牡蛎是世界上第一大养殖贝类，富含各种优质蛋白、锌、硒、牛磺酸、不饱和脂肪酸等大量营养元素，具有“海洋牛奶”的美誉[1-2]。但现阶段牡蛎的加工方式多以鲜食、蚝干、罐头、蚝油等初加工为主，精深加工还未得到应有开发。血管紧张素转换酶（angiotensinconverting enzyme，ACE）具有将血管紧张素I 转化为有效的血管收缩剂血管紧张素II 并通过降解消除缓激肽的血管舒张作用的能力，是控制高血压的关键酶[3]，以牡蛎为原料制备ACE抑制肽虽然有了一定的研究[4-6]，但大多数研究没有考虑酶解液的腥味和风味问题，腥味使牡蛎及其他水产品的应用受到很大程度的限制，脱腥是水产品加工过程中亟待解决的重点和难点[7]。目前研究较多的脱腥方法主要有：活性炭吸附、酵母发酵、微胶囊包埋、调味剂掩盖、美拉德反应等。活性炭吸附效果虽好，但蛋白损失率很高；酵母发酵过程不易控制，容易发酵过度，且会引入酵母味道；微胶囊包埋的脱腥效果一般，包埋率不好评价；美拉德反应条件要求较高，不易实现[8-10]。
壳聚糖作为一种天然的大分子絮凝剂，因其无毒、用量少、絮凝效果好的优点在水处理、中草药和果汁澄清方面具有广泛应用[11]。张彤等[12]对80 种不同药材作了澄清试验，并对絮凝液与水煎液、醇沉液进行了比较，结果表明壳聚糖絮凝剂对大部分单味中药浸提液均有一定的澄清作用，能保留其中的大部分有效成分；王岸娜等[13]在用壳聚糖澄清猕猴桃果汁的研究发现，3 种不同脱乙酰度的壳聚糖组分都可以有效地澄清猕猴桃果汁。而把壳聚糖应用于水产品絮凝脱腥的研究鲜有报道。
本试验的研究重点即应用壳聚糖对牡蛎酶解液进行絮凝离心脱腥，得到透明无腥味的牡蛎多肽液，并对多肽分子量和ACE抑制活性进行研究和分析，为开发制备低分子量、高ACE抑制活性的脱腥牡蛎肽提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）冷冻全肉：威海荣成碌对岛集团；中性蛋白酶（20 万U/g）、木瓜蛋白酶（20 万U/g）：南宁庞博生物工程有限公司；菠萝蛋白酶（20 万U/g）：青岛佰仁生物科技有限公司；壳聚糖：国药集团化学试剂有限公司；蛋白分子量标准品[L-色氨酸L-tryptophan（204.23 Da）、谷胱甘肽氧化型glutathione oxidized form（612.63 Da）、杆菌肽bacitracin（1 422.69 Da）、牛胰岛素bovine insulin（5733.49 Da）]：北京索莱宝科技有限公司；ACE、马尿酰组胺酰亮氨酸（hippuryl-histidyl-leucine，HHL）、马 尿 酸（hippuric acid，HIP）标准品：美国Sigma 公司；其他试剂均为国药分析纯。
1.2 仪器与设备
HM-668T 匀浆机：广州黑马电器有限公司；恒温水浴摇床：苏州威尔实验用品有限公司；TDL-5-A 离心机：上海安亭科学仪器厂；FD-1A 冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；SKD-100 凯氏定氮仪：上海沛欧分析仪器有限公司；SuperdexTM 30 Increase 10/300 GL 凝胶色谱柱：美国GE 集团；Agilent 1260 高效液相色谱系统：美国Agilent 科技公司。
1.3 方法
1.3.1 牡蛎酶解工艺优化
因牡蛎本身含盐量很高，所以不考虑最适pH值为碱性的碱性蛋白酶、胰蛋白酶等，避免引入更多的NaCl 影响风味。
1.3.1.1 蛋白酶种类优化
冷冻全牡蛎肉自然解冻，用匀浆机匀浆（不额外添加水），调节pH 7.0，取15 g 牡蛎匀浆，控制总加酶量为1.0%（最适条件相同：50 ℃，pH7.0），各加入不同蛋白酶后，4 800 r/min 离心30 min 取清液，用凯氏定氮法测定清液和酶解液中的总氮含量，残渣烘干至恒重后称重，以蛋白质回收率和残渣干重为指标考察酶解效果。
