目前，市面上大部分的乳酒都是以马奶或羊奶为原料，以开菲尔粒或酵母菌与乳酸菌的混合菌为发酵剂，但存在酸度普遍偏高的不良特性[1-8]。利用大豆制得的豆浆与马奶或羊奶相比，含有较为丰富的植物蛋白质及营养物质，是马奶或羊奶理想的替代品，也是近年来研究的热点[9-11]。豆浆酒作为一种含有酒精的复合饮料，与传统的乳酒相比，其特点是含有丰富的植物蛋白和豆乳的其他营养成分，既补充了我国居民因牛乳等动物蛋白摄入不足的缺陷，又比传统的乳酒口感更加柔和[12-14]。虽然豆浆酒酒体风味独特、口感柔和，但是其中的豆腥味始终不能很好地去除进而影响豆浆酒整体的感官特性[14-15]。
复合型发酵酒是使用两种或两种以上的酿酒原料发酵而成的酒品，其能综合两种或两种以上原料的特点与优势，弥补利用单一原料酿酒在色、香、味上的欠缺和营养成分不足等缺陷[16]。洋葱是药食两用的蔬菜，具有去腥增香的作用且富含多种营养物质，如含硫化合物、维生素、类黄酮、花色苷、甾体化合物、前列腺素A 等，因而使其具有抑菌抗氧化、降低心血管发病率、缓解糖尿病症等保健功能[17-21]。因此，本试验通过洋葱汁与豆浆混合发酵酿造，以期酿出的酒体风味突出、口感幼滑、酸度适中且具有一定功效的豆浆酒，为工业化生产提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酿酒酵母：安琪酵母股份有限公司；大豆、洋葱、白砂糖：宜宾大润发超市；冰乙酸、乙酸钠、柠檬酸、氢氧化钠：均为分析纯，湖北鑫润德化工有限公司；亚硫酸钠（分析纯）：南京试剂有限公司；硫酸铜（分析纯）、酒石酸钾钠（分析纯）：无锡市亚泰联合化工有限公司；次甲基蓝：天津市福晨化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
JYL-C91T 型豆浆机：九阳股份有限公司；SW-CJ-2FD 型超净工作台：苏州净化设备有限公司；FA20043型电子天平：上海越平科学仪器有限公司；LXJ-IIB 低速大容量多管离心机：郑州长城工贸有限公司；MCGNP-9080 系列隔水式恒温培养箱：青岛明成环保科技有限公司；DSX-280A 型不锈钢手提式灭菌器：上海申安医疗器械厂；BCD-2HBSA 型电冰箱：青岛海尔股分有限公司；PHs-3c 型精密pH 计：上海理达仪器厂；Alcomat Super 酒精度测试仪：意大利盖博分析仪器公司。
1.3 洋葱豆浆酒酿造工艺流程
操作要点：挑选颗粒成熟饱满的大豆，去除其中的杂质，清水洗净后用5 倍质量的清水浸泡9 h～12 h；将浸泡好的大豆按1∶10 的质量比加水磨浆后根据单因素试验及响应面试验的条件添加洋葱汁及不同浓度的白砂糖，用柠檬酸溶液调pH值到5.0 后添加0.02%的亚硫酸钠，以抑制杂菌的生长；在无菌条件下接入一定量的经活化后的酵母菌悬液，25 ℃发酵，待发酵完成后置于4 ℃的冰箱中后熟24 h。
1.4 试验方法
1.4.1 理化指标测定方法
总糖（以葡萄糖计）测定：斐林试剂法[22]；酒精体积分数测定：密度瓶法[22]；总酸测定：电位滴定法[22]；氨基酸态氮测定：甲醛滴定法[22]。
1.4.2 感官评价
感官评价在学院食品品评室内完成，邀请13 位教师及实验员组成评定小组，明确感官评定的指标和注意事项。参照符桢华、周传云等人对豆浆酒的研究方法[13-14]及标准GB/T 23546-2009《奶酒》[22]对洋葱豆浆酒从色泽（满分5 分）、组织形态（满分5 分）、香气（满分30 分）、滋味（满分40 分）、典型性（满分20 分）5 个方面制定洋葱豆浆酒感官评价标准，如表1所示。
表1 洋葱豆浆酒评分细则
Table 1 Scoring rubric of onion soymilk liquor
