应面试验
在单因素试验基础上，以多酚提取率为响应值，对影响多酚提取率的乙醇浓度、料液比、提取温度和超声时间4个因素进行响应面优化试验，确定超声辅助提取银杏叶多酚的最佳工艺条件。
1.2.5 银杏叶多酚清除羟自由基试验
银杏叶多酚及VC对羟基自由基的清除率，采用水杨酸法[18]进行测定。羟基自由基的清除率计算公式如下：
式中：E为羟基自由基清除率，%；A0为空白对照液的吸光值；Am为加入多酚后的吸光值；An为不加H2O2时多酚的吸光值。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果分析
2.1.1 乙醇浓度的确定
不同乙醇浓度下多酚的提取率见图1。
图1 不同乙醇浓度下多酚的提取率
Fig.1 The extraction rate of polyphenols under different ethanol concentrations
如图1可知，随着乙醇浓度的提高，银杏叶多酚提取率逐渐增加，当乙醇浓度超过70%后，多酚提取率增加较为缓慢，在75%时达到最高，之后继续提高乙醇浓度，多酚提取率逐渐降低。乙醇浓度与银杏叶多酚提取率的关系表明，适当增大乙醇浓度会促进多酚的溶出，而乙醇浓度过高不仅不利于多酚物质的溶出[10]，而且增加了投料成本。考虑到提取效果及成本，最终确定乙醇的适宜浓度为70%。
2.1.2 料液比的确定
不同料液比条件下多酚的提取率见图2。
图2 不同料液比条件下多酚的提取率
Fig.2 The extraction rate of polyphenols under different materialto-liquid ratios
由图2可知，银杏叶多酚提取率随着料液比的提高呈先升后降趋势。当投入提取液逐渐增加直至料液比为1∶25（g/mL）时，多酚提取率达到最大值；继续增加提取液，多酚提取率开始下降，料液比为1∶35（g/mL）时的提取率与1∶20（g/mL）时的相当。这可能是在料液比为1∶25（g/mL）时银杏叶多酚溶解已达到饱和，多酚已经充分提取出来[20]；同时提取液的增加也提高了其他可溶性物质的溶出，相对降低了多酚的比率。考虑到提取效果及成本，料液比的适宜取值为1∶25（g/mL）。
2.1.3 提取温度的确定
不同提取温度下多酚的提取率见图3。
图3 不同提取温度下多酚的提取率
Fig.3 The extraction rate of polyphenols under different extraction temperatures
如图3可知，提取温度由50℃上升至60℃时，银杏叶多酚提取率直线上升，并在60℃时提取率最大，之后继续升高温度，提取率逐渐缓慢下降。这可能是由于温度较低时，多酚溶出较慢，然而当温度高于60℃时，不仅易使乙醇挥发，而且多酚物质的化学结构易被高温破坏，使其稳定性也受到一定的影响，同时杂质溶出也会增多，使得多酚的提取效果降低[13]。故最终提取的适宜温度为60℃。
2.1.4 超声时间的确定
不同超声时间下多酚提取率见图4。
图4 不同超声时间下多酚的提取率
Fig.4 The extraction rate of polyphenols under different ultrasonic time
如图4可知，随着超声回流提取时间的延长，银杏叶多酚提取率在30 min时增加到最大值，之后继续延长超声时间，多酚提取率不增反降。这可能是由于超声回流超过一定时间，多酚的稳定性则受到一定的影响，同时也促使银杏叶其他物质的溶出，使多酚含量相对下降。故控制提取时间在30 min左右时，提取效果较好。
2.2 响应面设计优化分析
2.2.1 响应面试验设计与结果
在单因素试验结果基础上，并结合实际投入成本与产出情况，以多酚提取率为响应值，对影响银杏叶多酚提取率的乙醇浓度、料液比、提取温度、超声时间4个因素进行响应面优化试验，各因素的水平设计见表1，优化试验设计及结果见表2。
表1 响应面试验因素水平表
Table 1 Factors and levels of response surface methodology
水平 A乙醇浓度/%D超声时间/min-1 65 1∶20 55 25 0 B料液比/（g/mL）C提取温度/℃70 1∶25 60 30 1 75 1∶30 65 35
2.2.2 回归模型的建立与方差分析
根据表2响应面试验结果的数据，采用Design Expert 8.0.6软件进行多元拟合回归分析，得到以银杏叶多酚提取率为响应值的四元二次回归模型方程：
