蛴螬（Protaetia brevitarsis）是东亚地区一种经典的民间药材，它含有多种人类所需的氨基酸和无机元素，临床上用于促进血液循环已有数百年历史。近年来人们也对蛴螬进行了更深入的科学研究。现代药理研究表明蛴螬具有抗肿瘤、保肝、治疗口疮、小儿哮喘、中风、血吸虫病肝硬化等多种药物活性，是一种极具研究和开发价值的药材[1]。Xu 等发现了蛴螬的粗提物的抗凝活性，且其中的几种纤维蛋白（原）溶解剂具有抗血栓作用[2]；研究表明蛴螬的乙醇和石油醚提取物具有优异的抗真菌活性[3]。蛴螬在韩国还被用于治疗慢性肝硬化，Oh 等研究发现它可以降低肝细胞损伤的程度[4]。
随着越来越多的蛋白质水解物被发现具有抗氧化能力，新型抗氧化肽不断的被开发。抗氧化肽具有抗脂质过氧化能力和螯合金属离子的能力，还能够清除生物体内过量自由基。资源昆虫养殖的兴起，使昆虫抗氧化肽的研究也随之增多，采用双酶水解黄粉虫蛋白粉纯化得到的抗氧化多肽对羟基自由基和超氧阴离子自由基具有很强的清除作用，清除率可分别达到74.20%和87.32%[5-6]。研究表明大麦虫各蛋白组分均有体外抗氧化作用，随着浓度的增大，各蛋白液的总还原能力、对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除能力也随之增强[7-8]。研究发现碱性蛋白酶对蚕蛹蛋白具有较好的水解效果，其水解产物有较高抗氧化活性，对DPPH·、超氧阴离子自由基（O2-·）和羟基自由基（·OH）都具有较强的清除能力[9-10]。然而，蛴螬作为重要的昆虫资源之一，其蛋白水解物抗氧化作用的研究鲜见报道。
蛋白酶解产物的抗氧化性易受原料蛋白理化特性、选用酶的种类、水解程度等因素的影响。本研究以蛴螬为试验材料，以蛴螬多肽提取率及其抗氧化能力为衡量指标，通过单因素试验，从控制酶种类、酶虫比、底物浓度、水解体系pH值、酶解时间、酶解温度对蛴螬多肽提取率及其抗氧化能力的影响，最终确定蛴螬抗氧化多肽的适宜提取条件，并通过正交试验优化最佳酶解工艺。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
蛴螬：中国农业科学院河北廊坊基地，经鉴定为金龟科白星花金龟Protaetia brevitarsis 的幼虫；脂肪酶（≥3 000.0 U/g）、胰蛋白酶（≥50 000 U/g）、酸性蛋白酶（≥50 000 U/g）、中性蛋白酶（≥60 000 U/g）：沃凯化工科技有限公司；总抗氧化能力检测试剂盒、三吡啶基三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）：碧云天生物技术公司；LGJ-18 真空冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司；SHZ-B 水浴恒温振荡器：苏州威尔实验用品有限公司；Sigma 3K15 离心机：北京科普顺科技有限公司；新型T18 高速分散机：上海捷沪仪器仪表有限公司；FE-28 pH 计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Synergy H1 酶标仪：北京京科瑞达科技有限公司；KjeltecTM8400 凯氏定氮仪：福斯华（北京）科贸有限公司。Folin-酚试剂：北京索莱宝科技有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 工艺流程
取数只洗干净的蛴螬，放入100 ℃的开水中约40 s，立刻取出，将水擦干，放入-20 ℃冰箱内，保存至备用。准确称取10 g 蛴螬，按所需底物浓度加入溶液，用转速为8 000 r/min 高速分散机匀浆，得到虫浆液。加入所需要的酶，放在水浴恒温振荡器中，150 r/min，45 ℃酶解3 h。放在70 ℃的水浴恒温振荡器中灭活30 min，4 ℃静置过夜。4 000 r/min，4 ℃离心15 min，取上清，冷冻干燥后，用凯氏定氮法测量肽的含量。
