玉米蛋白含有必需氨基酸，尤其是赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸，具有良好的乳化性、发泡能力、保水性和溶解性等性能，另外还具有抗菌，抗高血压等生理活性。然而，玉米蛋白含有高含量的疏水性氨基酸，并且在应用方面具有一定的限制。为了改善玉米蛋白的功能性和应用，可以通过物理、化学和酶促等方法进行改性。程宇等[1]探讨了马铃薯蛋白肽与Tween 20作为共乳化剂制备的乳状液的影响机制。最终显示出，马铃薯蛋白肽能够有效的降低乳状液的脂肪氧化率。虽然，玉米蛋白肽表现出很好的功能特性，但有研究表明，酶解反应会使玉米蛋白肽丧失部分功能特性，严重阻碍了玉米蛋白肽的应用[2]。为了增加玉米蛋白肽在食品体系中的应用范围，针对玉米蛋白肽进行适当的改性以提升其功能特性显得尤为重要。
美拉德反应是指氨基酸（通常是氨基酸或蛋白质）与还原化合物（如还原糖类）之间的非酶褐变反应。美拉德反应具有蛋白质改性的作用，可以很好的提高物质的生物活性。相比化学改性而言，安全问题可以得到保障，是一种安全、可靠的改性方法。美拉德反应拥有一个庞大的反应过程，能够生成还原酮、类黑精、噻吩、吡嗪等物质[3]。美拉德反应除了能提高原料的抗氧化活性外，还能够提高反应原料的热稳定性，生成具有一定的抑菌活性的物质[4-5]。此外，还能进一步改善物质的乳化性质和起泡性质，在提高蛋白质的溶解性、发泡性、热稳定性、乳化性以及抗氧化性能等方面具有广阔的应用前景。因此，本试验采用美拉德反应对玉米蛋白水解物（zein protein hydrolysate，ZPH）进行改性，利用玉米蛋白水解物与半乳糖（galactose，Gal）制备美拉德反应产物（Maillard reaction products，MRPs），探讨不同pH值对美拉德反应产物起泡性质、表面疏水性、溶解性、抗氧化能力以及乳化性质的影响，为提高蛋白质的功能特性奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
玉米蛋白（蛋白含量≥75%）：广州千胜精细化工有限公司；半乳糖、碱性蛋白酶（酶活为2.4 AU/g）、ABTS：美国Sigma公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠（分析纯）：上海颖心实验室设备有限公司。
1.2 仪器与设备
JD500-2电子天平：沈阳龙腾电子称量仪器有限公司；GL-21M冷冻离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；UT-1800紫外可见光分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；DK-8B电热恒温水浴锅：上海惊宏实验设备有限公司；PHS-25型pH计：上海精科雷磁仪器厂。
1.3 试验方法
1.3.1 玉米蛋白水解物的制备
称量一定质量的玉米蛋白，配制成60 mg/mL的溶液，磁力搅拌4 h，加入碱性蛋白酶（酶与底物浓度质量比为1∶50），55℃水解2 h，加入1 mol/L的NaOH溶液保持pH值约为8.0将溶液置于95℃沸水中加热10 min，冰浴冷却使其达到25℃，最后用1 mol/L的HCl将溶液的pH值调至7.0。将得到的水解物进行冷冻干燥，使用双缩脲方法测定蛋白水解物的含量，以便后期试验使用。
1.3.2 玉米蛋白水解物的美拉德反应产物
将ZPH的浓度配制为20 mg/mL，与半乳糖按照1：2质量比进行配制。取10 mL加入到带塞玻璃管中，塞紧后水浴加热（90℃）3 h和6 h后立即冷却，4℃下保存获得的MRPs。
1.3.3 溶解性的测定
将不同处理组的样品用pH3.0～8.0的缓冲液进行溶解。在25℃条件下搅拌30min使其充分溶解，4000r/min条件下离心20 min，上部清液中的蛋白质含量表示为M1；样品中总蛋白含量为表示为M2。计算公式如下：
溶解性/%=（M1/M2）×100
1.3.4 表面疏水性的测定
根据Akita等[6]的方法。用pH 3.0～8.0的缓冲溶液分别将不同处理组的样品配置成浓度为1、5、8、10、20 mg蛋白/100 mL的溶液。将5 μL的8-苯胺萘磺-1-酸盐溶液（8 mmol/L）加入到3 mL的蛋白溶液。设置的狭缝宽为10 nm，并在485 nm处进行发射，374 nm处进行激发。用相对的荧光数值H0除以蛋白的浓度（g/L）即为样品的疏水性（R）。
1.3.5 起泡性以及起泡稳定性的测定
根据Klompong等[7]的方法。称取100 mg水解样品分别溶于20 mL的pH 3.0～8.0的缓冲液中。在25℃下磁力搅动30 min，测得体积为V1，再在20 000 r/min下均质2 min后立即测定体积为V2。计算公式如下：