Y=8.44+0.08A+0.022B+0.072C+0.081D-0.015AB+0.038AC+0.048AD-0.012BC+0.055BD+0.025CD-0.19A2-0.17B2-0.15C2-0.18D2。
由方程一次项可知，影响银杏叶多酚提取率的顺序依次为：超声时间>乙醇浓度>提取温度>料液比。为了确定各因素对银杏叶多酚提取率的影响程度并检验回归方程的有效性，进一步对回归模型进行方差分析[21]，结果见表 3。
表2 银杏叶多酚提取响应面试验设计及结果
Table 2 Design and experiment results of response surface methodology of polyphenols extraction rate from Ginkgo biloba leaves
试验号 A乙醇浓度提取率预测值/%1 1 0 0 -1 7.97 8.02 2 1 0 0 1 8.21 8.28 3 0 1 0 -1 8.04 7.97 4 -1 1 0 0 8.02 8.03 5 0 0 -1 -1 7.96 7.99 6 -1 0 1 0 8.05 8.05 7 0 0 -1 1 8.15 8.10 8 1 0 1 0 8.31 8.29 9 0 0 0 0 8.47 8.44 10 0 -1 0 -1 8.08 8.04 11 0 1 1 0 8.18 8.20 12 0 0 0 0 8.47 8.44 13 0 0 1 1 8.33 8.29 14 0 0 0 0 8.46 8.44 15 -1 0 0 -1 7.97 7.96 16 -1 0 0 1 8.02 8.02 17 0 0 1 -1 8.04 8.08 18 1 -1 0 0 8.17 8.15 19 -1 0 -1 0 8.01 7.99 20 0 -1 -1 0 7.98 8.01 21 0 1 -1 0 8.02 8.08 22 0 -1 1 0 8.19 8.18 23 -1 -1 0 0 7.94 7.96 24 0 0 0 0 8.43 8.44 25 0 -1 0 1 8.07 8.09 26 1 1 0 0 8.19 8.16 27 0 0 0 0 8.38 8.44 28 0 1 0 1 8.25 8.25 29 1 0 -1 0 8.12 8.07 B料液比C提取温度D超声时间Y提取率/%
由表3结果可知，模型的P＜0.000 1，极显著，说明模型有意义；失拟项P>0.05，不显著，说明模型与试验的差异值较小，决定系数R2为0.954 1，说明响应值的变化有95.41%来源于4个试验因素，回归模型拟合度良好，预测值与实测值之间有较好的相关性，试验误差较小，能很好地描述各因素与响应值之间的关系。
回归模型中的 PA、PC、PD、PA2、PB2、PC2、PD2 值均小于0.01，PBD小于0.05，说明乙醇浓度、提取温度和超声时间的一次项、4个因素的二次项、以及料液比和超声时间的交互项均存在显著性，而其它因素间的交互项及失拟项显著性相对较差。表明提取因素对响应值多酚提取率是一种非线性关系[21-22]。由F值大小可知，超声时间>乙醇浓度>提取温度>料液比对银杏叶多酚提取率的影响。
表3 回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance for the regression model
注：**表示极显著（P＜0.01）；*表示显著（P＜0.05）。
度 均方 F P 显著性模型 0.76 14 0.054 20.77＜0.000 1 **A-乙醇浓度 0.077 1 0.077 29.32 ＜0.000 1 **B-料液比 6.08×10-3 1 6.08×10-3 2.32 0.15 C-提取温度 0.062 1 0.062 23.53 0.000 3 **D-超声时间 0.078 1 0.078 29.93 ＜0.000 1 **AB 9.00×10-4 1 9.00×10-4 0.34 0.567 1 AC 5.63×10-3 1 5.63×10-3 2.15 0.164 9 AD 9.03×10-3 1 9.03×10-3 3.45 0.084 6 BC 6.25×10-4 1 6.25×10-4 0.24 0.632 8 BD 0.012 1 0.012 4.62 0.049 6 *CD 2.50×10-3 1 2.50×10-3 0.95 0.345 2 A2 0.24 1 0.24 92.32＜0.000 1 **B2 0.2 1 0.2 75.26＜0.000 1 **C2 0.14 1 0.14 54.3 ＜0.000 1 **D2 0.21 1 0.21 79.64＜0.000 1 **残差 0.037 14 2.62×10-3失拟项 0.031 10 3.08×10-3 2.09 0.248纯误差 5.88×10-3 4 1.47×10-3总和 0.8 28 R2 0.9541方差来源 平方和 自由