1.2.2 酶的选择
酶解法制备抗氧化肽是利用酶把蛋白质的肽键断裂，产生肽段。如，酶解鹰嘴豆制备抗氧化肽[11]，酶解获得鱼肽[12]、酶解获得骨胶原蛋白肽[13]等。本研究在底物浓度5%、酶虫比0.6%，酶解3 h 的条件下，分别考察脂肪酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶对蛴螬多肽提取率及总抗氧化能力的影响，确定适宜的蛴螬蛋白水解酶种类。4种酶的酶解最佳条件见表1。
表1 4种酶酶解最佳条件
Table 1 Four enzyme digestion optimum conditions
酶种类 最适温度/℃ 最适pH值脂肪酶 55 6酸性蛋白酶 55 3中性蛋白酶 45 7胰蛋白酶 55 8
1.2.3 工艺参数的确定
根据筛选出的最优酶，以蛴螬多肽提取率及其总抗氧化能力为衡量指标，考察酶虫比、底物浓度、酶解时间、水解体系pH值和酶解温度对衡量指标的影响。
1.2.3.1 酶虫比的筛选
在55 ℃，酶解时间3 h，底物浓度5%，水解体系pH 5 条件下，酶虫比分别为0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%，测定各衡量指标。
1.2.3.2 底物浓度的筛选
在55 ℃，酶解时间3 h，酶虫比0.6 %，水解体系pH 5 的条件下，底物浓度分别为20%、10%、7%、5%、4%，测定各衡量指标。
1.2.3.3 水解体系pH值的筛选
在55 ℃，酶解时间3 h，酶虫比0.6%，底物浓度5%的条件下，水解体系pH值分别为4、5、6、7、8，测定各衡量指标。
1.2.3.4 酶解时间的筛选
在55 ℃，水解体系pH 5，酶虫比0.6%，底物浓度5%的条件下，酶解时间分别为1、2、3、4、5 h，测定各衡量指标。
1.2.3.5 酶解温度的筛选
在酶解时间3 h，酶虫比0.6%，底物浓度5%，水解体系pH 5 的条件下，酶解温度分别为35、40、45、50、55 ℃，测定各衡量指标。
1.2.3.6 最佳工艺条件的选择
在单因素试验的基础上，利用正交试验法，以底物浓度、水解体系pH值、酶解温度作为3 个考察因素，选取3 个水平进行试验。采用L9（33）正交表进行正交试验设计，来确定蛴螬多肽提取以及总抗氧化能力的最佳工艺条件。
1.2.4 蛴螬多肽含量的测定
蛴螬总蛋白含量的测定根据GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法检测，蛴螬水解液中多肽的含量测定依据Folin-酚法检测[14]。多肽提取率的计算公式为：
多肽提取率/%=蛴螬多肽含量/蛴螬总蛋白质量×100
1.2.5 总抗氧化能力的测定
根据总抗氧化能力试剂盒（FRAP 法）的方法测定。将酶解液稀释一定倍数后，4 000 r/min 离心15 min，依次加入5 μL 待测样品，150 μL TPTZ 稀释液、15 μL TPTZ 溶液和15 μL 检测缓冲液于96 孔板中，轻轻混匀。37 ℃孵育3 min～5 min 后，在593 nm 处用酶标仪读取各孔OD值。
2 结果与分析
2.1 酶种类对蛴螬多肽提取率及其抗氧化作用的影响
由于酶的酶切位点不同，酶解产物会有不同的生物活性。考察4种酶对蛴螬多肽提取率及抗氧化能力的影响，结果如图1 和图2所示。
图1 酶种类对蛴螬多肽提取率的影响
Fig.1 Effect of enzyme types on the extraction rate of Protaetia brevitarsis larva
脂肪酶酶解得到的蛴螬多肽提取率较高，可达到8.70%，同时，其具有较强的抗氧化能力，抗氧化能力为0.501 mmol/L。可见，脂肪酶是制备蛴螬抗氧化肽的较适合的酶。
2.2 酶虫比对蛴螬多肽提取率及其抗氧化作用的影响
酶虫比对蛴螬多肽提取率及其抗氧化作用的影响试验结果见图3、图4。
