槟榔（Areca catechu L.）作为四大南药之首，只有极少部分进入药材市场，大部分作为休闲食品被消费，鲜食槟榔就是一种非常古老的食用习惯，我国海南和台湾地区的人们喜好鲜食槟榔[1-2]。槟榔的加工产品食用槟榔最早起源于我国湖南湘潭地区，其起源有多种说法[3-5]。嚼食槟榔后人们普遍有愉悦感和兴奋感，且提神效果显著[6]。随着食用槟榔加工技术发展，这种产品受到愈来愈多消费者欢迎，消费人群大幅度提高，消费区域也不断扩大，同时产品食用安全及对大众健康的影响受到国家及地方政府主管部门关注，普通消费者对产品的安全性甚为关心[7-9]。
2003年世界卫生组织癌症研究中心发布报告把槟榔列为一级致癌物，当今这一权威研究结果还是槟榔产品安全性研究不可逾越的障碍，其直接影响着槟榔加工产业生存与发展[10-12]。而对于槟榔致癌的原因目前还没有权威说法。学界对槟榔安全性研究当前主要关注点一是槟榔碱，二是食用槟榔纤维对口腔黏膜损伤[13-15]。本研究试图通过对槟榔生长过程果实成长、槟榔加工过程及食用槟榔产品货架期内槟榔碱含量变化的研究，了解槟榔碱的漂移规律，为研究槟榔碱在产品的安全性方面提供科学的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料和仪器
槟榔鲜果：采自海南省万宁市龙衮镇槟榔种植园；槟榔干果、食用槟榔产品：由海南省农业科学院农产品加工设计研究所槟榔加工研究实验室提供样品。
氯仿（分析纯）、无水乙醇（分析纯）：西陇化工股份有限公司；氢溴酸槟榔碱标准品：Sigma公司；氨水、冰乙酸、乙酸钠、无水硫酸钠、溴甲酚绿、氢氧化钾（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
722型可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；RE-5244旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；DragonLab 100 μL～1 000 μL 数字电动移液器：大龙兴创实验仪器有限公司；DHG-9070A电热恒温鼓风干燥器：上海申贤恒温设备厂。
1.2 方法
1.2.1 取样方法
槟榔果实不同生长阶段中槟榔碱的测定：选择种植园中生长旺盛的3棵槟榔树作为试验的样本树，以槟榔开花时间为基准，将开花后的生长天数作为其生长期。槟榔开花后18 d～20 d坐果，75 d～80 d槟榔核腔初步形成。试验选取槟榔生长期达到80 d开始采收测定，每间隔20 d测定一次。
槟榔加工过程中槟榔碱的含量测定：槟榔加工分两个阶段，第一阶段为初加工，也就是槟榔鲜果变成槟榔干果的过程，加工工艺环节主要是鲜果采收、分选、杀青、烘干、分级及包装；第二阶段为深加工，也就是槟榔干果变成食用槟榔的过程，加工工艺环节主要是槟榔干原料、分选、清洗、脱涩、发制、焖香、抛光、成型、切分、去核、点卤、脱水等一系列复杂的加工工序[16-17]。试验选取同地域、同期采收的鲜槟榔制作食用槟榔，对其中初加工的杀青、烘干，深加工的脱涩、去核等关键环节中的槟榔进行测定。
食用槟榔产品货架期内槟榔碱的含量测定：试验选取同一批次制作并用食品级密封袋包装好的食用槟榔产品，在室温下（25℃）对60 d货架期内的食用槟榔产品进行测定，每隔15 d测定一次。
1.2.2 测定方法
样品制备与槟榔碱的提取：为了保证试验的正确性，将不同的槟榔样品整个切小粉碎，置于250 mL的锥形瓶中，加入 1∶1.2（g/mL）氨水浸泡 1 min，再加入1∶12（g/mL）无水乙醇溶液，搅拌摇匀，在60℃条件下进行超声波辅助提取25 min，重复3次，回收乙醇。将提取物浓缩至5 mL左右，用适量的醋酸-醋酸钠缓冲溶液稀释，并定容至50 mL刻度线[18-19]。
槟榔碱含量的测定：精准吸取供试品溶液1 mL至分液漏斗中，精准加入pH 5乙酸-乙酸钠缓冲液4 mL和溴甲酚绿溶液2 mL（1.8 mol/L），摇匀。分3次萃取，每次精准加入氯仿5 mL，振动 2 min，萃取30 min，分层，将氯仿层置于预先放有0.2 g无水硫酸钠的干燥试管中，静置5 min。精准吸取全部氯仿上清液至比色管中，加入2 mL 0.01 mol/L的氢氧化钾乙醇溶液，摇匀后测定618 nm处的吸光度。
标准曲线的制作：分别量取 0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL的（0.05 mg/mL）槟榔碱标准品溶液置分液漏斗中，按照上述方法于618 nm处测定吸光度，绘制标准曲线。根据回归方程y=58.6x+0.027（R2=0.993），按照下式计算槟榔中槟榔碱的含量[20-21]。
式中：X为槟榔中槟榔碱的干重含量，mg/g；c为槟榔碱的浓度，mg/mL；v为测定时样品溶液的体积，mL；n为测定样品溶液扩大倍数；m为样品的质量，g；w为样品的含水率，%；
1.3 数据处理
每个样品平行测定3次，测定结果以平均值±标准误差表示。采用Microsoft Excel 2007和origin 8.0软件对数据进行处理及作图分析。
2 结果与分析
2.1 槟榔果实不同生长阶段中槟榔碱的含量变化分析
槟榔果实成长过程中槟榔碱含量变化见图1。