起泡性/%=（V2/V1）× 100
均质后静止放置1 h测定的体积为V3，计算公式如下：
起泡稳定性/%=（V3/V2）× 100
1.3.6 乳化性以及乳化稳定性的测定
依据Pearce等[8]的方法稍做调整。将不同处理组的MRPs样品，溶于缓冲溶液中（pH 3.0～8.0）。在25℃条件下磁力搅拌30 min后加入10 mL大豆油。在20 000 r/min条件下用匀浆机乳化1 min。乳化均质0和10 min后取50 μL注入到5 mL 0.1%十二烷基磺酸钠溶液的离心管中进行混合，在500nm处进行比色，乳化活力（EAI）及乳化稳定性（ESI）用如下公式计算：
EAI/（m2/g）=（2×2.303×A0）/[0.25×蛋白质量（g）]
ESI/%=A0×t10/（A0-A10）
式中：A0、A10为乳状液在 0、10 min 的吸光度值；t10为10 min。
1.3.7 抗氧化能力的测定
根据Re等的方法[9]，并适当修改。将配制好的7 mmol/L ABTS准备溶液与过二硫酸钾（2.45 mmol/L）混合，混合物在25℃下避光放置12 h～16 h。使用前用醋酸钠缓冲溶液（pH 4.5，20 mmol/L）稀释吸光度为0.7±0.02（734 nm处）。将稀释10倍的MRPs样品取100μL与3mL上述溶液混匀，避光放置6min，在734nm处进行比色。计算公式如下：
式中：AC为反应前ABTS工作液的吸光度值；AS为反应后样品溶液的吸光度值。
1.4 统计分析
每个试验重复3次。数据统计分析采用Statistix 8.1（分析软件，St Paul，MN）软件包中 Linear Models程序进行，差异显著性（P＜0.05）分析使用Tukey HSD程序，采用Sigmaplot 12.5软件作图。
2 结果与分析
2.1 MRPs的溶解性
将ZPH和半乳糖以质量比1：2进行配比，并分别加热3 h和6 h得到MRPs，与单独的ZPH一起比较功能特性。图1为不同pH值条件下ZPH和经不同处理条件的ZPH-半乳糖体系生成的MRPs溶解性的变化趋势。
图1 不同pH值条件下美拉德反应产物的溶解性
Fig.1 Solubility of Maillard reaction products under different pH conditions
未进行修饰的ZPH在pH 3～8范围内的溶解度依次为 79.9%、78.8%、78.31%、80.4%、81.4%、81.3%；加热6h后溶解性分别为81.3%、81.7%、81.2%、82.7%、83.3%、83.2%，与其他两个处理组相比，ZPH-半乳糖美拉德反应体系在加热6 h后得到的MRPs的溶解度得到大幅度的改善。3组试验中在pH 5.0时的溶解性最差。这可以解释为当到达蛋白的等电点时，正负电荷为零，蛋白间静电排斥作用减弱，容易出现聚沉现象，使溶解性降低[10]。而当pH值高于或低于5.0时，所带电荷会极大的增加蛋白间的静电排斥作用，聚集的现象得到改善，进一步促进了蛋白的溶解。
2.2 MRPs的表面疏水性
图2为不同pH值条件下，ZPH与半乳糖的质量比为1：2制得的MRPs的表面疏水性的趋势变化情况。
图2 不同pH值条件下美拉德反应产物的表面疏水性
Fig.2 Surface hydrophobicity of Maillard reaction products under different pH conditions
与其他两个处理组相比，加热6 h制备的MRPs的表面疏水性要更低。不同的pH值对表面疏水性的影响较大，3个处理组的表面疏水性随着pH值的增加都呈现显著降低的趋势（P＜0.05）。加热6 h制备的美拉德反应产物表面疏水性在pH值为3.0时为17.3，而在pH值为8.0时仅为9.0。蛋白质的疏水作用与蛋白质的结构、稳定性和功能性密切相连，能够反映出疏水性氨基的含量[11]。此外，表面疏水性与pH值的大小有较为紧密的联系。pH值的增大能够明显的降低疏水性，这可以解释为发生美拉德反应的玉米蛋白肽能够将疏水基团集中在一起，而分子外部布满大量的亲水基团导致疏水性逐渐降低[12]。与此研究结果相似，曹丽霞等[13]研究表明荞麦分离蛋白与葡聚糖进行美拉德反应，荞麦分离蛋白的表面疏水性能显著提高。
2.3 MRPs的起泡性以及起泡稳定性
不同pH值条件下美拉德反应产物的起泡性和起泡稳定性见图3。