从图可知，其它条件不变，随着酶虫比的增大，蛴螬多肽得率稍有增加，在酶虫比为0.60%时，蛴螬多肽提取率可达到最大值10.79%；当酶虫比继续增大，蛴螬多肽提取率下降，这是因为酶添加量越大，酶与底物接触越充分，酶解越佳，但当添加到一定量后，酶与底物结合为饱和状态，继续添加酶效果不明显[15]；随着酶虫比的增大，测得鲜虫多肽抗氧化能力不一定增强，在酶虫比为0.60%时，测得鲜虫多肽抗氧化能力有最大值0.392 mmol/L，与最小值相差0.070 mmol/L，最终确定适宜的酶虫比为0.6%。
图2 酶种类对蛴螬多肽抗氧化能力的影响
Fig.2 Effect of enzyme types on antioxidant activity of Protaetia brevitarsis larva
图3 酶虫比对蛴螬多肽提取率的影响
Fig.3 Effect of enzyme-worm ratio on the extraction rate of Protaetia brevitarsis larva
图4 酶虫比对蛴螬多肽抗氧化能力的影响
Fig.4 Effect of enzyme-worm ratio on antioxidant activity of Protaetia brevitarsis larva
2.3 底物浓度对蛴螬多肽提取率及其抗氧化作用的影响
底物浓度对蛴螬多肽提取率及其抗氧化作用的影响试验结果见图5、图6。
图5 底物浓度对蛴螬多肽提取率的影响
Fig.5 Effect of substrate concentration on the extraction rate of Protaetia brevitarsis larva
图6 底物浓度对蛴螬多肽抗氧化能力的影响
Fig.6 Effect of substrate concentration on antioxidant activity of Protaetia brevitarsis larva
由图5、图6可知，其它条件不变，随着底物浓度的增大，测得鲜虫多肽得率稍有增加，在底物浓度为5%时有最大值10.18%，底物浓度继续升高，多肽得率下降，因为溶剂较少时，蛋白扩散阻力较大，溶出率小，随着溶剂用量的增加，蛋白更容易溶入溶剂中，提取率随之增加，当溶剂用量过大时，部分溶质会残留在水相中造成损失，而且不利于后续的减压浓缩[16]；随着底物浓度的增大，测得鲜虫多肽抗氧化能力增强，在底物浓度为5%时有最大值0.719 mmol/L，底物浓度继续升高，多肽抗氧化能力减弱，最终确定适宜的底物浓度为5%。
2.4 水解体系pH值对蛴螬多肽提取率及其抗氧化作用的影响
水解体系pH值对蛴螬多肽提取率及其抗氧化作用的影响试验结果见图7、图8。
由图7、图8可知，其它条件不变，水解体系pH值从4 到7 范围内，随着水解体系pH值的升高，蛴螬多肽提取率及其抗氧化能力逐渐提高，在水解体系pH值为7 时，蛴螬多肽提取率及其抗氧化能力均达到最大值，分别为11.9%和0.434 mmol/L；当水解体系pH值继续升高，蛴螬多肽提取率及其抗氧化能力反而下降。原因是中性条件下，两性的氨基酸呈阴离子状态而有利于氨基反应，而且在水解体系pH值为7 时，抗氧化能力最强，所以，选择7 作为的适宜的水解体系pH值。
图7 水解体系pH值对蛴螬多肽提取率的影响
Fig.7 Effect of hydrolysis system pH on the extraction rate of Protaetia brevitarsis larva
图8 水解体系pH值对蛴螬多肽抗氧化能力的影响
Fig.8 Effect of hydrolysis system pH on antioxidant activity of Protaetia brevitarsis larva
2.5 酶解时间对蛴螬多肽提取率及其抗氧化作用的影响
酶解时间对蛴螬多肽提取率及其抗氧化作用的影响试验结果见图9、图10。
图9 酶解时间对蛴螬多肽提取率的影响