项目 分数段 评分标准色泽 4.5 分以上 乳白微黄，晶莹透彻，悦目协调4.0 分～4.4 分 白色或灰白色，澄清透亮3.5 分～3.9 分 深黄色，酒体浑浊3.0 分～3.4 分 与该产品应有的色泽不符组织形态4.5 分以上 澄清透明、有光泽4.0 分～4.4 分 澄清透明、无明显悬浮物3.5 分～3.9 分 澄清，无夹杂物3.0 分～3.4 分 微浑，失光香气 27 分以上 具有天然的豆乳香、发酵醇香和葱香，香气协调，令人愉悦24 分～26 分 有豆乳香或发酵香，葱香味淡雅不冲突，无异香21 分～23 分 豆乳香和发酵香微弱，无异香18 分～20 分 无豆乳香和发酵香，无葱香或洋葱风味过于突出，不协调滋味 36 分以上 润滑刹口，口味纯正、鲜爽，酒体丰满，醇厚协调，余味长32 分～35 分 口味较为纯正、鲜爽，酒体较丰满、醇厚，无涩味和苦味，余味较长28 分～31 分 刹口力差，口味较纯正、鲜爽，酒体圆润，涩味或苦味较重，无余味24 分～27 分 不刹口，口味不纯正，涩味或苦味很重，有异味典型性18 分以上 风格独特，优雅无缺16 分～17 分 典型明确，风格良好14 分～15 分 有典型性，不够怡雅12 分～13 分 有明显缺陷
1.4.3 洋葱豆浆酒发酵工艺条件的单因素试验
1.4.3.1 白砂糖添加量对洋葱豆浆酒发酵效果的影响
在豆浆中加入4%的洋葱汁后煮沸，分别加入8%、10 %、12 %、14 %、16 %的白砂糖及0.02 %的亚硫酸钠，待冷却后接入0.2%的酵母菌，25 ℃发酵5 d 后分别记录洋葱豆浆酒的感官特征，以确定较佳的白砂糖添加量。
1.4.3.2 洋葱汁添加量对洋葱豆浆酒发酵效果的影响
将洋葱汁分别按照0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%的百分比添加到豆浆中煮沸，并添加12%的白砂糖及0.02%的亚硫酸钠，待冷却后接入0.2%的酵母菌，25 ℃发酵5 d 后进行感官评价，以确定较佳的洋葱汁添加量。
1.4.3.3 接种量对洋葱豆浆酒发酵效果的影响
将洋葱汁分别按照4%的添加量加入到豆浆中煮沸，并添加12%的白砂糖及0.02%的亚硫酸钠，待冷却后分别接入0.10 %、0.15 %、0.20 %、0.25 %、0.30 %的酵母菌，25 ℃发酵5 d 后分别进行感官评价，以确定较佳的酵母菌接种量。
1.4.3.4 发酵时间对洋葱豆浆酒发酵效果的影响
将洋葱汁分别按照4 %的添加量加入到豆浆中煮沸，并添加12%的白砂糖及0.02%的亚硫酸钠，待冷却后接入0.2%的酵母菌，在25 ℃的条件下分别发酵3、4、5、6、7 d 并进行感官评价，以确定较佳的发酵时间。
1.4.4 洋葱豆浆酒发酵工艺条件的响应面优化试验
在单因素试验的基础上，根据Box-Benhnken[23]的中心组合试验设计原理，进行四因素三水平的响应面分析试验，确定洋葱豆浆酒最佳的酿造工艺条件，因素水平如表2所示。
表2 响应面试验因素水平
Table 2 Level and code of independent variable used for response surface analysis
水平 A白砂糖添加量/%B C D发酵时间/d-1 10 3 0.20 3 0 12 4 0.25 4 1 14 5 0.30 5洋葱汁添加量/%接种量/%
1.5 数据分析处理方法
以上每个试验重复3 次，结果取平均值。采用OriginPro 9.1 软件进行数据制图和统计分析。Design Expert 8.0.6 软件进行响应面设计及结果分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 白砂糖添加量对洋葱豆浆酒感官评分的影响
控制处理条件为洋葱汁添加量4%、接种量0.20%、发酵时间5 d，考察在白砂糖添加量分别为8%、10%、12%、14%、16%时洋葱豆浆酒的感官评分，结果见图1。