ZPH和MRPs的起泡性质是通过起泡性和起泡稳定性来测定的。从图3中能够观察到，ZPH在与半乳糖生成MRPs时，起泡性质都有所提高，尤其是加热6 h后得到的MRPs。3个处理组的起泡性质都呈现显著下降的趋势，在pH值为5.0时到达最低值，而当pH值高于5.0时，又变为逐渐上升的变化形势，在pH值为8.0时达到最大值。不同的pH值3个处理组的起泡性质的变化情况和溶解度的相一致，可见各处理组的起泡性质与溶解度有着密切的联系。分散介质的pH值对起泡性能会起到一定的作用，在pH值为5.0时达到最低值，这是被理解为起泡性能受到蛋白可溶部分的影响，即溶解性的影响[14]。然而，蛋白质的不溶部分能够提高泡沫的表面黏度，从而对起泡性和起泡稳定性起到促进作用[15]。另外，加热6 h获得的MRPs起泡性和起泡稳定性最好。
图3 不同pH值条件下美拉德反应产物的起泡性和起泡稳定性
Fig.3 Foaming capacity and foam stability of Maillard reaction products under different pH conditions
2.4 MRPs的抗氧化性
不同pH值条件下美拉德反应产物的抗氧化性见图4。
图4 不同pH值条件下美拉德反应产物的抗氧化性
Fig.4 Antioxidant activity of Maillard reaction products under different pH conditions
通过清除ABTS+·活性判断不同pH值条件下ZPH与半乳糖形成MRPs的抗氧化性能。向不同pH值条件下玉米蛋白水解物与半乳糖制备的样品中加入ABTS工作液，在734 nm处进行比色，通过吸光值的减少来表示样品的清除活性。由图4可知，随着pH值的增加，ZPH与半乳糖生成的MRPs的清除活性起初降低但随后呈现升高的趋势，在pH值为5.0时MRPs的自由基清除能力最差约为32.43%。说明MRPs的抗氧化活性与pH值有关，且反应的温度越高，生成MRPs的抗氧化性越好。水浴加热能够增加多肽的氨基与半乳糖中羰基之间的分子运动，并且MRPs中含有挥发性的杂环物质或焦糖类化合物，能够增加MRPs的亲电加成反应，起到很好的清除自由基的作用。因此，ZPH与半乳糖进行美拉德反应时间为6 h时，所得到的MRPs的抗氧化能力最强。杨珮瑜等[16]研究了黄鲫蛋白肽分别与7种还原糖进行美拉德反应，显示出美拉德反应产物具有很强的抑菌效果和自由基清除活性。
2.5 MRPs的乳化性以及乳化稳定性
不同pH值条件下美拉德反应产物的乳化性和乳化稳定性见图5。
图5 不同pH值条件下美拉德反应产物的乳化性和乳化稳定性
Fig.5 Emulsifying activity index（EAI）and emulsion stability index（ESI）of Maillard reaction products under different pH conditions
如图5所示，ZPH与半乳糖发生反应后的产物的乳化性质都有不同范围的提高（P<0.05），尤其是加热6 h后制备的产物。这可能是加热使蛋白质分子内部的结构展开，疏水基团暴露出来，亲油基团增多，提高了加热体系的乳化性质[17]。并且伴随pH值的增加，3个处理组的乳化性质起初呈现降低但随后有升高的趋势，在pH值为5.0时到达最低。这一研究结果表明pH值对起泡性和溶解性的影响是相同的。与其他两个处理组相比，ZPH-半乳糖美拉德反应体系加热6 h后，得到的MRPs乳化性和乳化稳定性都得到了很好的改善。ZPH的乳化性和乳化稳定性较差是因为经过重度水解得到的小分子肽的乳化能力较弱[18]。而MRPs的乳化性质能够得到提高，是因为加热后使蛋白的内部结构展开，大量的疏水基团暴露出来同脂滴融合在一起，使乳化活性得到提高。张欣等[19]将豌豆蛋白水解物分别与葡萄糖、麦芽糊精和葡聚糖进行温和的美拉德反应，显著改善了豌豆蛋白水解物的乳化活性，并保留了抗氧化性。
3 结论
美拉德反应可以改善玉米蛋白水解物的功能特性，且不同pH值和加热时间对形成的MRPs的功能活性具有一定的影响。研究结果表明，pH值在等电点附近时MRPs的功能特性较差，且反应体系加热6 h可以显著提高MRPs的功能特性。加热6 h后得到的MRPs溶解性得到大幅度的改善，并且受溶解度的影响，MRPs的起泡性能显著提高。美拉德反应使蛋白质分子内部的结构展开，疏水基团暴露出来，导致表面疏水性逐渐降低，乳化性能增加。此外，由于MRPs中含有挥发性杂环物质或焦糖类化合物，能够提升玉米蛋白肽的抗氧化活性。综上，可以通过应用美拉德修饰的方式来提高ZPH的功能特性。根据玉米蛋白水解物与半乳糖反应产物的优良性质，为玉米蛋白肽在食品工业上的应用提供理论支持，为蛋白质的深入研究开辟新的方向。
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