由图1可知，生长期在80 d～160 d内槟榔碱的含量变化范围为0.112 mg/g～0.254 mg/g，整体趋势是随着果实的成长槟榔碱含量逐渐增加，平均增长率2.84%。其中80 d～100 d和120 d～140 d随着果实成长槟榔碱的含量变化有显著性差异（p＜0.05），100 d～120 d 和140d～160d槟榔碱的含量变化无显著性差异（p>0.05）。文献报道，槟榔果核中槟榔碱的含量最高[22]，因此试验分析认为，槟榔果实在成长过程中槟榔碱含量逐渐增加符合自然规律。部分数据之间变化不明显，可能是由于果实受外部环境如雨水等影响，也可能是取样时不同果实或操作误差导致的偏差[23]。
图1 槟榔果实成长过程中槟榔碱含量变化
Fig.1 Changes of arecoline content in areca during growth
不同字母表示差异显著（p<0.05）。
2.2 槟榔加工过程中槟榔碱的含量变化分析
槟榔初加工阶段因污水产生的环保问题在工业化生产中有两种杀青方式，水煮杀青和蒸汽杀青。为了缩短杀青时间，本研究在实验室也探讨了高压蒸汽杀青方式。考虑到杀青方式是槟榔碱流失的重要环节之一，为此本文对槟榔初加工过程中不同杀青方式的槟榔碱进行了分析测定。3种不同杀青方式槟榔碱的损失率变化分析见图2。
图2 槟榔在加工过程中槟榔碱的含量变化
Fig.2 Changes of arecoline content in areca during processing
不同字母表示差异显著（p<0.05）。
由图2可知，采用水煮杀青和高压蒸汽杀青之间的槟榔碱损失率无显著性差异（p>0.05），但与蒸汽杀青之间均有显著性差异（p＜0.05）。3种杀青方式槟榔碱损失率分别为23.86%、22.22%、14.40%，蒸汽杀青槟榔碱损失率最低。
后续的烘干、脱涩和去核环节由于加工工艺和参数一致，对3种方式来源相同的原料，槟榔碱损失率相对之间无显著性差异（p>0.05）。但在槟榔整个加工过程中槟榔碱在4个环节损失还是较大的，其中杀青环节最大、烘干次之，其次为去核和脱涩。槟榔整个加工过程槟榔碱平均损失率为56.44%，4个环节中平均损失率分别为20.16%、20.15%、10.81%和5.32%。
试验研究认为槟榔果实在杀青、烘干、脱涩和去核环节槟榔碱都有流失，由于槟榔碱为水溶性物质，杀青和脱涩环节其在高温水中，槟榔碱较大流失是合理的[24]。烘干环节槟榔碱是随水分蒸发或升华而流失，或两者兼具之还没有文献报道。刘蕊等和古桂花等[25-26]探究了烘干温度和时间对槟榔中槟榔碱含量的影响，其研究认为槟榔碱会随着烘干的时间和温度的增长而降低，但也没有报告槟榔碱流失的原因。去核环节槟榔碱流失是因为槟榔碱主要含在槟榔果核里，去掉槟榔核的食用槟榔产品中槟榔碱当然会大大降低。
2.3 食用槟榔产品货架期槟榔碱的含量变化分析
本研究对食用槟榔产品60 d货架期内，每间隔15 d槟榔碱的变化情况进行了分析测试。食用槟榔产品在60 d货架期内槟榔碱损失率的变化见图3。
图3 食用槟榔产品货架期槟榔碱的含量变化
Fig.3 Changes of arecoline content of edible areca in shelf life
不同字母表示差异显著（p<0.05）。
由图3看出，采用水煮、蒸汽和高压蒸汽杀青原料制作的食用槟榔产品，其槟榔碱都存在不同程度的损失。3种不同杀青方式加工的产品之间有所不同，但均无显著性差异（p>0.05）。而整个货架期内槟榔碱平均损失率还是很高的，达到了18.16%；其中第15天、第30天、第40天、第60天分别损失了11.17%、2.19%、2.47%和2.33%，第15天槟榔碱的损失率最大。说明食用槟榔产品在货架期内，槟榔碱会也会流失，损耗的原因还不清楚。
3 结论与讨论
槟榔从幼果到成熟，再经过初加工、深加工和食用槟榔货架期内的整个过程，槟榔碱都在发生变化。槟榔果实成长期是槟榔碱的积累过程，到果实成熟后槟榔碱积累达到高峰，这个过程结束；槟榔碱在槟榔加工过程经历了很大的变化，总的趋势是不断减少，槟榔加工成最终产品食用槟榔时槟榔碱的含量大约为0.097 mg/g～0.116 mg/g，这个含量只占原果含量的37%～40%，大半槟榔碱在加工过程中流失掉了；槟榔碱在食用槟榔产品货架期内也有一定流失，研究结果表明其可达到初始产品的18.16%。
此研究探讨了槟榔从成长到形成产品槟榔碱的漂移规律，试图了解槟榔碱在食用槟榔产品的中变化规律，以期为研究食用槟榔产品槟榔碱安全性提供理论基础。
[1] 康效宁,吉建邦,李梁.槟榔烘制工艺中不安全因子分析[J].食品与机械,2015,31(1):68-70
[2]GUPTA P,WARNAKULASURIYA S.Global epidemiology of areca nut usage[J].Addict Biol,2002,7:77-83
[3]PENG W,LIU Y J,WU N,et al.Areca catechu L.(Are-caceae):a reviewof its traditional uses,botany,phytochem-istry,pharmacology and toxicology[J].J Ethnop-harmacol,2015,164:340-356