图1 白砂糖添加量对洋葱豆浆酒感官评分的影响
Fig.1 Effect of sugar addition on sensory evaluation of onion soymilk liquor
不相同字母表示差异显著（p<0.05）。
由图1可知，当洋葱豆浆酒中白砂糖添加量从8 %增加到12%，洋葱豆浆酒的感官评分也随之增加；当添加量达到12%时，洋葱豆浆酒的感官评分达到最高分（74.82±0.83）分。但随着白砂糖添加量的继续增加，洋葱豆浆酒的感官评分开始呈现出逐渐下降的趋势。糖分在洋葱豆浆酒发酵过程中主要转化为乙醇，也可以转化成酸类、酯类、醛类等物质[14]，洋葱豆浆酒在发酵过程中，可发酵性糖偏少会出现酒体不丰满、香味不足的现象，可发酵性糖过多则会造成酒体酸度偏大等不良现象。故选用白砂糖添加量为10%、12%及14%用于后续响应面法试验。
2.1.2 洋葱汁添加量对洋葱豆浆酒感官评分的影响
洋葱汁添加量对洋葱豆浆酒感官评分的影响见图2。
图2 洋葱汁添加量对洋葱豆浆酒感官评分的影响
Fig.2 Effect of onion juice addition on sensory evaluation of onion soymilk liquor
不相同字母表示差异显著（p<0.05）。
由图2可知，洋葱汁能显著改善豆浆酒的风味特征，不仅能有效去除豆浆酒中的豆腥味，而且能赋予豆浆酒独特的风味。洋葱豆浆酒的感官评分随着洋葱汁添加量的增加而呈现出先增高后降低的趋势，当洋葱汁添加量为4%时，洋葱豆浆酒的感官评分达到最高的（74.82±0.83）分。因洋葱汁含有大量的合丙烷硫醛和硫氧化物等物质，故使其具有较强的辛辣味[17]，洋葱汁加入量过大会导致洋葱豆浆酒呈现出较强的刺激性及辛辣感，因此当洋葱汁添加量适当时才能赋予洋葱豆浆酒特殊的风味。由此选择3%、4%、5%的洋葱汁添加量用于响应面优化试验。
2.1.3 接种量对洋葱豆浆酒感官评分的影响
接种量对洋葱豆浆酒感官评分的影响见图3。
图3 接种量对洋葱豆浆酒感官评分的影响
Fig.3 Effect of inoculums concentration on sensory evaluation of onion soymilk liquor
不相同字母表示差异显著（p＜0.05）。
由图3可知，随着酵母菌接种量的不断增加，洋葱豆浆酒的感官评分也随之不断增加。当酵母菌接种量为0.30%时，洋葱豆浆酒的感官评分达到最高的（76.24±1.01）分。酵母菌在发酵过程中能将可发酵性糖转化为二氧化碳和乙醇，同时还会产生其它一些醇、醛、酸、酯等香味物质[13]。当酵母菌接种量偏低时，容易使酿酒原料不能完全发酵，造成洋葱豆浆发酵酒度偏低、酒香不突出等现象。当酵母菌的接种量为0.25%时，其洋葱豆浆酒的感官评分虽然较酵母菌接种量为0.30%时低，但两者并无显著性差异（p＞0.05）。所以选择酵母菌接种量为0.20%～0.30%用于响应面法试验。
2.1.4 发酵时间对洋葱豆浆酒感官评分的影响
控制处理条件白砂糖添加量12%、洋葱汁添加量4%、接种量0.20%，分别考察发酵时间为3、4、5、6、7 d时洋葱豆浆酒的感官评分，结果见图4。
由图4可知，当洋葱豆浆酒的发酵时间为4 d 时，洋葱豆浆酒的感官评分最高为（78.50±0.72）分。当发酵时间短于4 d 时，可发酵性糖类还未完全被酵母菌所利用，酒体略显寡淡，香味不浓郁。当发酵时间长于4 d时，酒体产生了不良气味，破坏了酒汁的风味，其原因可能是洋葱汁在长时间发酵过程中，其中的含硫化合物被分解代谢后产生了一些不愉悦的气味[18]。表明在白砂糖添加量12%、洋葱汁添加量4%、接种量0.20%的条件下，洋葱豆浆酒的最佳发酵时间在4 d 左右。因此选择发酵时间为3 d～5 d 用于后续试验。
