荸荠是一种在中国有三千年种植历史的水果，在我国有较大的种植面积，达到5 万hm2 以上，年产量达百万吨以上[1-2]。荸荠味甜多汁，深受人们喜爱，有“地下雪梨”的美称[1]。常被作为垃圾抛弃的荸荠皮富含多种有效成分，其中就包括色素。荸荠皮色素作为一种天然色素，安全无毒副作用，甚至具有一定的疗效和保健功能，研究荸荠皮中色素的提取意义重大[3-8]。
色素常用的提取方法有有机溶剂浸提法、碱法、微波法、超声波法等。有机溶剂浸提法[9-13]浸提时间长、效率低，分离效果不好。碱法[5]操作简便，但会产生大量腐蚀性较强的废液，对环境带来了较大的负面影响。微波法[13-17]和超声波法[13，18-20]高效省时，但微波和超声波对人体会带来较大的负面影响。酶法[21-25]利用破壁作用来降低传质阻力帮助提取，操作简便，且效率较高，也尚未见在荸荠皮色素提取中应用的记载。常见的酶中木瓜蛋白酶活力值高、易溶解、后处理容易，而且还可催化蛋白质水解，减少蛋白质对提取的影响，因此该试验采用木瓜蛋白酶的方法提取荸荠皮色素，并优化提取工艺条件，为其进一步开发利用提供理论基础。
1 仪器与试剂
1.1 试剂及材料
荸荠：四川内江农贸市场；木瓜蛋白酶（生物试剂，活力值≥80 万U/g）：上海源叶生物科技有限公司；乙酸钠、乙酸、无水乙醇（均为分析纯）：成都金山化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
T-6 型紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；7230G 型可见分光光度计：上海洪纪仪器设备有限公司；DF-101S 型恒温加热磁力搅拌器：郑州英峪予华仪器有限公司；TDL-5-A 型低速大容量离心机：上海安亭科学仪器厂；FA2204A 型电子天平：上海精天电子仪器有限公司；DFT-100 型手提式万能高速粉碎机：温岭市林大机械有限公司；SHB-B95 型循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；CS101-2AB 型电热鼓风干燥箱：重庆试验设备厂。
2 试验方法
2.1 测定波长的选择
称取1.00 g 荸荠皮干粉加入到圆底烧瓶中，再加入20 mL 利用pH值为5 的水溶液配制的体积浓度为30%的乙醇溶液，40 ℃下回流2 h，沸水浴灭酶，冷却，离心取清液，过滤，将滤液在50 mL 容量瓶中，用乙醇定容。从容量瓶中取出液体，在300 nm～600 nm 范围内利用紫外分光光度计扫描，发现在430 nm 处有一强吸收峰，与文献数据[26]相符，因此选择430 nm 为测定波长。
2.2 荸荠皮色素的提取和测定
称取1.00 g 荸荠皮干粉加入到圆底烧瓶中，按照一定液料比加入利用pH值为5 的水溶液配制的一定体积浓度的乙醇溶液，在一定温度下回流一定时间，沸水浴灭酶，冷却，离心取清液，过滤，将滤液在50 mL 容量瓶中，用乙醇定容。
从50mL 容量瓶中取出2.00 mL 溶液，加入到25 mL比色管中，用蒸馏水稀释到10 mL。比色管中取出液体在430 nm 波长位置，测定其吸光度值。由于比尔-朗伯定律[27]，吸光度与浓度之间存在良好的线性关系，所以本试验以吸光度值的大小反映荸荠皮色素提取的效果。
2.3 单因素试验
在荸荠皮质量1.00 g 的条件下，利用单因素试验考查乙醇浓度（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）、酶用量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）、液料比[10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1（mL/g）]、温度（30、40、50、60、70、80 ℃）和提取时间（1、2、3、4、5 h）的影响。
2.4 正交试验
在单因素试验的基础上，以乙醇浓度、酶用量、液料比、温度和时间5 个因素，每个因素4 个水平，设计L16（45）正交表并安排试验，重复2.2 的操作。
3 结果与分析
3.1 单因素试验
3.1.1 乙醇浓度对色素提取效果的影响
乙醇浓度对荸荠皮色素提取效果的影响如图1所示。
图1 乙醇浓度对色素提取效果的影响
Fig.1 Influence of ethanol concentration on extraction effect of pigment
从图1可看到随着乙醇浓度的增加，提取液的吸光度越来越大；当乙醇体积浓度达到70%后，继续增大乙醇浓度，提取液吸光度值没出现明显增大。这是由于荸荠皮色素在乙醇中溶解度较大，乙醇浓度越大，则能溶解进入溶液的荸荠皮色素越多，当乙醇浓度达到70%时，荸荠皮色素已经基本完全进入溶液中，而且乙醇浓度的增加也会导致一些难溶于乙醇的树脂状杂质量的增加，同时木瓜蛋白酶在乙醇中溶解度较小，乙醇浓度太大时可能会使木瓜蛋白酶不能均匀分散甚至以固体形式析出，导致活力值得不到充分发挥，使荸荠皮色素的提取受到影响。因此，综合考虑得率和节约资源，选择乙醇浓度为70%。
3.1.2 酶用量对色素提取效果的影响
酶用量对荸荠皮色素提取效果的影响如图2所示。
从图2可看到，随着木瓜蛋白酶用量的增加，从吸光度变化可看到荸荠皮色素得率逐渐增加；当酶用量达到0.5%后，随着酶用量的继续增加提取液吸光度没有出现明显的变化。这是由于木瓜蛋白酶具有破壁作用，酶用量越大，则破壁能力越强，越有利于荸荠皮色素从荸荠皮组织解吸进入溶液中，但当酶用量达到0.5%时，其破壁能力几乎已发挥到极致。因此，考虑到节约资源，选择酶用量为0.5%。
图2 酶用量对色素提取效果的影响
Fig.2 Influence of enzymatic dosage on extraction effect of pigment