Fig.9 Effect of enzymolysis time on the extraction rate of Protaetia brevitarsis larva
图10 酶解时间对蛴螬抗氧化能力的影响
Fig.10 Effect of enzymolysis time on antioxidant activity of Protaetia brevitarsis larva
由图9、图10可知，其它条件不变，随着酶解时间的增加，测得鲜虫多肽得率稍有升高，在酶解时间为3 h 时有最大值9.80%，酶解时间继续延长，多肽得率稍有下降，在各处理之间差异性不显著；随着酶解时间的增加，测得蛴螬多肽抗氧化能力稍有增强，在酶解时间为3 h 时有最大值0.373 mmol/L，酶解时间继续增加，多肽抗氧化能力减弱，原因是酶解产物会影响蛋白酶的催化反应速率，产物在反应初期的抑制能力较弱，反应时间越长，游离的小肽和氨基酸越多，产物的抑制能力就越强[17]，导致3 h 后多肽提取率以及抗氧化能力值下降。
2.6 酶解温度对蛴螬多肽提取率及其抗氧化作用的影响
酶解温度对蛴螬多肽提取率及其抗氧化作用的影响试验结果见图11、图12。
图11 酶解温度对蛴螬多肽提取率的影响
Fig.11 Effect of enzymatic temperature on the extraction rate of Protaetia brevitarsis larva
图12 酶解温度对蛴螬多肽抗氧化能力的影响
Fig.12 Effect of enzymatic temperature on antioxidant activity of Protaetia brevitarsis larva
由图11、图12可知，其它条件不变，随着酶解温度的升高，鲜虫多肽得率增加，在酶解温度为45 ℃时有最大值11.94%，温度继续升高，多肽率下降；随着酶解温度的升高，测得鲜虫多肽抗氧化能力增强，在酶解温度为45 ℃时有最大值0.625 mmol/L，酶解温度继续升高，多肽抗氧化能力减弱，原因是在45 ℃时，水解效果比较好，产生较多的相对分子量比较小具备高抗氧化活性的分子肽。因此，选择45 ℃为酶解适宜温度。
2.7 正交试验
根据单因素试验结果，选取影响蛴螬多肽以及总抗氧化能力效果各因素中有意义的水平做正交试验，对结果进行极差分析，以确定最佳的提取条件。底物浓度（A）、水解体系pH值（B）、酶解温度（C）对蛴螬多肽以及总抗氧化能力的影响较显著，因此，采用L9（33）正交表，以底物浓度（A）、水解体系pH值（B）、酶解温度（C）作为3 个考察因素，选取3 个水平进行试验。正交因素水平表见表2，酶法提取多肽工艺正交试验结果及方差分析见表3、表4。
表2 L9（33）正交试验因素水平表
Table 2 Factors and levels for L9（33）orthogonal array design
水平 因素A 底物浓度/% B 水解体系pH值 C 酶解温度/℃1 7 6 40 2 5 7 45 3 4 8 50
表3 酶法提取多肽工艺L9（33）正交试验设计及结果
Table 3 L9（33）orthogonal experiment design and results of enzymatic extraction of polypeptide
试验号 A B C 多肽提取率/%1 1 1 1 7.783 2 2 1 2 8.115 7.178 4 1 2 2 11.757 3 3 1 3 12.861 6 3 2 1 12.596 5 2 2 3 12.535 8 2 3 1 12.573 7 1 3 3 9 3 3 2 12.030 K1 32.074 23.075 32.952 K2 33.550 37.214 31.902 K3 31.804 37.139 32.574 k1 10.691 7.692 10.984 k2 11.183 12.405 10.634 k3 10.601 12.380 10.858 R 0.582 2 4.713 0.350