图4 发酵时间对洋葱豆浆酒感官评分的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on sensory evaluation of onion soymilk liquor
不相同字母表示差异显著（p＜0.05）。
2.2 响应面法试验
根据Box-Benhnken 中心组合试验设计原理，通过Design Expert 8.0.6 软件设计响应面法试验，对白砂糖添加量、洋葱汁添加量、接种量、发酵时间4 个因素分析得到以下试验方案及结果，见表3。
表3 响应面试验设计及结果
Table 3 Experimental design and results for response surface analysis
感官评分1 0-1 0-1 85.43 2 0 1 0-1 84.67 3-1 0 1 0 83.44 4 0 1-1 0 84.56 5-1 0-1 0 81.56 6 0 0 0 0 86.17 7 0 1 1 0 80.89 8 1 0 0-1 85.56 9 0 0 1 1 77.67 10 0 0 0 0 85.43 11 0 0 0 0 85.50 12 0 0 0 0 85.00 13-1 1 0 0 77.33 14 0 0 1-1 82.44 15 0 0-1-1 80.78 16 0-1-1 0 83.56 17 0 0 0 0 85.89 18 1 1 0 0 81.67 19-1 0 0-1 76.44 20 1 0-1 0 78.43 21 1 0 0 1 78.67序号A B C D白砂糖添加量洋葱汁添加量接种量发酵时间
续表3 响应面试验设计及结果
Continue table 3 Experimental design and results for response surface analysis
感官评分22 0 1 0 1 78.78 23-1 0 0 1 79.22 24 1 0 1 0 83.89 25 0-1 1 0 82.22 26-1-1 0 0 82.44 27 0-1 0 1 81.78 28 1-1 0 0 83.22 29 0 0-1 1 80.22序号A B C D白砂糖添加量洋葱汁添加量接种量发酵时间
再通过Design-Expert 8.0.6 软件对响应面法试验得到的感官评分（表3）进行方差分析，得到结果如表4所示。
表4 方差分析
Table 4 Analysis of variance for the fitted regression model
注：*表示在p＜0.05 水平上显著，**表示在p＜0.01 水平上极显著。
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 p 值 显著性模型 180.33 14 12.88 3.20 0.018 7 *A 10.10 1 10.10 2.51 0.135 6 B 9.63 1 9.63 2.39 0.144 4 C 0.17 1 0.17 0.043 0.838 9 D 30.02 1 30.02 7.45 0.016 3 *AB 3.17 1 3.17 0.79 0.390 2 AC 3.20 1 3.20 0.80 0.387 6 AD 23.38 1 23.38 5.80 0.030 3 *BC 1.36 1 1.36 0.34 0.570 9 BD 1.25 1 1.25 0.31 0.585 7 CD 4.43 1 4.43 1.10 0.312 1 A2 51.52 1 51.52 12.79 0.003 0 **B2 6.27 1 6.27 1.56 0.232 7 C2 22.07 1 22.07 5.48 0.034 6 *D2 52.48 1 52.48 13.03 0.002 8 **残差 56.40 14 4.03失拟项 4.72 10 0.47 2.60 0.185 5纯误差 1.58 4 0.39总离差 236.73 28