3.1.3 液料比对色素提取效果的影响
液料比对荸荠皮色素得率的影响如图3所示。
图3 液料比对色素提取效果的影响
Fig.3 Influence of liquid-solid ratio on extraction effect of pigment
从图3可看到，随着溶剂用量的增加，吸光度先逐渐增加，后逐渐降低，当液料比为35∶1（mL/g）时达最大值。这是由于溶剂越多，能溶解的荸荠皮色素越多，但溶解带出的脂溶性杂质也越多，导致传质阻力增大使荸荠皮色素的析出受到抑制。因此，选择液料比为35∶1（mL/g）。
3.1.4 温度对色素提取效果的影响
提取温度对荸荠皮色素提取效果的影响如图4所示。
图4 温度对色素提取效果的影响
Fig.4 Influence of temperature on extraction effect of pigment
从图4可看到在30 ℃～50 ℃温度范围内，随提取温度升高，吸光度逐渐增大，当温度为50 ℃达最大值；此后在50 ℃～80 ℃范围内，随温度的升高，吸光度逐渐下降。这是由于温度越高，分子运动越活跃，就会有更多的荸荠皮色素进入并溶于溶液中，但温度过高时，分子运动过快，会导致荸荠皮色素从荸荠皮组织解吸进入溶液中的通道受阻，也会导致已进入溶液的部分荸荠皮色素氧化变质。因此，选择提取温度为50 ℃。
3.1.5 时间对色素提取效果的影响
提取时间对荸荠皮色素提取效果的影响如图5所示。
图5 时间对色素提取效果的影响
Fig.5 Influence of time on extraction effect of pigment
从图5可看到在1 h～4 h 范围内，随着提取时间的增大，作为反映荸荠皮色素提取效果指标的吸光度逐渐增加；当达到4 h 时，达最大值；此后随时间的延长吸光度开始出现下降的趋势。这是由于时间越长，则解吸进入溶液中的荸荠皮色素越多，但时间过长也会导致浸出的部分色素在酶作用下分解变质。因此选择提取时间为4 h。
3.2 正交试验
根据单因素试验的结果，以乙醇浓度、酶用量、液料比、温度和时间为因素的L16（45）正交表的正交试验设计、试验结果及极差分析结果见表1，方差分析结果见表2。
表1 L16（45）正交试验试验设计及结果
Table 1 L16（45）orthogonal experimental design and results
试验号 A 乙醇浓度/%B 酶用量/%C 液料比/(mL/g)D 温度/℃E 时间/h 吸光度1 60 0.1 25∶1 40 2 0.515 2 60 0.3 30∶1 50 3 0.581 3 60 0.5 35∶1 60 4 0.759 4 60 0.7 40∶1 70 5 0.789 5 70 0.1 30∶1 60 5 0.77 6 70 0.3 25∶1 70 4 0.679 7 70 0.5 40∶1 40 3 0.739 8 70 0.7 35∶1 50 2 0.871 9 80 0.1 35∶1 70 3 0.694 10 80 0.3 40∶1 60 2 0.649 11 80 0.5 25∶1 50 5 0.763 12 80 0.7 30∶1 40 4 0.877 13 90 0.1 40∶1 50 4 0.810 14 90 0.3 35∶1 40 5 0.874 15 90 0.5 30∶1 70 2 0.819 16 90 0.7 25∶1 60 3 0.889 k1 0.661 0.697 0.712 0.751 0.714 k2 0.765 0.696 0.762 0.756 0.726 k3 0.746 0.770 0.799 0.767 0.781 k4 0.848 0.857 0.747 0.745 0.799 R 0.187 0.161 0.087 0.022 0.085
表2 正交试验结果方差分析
Table 2 Variance analysis of the orthogonal experiment results
注：F0.05（3，3）=9.280，F0.01（3，3）=29.500，*代表p＜0.05 为影响显著，**代表p＜0.01 为影响非常显著。
因素 SS df F P A 0.071 3 71.000 **B 0.069 3 69.000 **C 0.016 3 16.000 *D 0.001 3 1.000 E 0.021 3 21.000 *误差(e) 0.00 3
从表1可看到，最佳水平组合为A4B4C3D3E4，即乙醇浓度90%，酶用量0.7%，液料比35∶1（mL/g），提取温度60 ℃，提取时间5 h。
从表2 的方差分析可知在所选择的正交试验因素水平范围内，因素A、B 即乙醇浓度、酶用量的影响，均达到非常显著的水平（p＜0.01），因素C、E 即液料比和提取时间的影响达到了显著的水平（p＜0.05），因素D 即提取温度的影响不显著。而F 值结果表明，各因素影响的主次顺序为：A（乙醇浓度）＞B（酶用量）＞E（提取时间）＞C（液料比）＞D（提取温度）。
对正交试验结果作了3 次平行试验验证，所得吸光度值分别为0.888、0.890、0.910，平均值0.896，高于正交试验表中的值，说明了正交试验结果的正确性。
4 结论
本试验利用木瓜蛋白酶提取荸荠皮色素的最佳工艺条件为：乙醇浓度90 %，酶用量0.7 %，液料比35∶1（mL/g），提取温度60 ℃，提取时间5 h。最佳条件下所测得的荸荠皮色素提取液的吸光度值为0.896，高于相同条件下不使用酶时的测得值0.769。该结论为荸荠皮色素的开发利用提供了基本参考依据。
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