2.2.3 因素间交互作用分析与条件验证
由方差分析可知，料液比和超声时间之间的交互作用对银杏叶多酚提取率影响达到显著水平（P＜0.05）。为更直观形象地说明交互影响作用，利用Design Expert 8.0.6软件对交互项作响应曲面图和等高线图见图5。响应曲面坡度越陡峭，表明响应值对于操作条件的改变越敏感；反之曲面坡度越平缓，操作条件的改变对响应值的影响也就越小[21，23]。
由图5可以看出，料液比和超声时间相互作用的响应面曲面坡度陡峭，等高线图呈扁平椭圆状，表明料液比和超声时间之间具有较强的交互作用，对银杏叶多酚提取率的影响显著。
图5 液料比和超声时间对银杏叶多酚提取率的交互影响
Fig.5 The interactive effect of liquid-to-material ratito and ultrasontic time on polyphenols extraction rate from Ginkgo biloba leaves
用Design Expert 8.0.6软件进一步分析回归方程，得出银杏叶多酚提取的最适条件为：乙醇浓度74.31%、料液比 1∶25.08（g/mL）、提取温度 61.75℃、超声时间30 min，预测提取率为8.386%。考虑到实际操作的局限性，提取工艺最终修正为：乙醇浓度74%、料液比1 ∶25（g/mL）、提取温度 62℃、超声时间 30 min。此条件下进行试验验证，重复试验3次，银杏叶多酚实际提取率为8.32%，与预测值（8.386%）接近，其相对误差为0.79%。本试验银杏叶多酚提取率远高于利用超声辅助甲醇提取银杏叶多酚得率6.34%[17]，以及机械力辅助提取银杏叶多酚的得率7.33%[5]，但是低于酶解辅助乙醇提取法（12.71%）和微波辅助乙醇提取法（11.39%）的得率[8]。这可能和选取材料及多酚得率计算方法不同有关[24]。
2.3 银杏叶多酚对羟自由基的清除作用
为了确定银杏叶多酚的抗氧化能力，测定其对羟自由基（OH·）的清除作用，结果见图6。
图6 银杏叶多酚对羟自由基的清除能力
Fig.6 Hydroxyl free radical scavenging ability of polyphenols extracted from Ginkgo biloba leaves
随着浓度的增加，银杏叶多酚和VC对羟自由基的清除率均逐渐增加。在相同浓度下，银杏叶多酚对OH·的清除率高于VC，说明银杏叶多酚具有一定的抗氧化能力，其抗氧化能力与浓度正相关[25]。
3 结论
本研究采用超声辅助乙醇提取银杏叶多酚，通过单因素试验结合响应面优化试验对影响银杏叶多酚提取效果的因素进行研究。结果表明，对银杏叶多酚提取率的影响最大的是超声时间及乙醇浓度，其次是提取温度，料液比的影响相对较小，料液比和超声时间对银杏叶多酚提取率的交互影响显著。银杏叶多酚的最优提取条件为，乙醇浓度74%、料液比1∶25（g/mL）、提取温度 62 ℃、超声时间 30 min，银杏叶多酚提取率为8.32%。本研究采用的超声辅助乙醇法可靠，适宜于在省时间、低耗能的条件下提取银杏叶多酚。同时，在实际运用该法提取多酚时要优先考虑乙醇浓度和超声时间，以及料液比和超声时间的交互作用，以达到多酚的最大提取率。
植物多酚特有的成分决定了其具有很强的抗氧化性。在相同质量浓度下，本试验提取的银杏叶多酚对羟自由基的清除效果高于VC，具有较强的抗氧化活性，可以作为一种羟基自由基的天然清除剂进行开发应用。但是，银杏叶多酚较强的抗氧化性是由哪种具体成分发挥主要作用，以及其作用强度等有待于进一步深入研究。因此，本研究为工业化生产银杏叶多酚提供技术参数，为进一步开发利用银杏叶多酚以及寻找天然安全的抗氧化剂提供依据。
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