表4 方差分析结果
Table 4 Results of variance analysis
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值底物浓度 0.287 7 2 0.143 8 0.35 0.741 0水解体系pH值 34.033 8 2 17.016 9 41.34 0.023 6酶解温度 0.087 2 2 0.043 6 0.11 0.904 2误差 0.823 2 2 0.411 6合计 35.231 9 8
由表3和表4 的分析结果可以看出，RB＞RA＞RC，3个因素对蛴螬多肽提取率的影响顺序为：水解体系pH值（B）＞底物浓度（A）＞酶解温度（C）。3 个因素中，对蛴螬多肽提取率影响最大的因素是水解体系pH值。在试验设计范围内，优化得到酶法提取蛴螬多肽的最佳条件为A2B2C1，即底物浓度5%、水解体系pH 7、酶解温度40 ℃。
总抗氧化能力工艺正交试验结果及方差分析见表5、表6。
表5 总抗氧化能力工艺L9（33）正交试验设计及结果
Table 5 L9（33）orthogonal test design and results of total antioxidant capacity technology
试验号 A B C 总抗氧化能力/（mmol/L）1 1 1 1 0.257 2 2 1 2 0.160 3 3 1 3 0.157 4 1 2 2 0.398 5 2 2 3 0.593 6 3 2 1 0.251 7 1 3 3 0.399 8 2 3 1 0.554 9 3 3 2 0.273 K1 1.053 0.574 1.062 K2 1.206 1.242 0.830 K3 0.681 1.225 0.808 k1 0.351 0.191 0.354 k2 0.402 0.414 0.277 k3 0.227 0.408 0.269 R 0.175 0.223 0.085
表6 方差分析结果
Table 6 Results of variance analysis
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值底物浓度 0.066 1 2 0.033 1 3.17 0.239 7水解体系pH值 0.096 8 2 0.048 4 4.65 0.177 1酶解温度 0.018 0 2 0.009 0 0.86 0.536 5误差 0.020 8 2 0.010 4合计 0.201 7 8
由表5和表6 的分析结果可以看出，RB＞RA＞RC，3 个因素对蛴螬多肽总抗氧化能力的影响顺序为：水解体系pH值（B）＞底物浓度（A）＞酶解温度（C）。以由直观分析和方差分析得出，考察蛴螬多肽总抗氧化能力的最佳条件为A2B2C1，即底物浓度5 %、水解体系pH 7、酶解温度40 ℃。
2.8 验证试验
按A2B2C1 条件进行3 次平行试验，蛴螬多肽提取率以及总抗氧化能力的平均值分别为14.21 %和0.752 mmol/L，高于表3、表5 中每一项试验结果，故A2B2C1 为最佳提取工艺条件。
3 结论
本试验利用酶解法提取蛴螬多肽，探索其多肽的抗氧化活性。首先选出了最佳脂肪酶，再通过5 个单因素：酶虫比、酶解温度、酶解时间、底物浓度、水解体系pH值进行考察，得出蛴螬多肽的提取工艺以及抗氧化能力条件为：酶虫比为0.6%，酶解温度为45 ℃，酶解时间为3 h，底物浓度为5%，水解体系pH值为7。通过正交试验优化蛴螬多肽提取率及其总抗氧化能力，获得最佳酶解工艺，即底物浓度5%、水解体系pH 7、酶解温度40 ℃。在此提取条件下，蛴螬多肽提取率14.21%，总抗氧化能力为0.752 mmol/L。由本研究可知，蛴螬酶解液具有天然的抗氧化能力，在抗氧化食品、饲料和药品领域中据有一定的应用前景。
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