由表4可知，4 个因素对洋葱豆浆酒感官评分影响的强弱顺序依次为：发酵时间＞白砂糖添加量＞洋葱汁添加量＞接种量，其中发酵时间对洋葱豆浆酒感官评分的影响显著（p＜0.05）。白砂糖添加量与发酵时间之间具有显著的交互作用（p＜0.05）。设白砂糖添加量、洋葱汁添加量、接种量、发酵时间分别为A、B、C、D，以洋葱豆浆酒的感官评分为响应值，经多元回归拟合后，得到洋葱豆浆酒感官评分回归方程：洋葱豆浆酒感官评分=85.70+0.92A-0.90B+0.12C-1.58D+0.89AB+0.89AC-2.42AD-0.58BC-0.56BD-1.05CD-2.82A2-0.98B2-1.84C2-2.84D2
根据表4 中方差分析结果，洋葱豆浆酒感官评分的回归方程描述与响应面值之间的关系模型显著（p＜0.05），且失拟项检验不显著（p＞0.05），表明未知因素对试验结果的干扰较小，该试验模型充分拟合试验数据，洋葱豆浆酒感官评分的回归方程是洋葱豆浆酒感官评分与洋葱豆浆酒发酵工艺各参数的合适数学模型，即可以利用此回归方程确定洋葱豆浆酒酿造的最佳工艺[24]。
响应面图形是响应值对各试验因子所构成的三维空间的曲面图，从响应面分析图上可形象地看出最佳参数及各参数之间的相互作用[25]。根据洋葱豆浆酒感官评分回归方程得出不同因子的响应面分析图结果见图5。
图5 两因素交互作用对感官评分的响应面图
Fig.5 Response surface plots for the effect of operating parameters on the sensory evaluation
由响应面图曲面坡度越陡峭、等高线越密集成椭圆形表示两因素交互影响越大的原则[24-26]可知，因子A（白砂糖添加量）与因子D（发酵时间）之间所形成的响应面曲面坡度在两因素交互作用响应面图中最为陡峭，即因子A 与因子D 相互之间具有最强的交互作用。该结果与表4 方差分析所得的白砂糖添加量与发酵时间之间具有显著的交互作用（p＜0.05）的结论相吻合。
通过Design-Expert 8.0.6 软件分析确定洋葱豆浆酒的最佳发酵工艺条件为白砂糖添加量12.94%、洋葱汁添加量3.81%、接种量0.27%及发酵时间3.49 d，此条件下由公式算出的理论值为86.32 分。根据所得的分析数据进行3 组验证试验，验证试验的条件为白砂糖添加量12.9%、洋葱汁添加量3.8%、接种量0.27%及发酵时间3.5 d，得到洋葱豆浆酒的感官评分为（86.78±1.04）分，测定结果稳定，偏差不大，证明该结果合理可靠。
2.3 理化指标分析
经测得洋葱豆浆酒在最佳发酵工艺条件下的总糖为13.1 g/L、酒精度4.5 %vol、总酸7.6 g/L、氨基酸态氮0.12 g/L。4种理化指标均符合中华人民共和国GB/T 23546-2009《奶酒》标准[22]。
3 结论
在单因素试验的基础上采用响应面法对洋葱豆浆酒的发酵工艺条件进行了优化，影响洋葱豆浆酒感官评分的工艺因素按主次顺序排列为发酵时间＞白砂糖添加量＞洋葱汁添加量＞接种量。最终确定了其最优工艺条件为：将浸泡好的大豆按1∶10 的质量比加水磨浆后添加3.8%的洋葱汁，并加入12.9%的白砂糖，用柠檬酸溶液调pH值到5.0 后添加0.02%的亚硫酸钠，在无菌环境条件下接入0.27%经活化后的酵母菌悬液，在25 ℃条件下发酵3.5 d 后置于4 ℃的冰箱中后熟24 h。此条件下可获得色泽微黄、透明，豆香、葱香与酒香和谐、酒体圆润的洋葱豆浆酒，其感官评分为86.78 分。
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