[4] NELSONB S,HEISHOBER B.Betelnut:acommom drug used by naturalized citizens from india,Far East Asia,and the South Pacific Islands[J].Annalsof Emergency Medicine,1999,34:238-243
[5] 李梁,吉建邦,康效宁,等.含水量对槟榔干质地的影响研究[J].食品工业科技,2014,35(19):111-113,118
[6] 易书瀚,李珂,杨靖,等.槟榔提取物的生物活性研究进展[J].食品研究与开发,2019,40(7):207-212
[7] ZHENG L,GUAN Z J,PAN W T,et al.Tanshinone Suppresses Arecoline-Induced Epithelial-Mesenchymal Transition in Oral Submucous Fibrosis by Epigenetically Reactivating the p53 Pathway[J].Oncology Research,2018,26:483-494
[8]WANG T S,LIN C P,CHEN Y P,et al.CYP450-mediated mitochondrial ROS production involved in arecoline N-oxide-induced oxidative damage in liver cell lines[J].Environmental Toxicology,2018,33:1-10
[9] 孙娟,曹立幸,陈志强,等.中药槟榔及其主要成分的药理和毒理研究概述[J].广州中医药大学学报,2018,35(6):1143-1146
[10]孙露,宋海波,张力,等.中药槟榔及其制剂的安全性系统评价[J].中国中药杂志,2017,42(21):4067-4073
[11]熊雄,李珂,易书瀚,等.食用槟榔中槟榔碱毒性及生理活性研究进展[J].食品工业科技,2017,38(20):328-335
[12]KONDAIAH P,PANT I,KHAN I.Molecular pathways regulated by areca nut in the etiopathog-enesis of oral submucous fibrosis[J].Periodontology 2000,2019,80:213-224
[13]YOU Y H,HUANG Y,WANG D,et al.Angiotensin(1-7)inhibits arecoline-induced migration and collagen synthesis in human oral myofibroblasts via inhibiting NLRP3 inflammasome activation[J].Cell Physiol,2019,234:4668-4680
[14]刘清辉,何黎明.核受体共激活因子7在槟榔碱诱导的上皮间充质转化中的生物学功能[J].口腔医学,2020,40(1):43-47
[15]康效宁,吉建邦,李梁,等.缓苏处理对槟榔干果品质的影响[J].海南师范大学学报(自然科学版),2016,29(2):166-168
[16]康效宁,李梁,吉建邦.三点弯曲法测定槟榔干果纤维层弹性模量研究[J].食品与机械,2018,34(10):212-216
[17]张大河,周晌辉.口腔黏膜下纤维性变癌变的发生机制研究进展[J].中国口腔颌面外科杂志,2020,18(1):71-76
[18]罗士数,张海德,朱莉,等.槟榔中槟榔碱的乙醇回流提取工艺研究[J].食品科学,2010,31(20):106-110
[19]王海灿,吉建邦,康效宁,等.鲜槟榔中槟榔碱的提取工艺研究[J].食品与机械,2009,25(3):55-58
[20]史载锋,吴亚弟,林小明,等.槟榔碱提取分离工艺的研究[J].海南师范学院学报(自然科学版),2006(3):246-247,266
[21]高敏,高淑芹.光度法测定槟榔中槟榔碱的含量[J].化学分析计量,2003(1):28-30
[22]刘蕊.槟榔花果中槟榔碱含量的时空变化[J].江西农业学报,2014,26(6):54-55
[23]WANG C K,LEE W H,PENG C P.Contents of Phenolics and Alkaloids in Areca catechu Linn.During Maturation[J].Agric Food Chem,1997,45:1185-1188
[24]李汴生,顾伟樑,阮征.烫漂和烘干过程对槟榔中槟榔碱含量的影响[J].食品与发酵工业,2017,43(10):157-160
[25]刘蕊,郑俊毫.烘干温度与时间对槟榔中槟榔碱含量的影响][J].现代农业科技,2014(7):291-292
[26]古桂花,胡虹,曾薇,等.槟榔不同工艺处理品中3种生物碱的含量比较[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(4):44-47