1.3.1.2 加酶量优化
牡蛎匀浆分别加入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的中性蛋白酶（最适条件相同：50 ℃，pH7.0），酶解4 h，其他条件同1.3.1.1。
1.3.1.3 酶解时间优化
牡蛎匀浆加入0.6%的中性蛋白酶（最适条件相同：50 ℃，pH7.0），分别酶解1、2、3、4、5 h，其他条件同1.3.1.1。
1.3.2 壳聚糖脱腥
取3 g 壳聚糖溶于1%的冰乙酸溶液中，50 ℃水浴加热3 h 至壳聚糖完全溶胀，制成3.0%的壳聚糖溶液。取50 g 酶解液，添加酶解液质量1.0%的壳聚糖溶液，轻微搅拌均匀，静置20 min，4 800 r/min 离心不同时间，比较添加壳聚糖离心前后残渣干重的区别，同时探究不同离心时间对壳聚糖脱腥效果及清液中固形物和蛋白质保留率的影响。脂肪含量通过氯仿甲醇法测定。
1.3.3 多肽性质分析
1.3.3.1 多肽分子量测定
样品经反相-高效液相色谱系统（reversed-phased high performance liquid chromatography，RP-HPLC）通过凝胶过滤柱分离，色谱条件如下：色谱柱：SuperdexTM 30 Increase 10/300 GL；流动相：10 mmol/L Tris-HCl 缓/+9 冲液（pH7.4，含150 mmol/L NaCl）；柱温：25 ℃；检测方法：紫外215 nm；流速：0.7 mL/min。标准品：（1）L-色氨酸L-tryptophan（M=204.23 Da）（2）谷胱甘肽氧化型glutathione oxidized form（M=612.63 Da）（3） 杆菌肽bacitracin（M=1 422.69 Da）（4）牛胰岛素bovine insulin（M=5 733.49 Da）。
1.3.3.2 ACE抑制活性研究
测定方法采用更为精密准确的HPLC 法，具体方法在赵元晖[14]的检测方法的基础上稍作修改。将样品的蛋白质浓度稀释至一定浓度，取20 μL 样品，加入10 μL ACE溶液（0.1U/mL），在37℃下保温10 min 后加入10 μL HHL（5 mmol/L）溶液开始反应，37 ℃反应60 min后加入100 μL 1.0 mol/L HCl 中止反应，得到反应液。同时用20 μL 羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N′-a-hydroxythylpiperaxine-N′-etharesulfanic acid，HEPES）缓冲液替代酶解液来制备反应液，作为空白对照组。
反应液经过0.22 μm 滤膜过滤后用Zorbax SB-Aq C18 分析柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）进行马尿酸峰面积的检测，条件为柱温25 ℃，流动相是乙腈/超纯水（体积比为1 ∶1，其中水含0.1%三氟乙酸），流速0.4 mL/min，检测波长228 nm，进样量20 μL。IC50值定义为使马尿酸峰面积减少50%的抑制剂浓度。
ACE抑制率/%=（1-样品的马尿酸峰面积/空白的马尿酸峰面积）×100
2 结果与分析
2.1 牡蛎酶解工艺优化
2.1.1 蛋白酶种类优化
蛋白酶种类对酶解效果的影响见图1。
图1 蛋白酶种类对酶解效果的影响
Fig.1 Effect of protease types on enzymatic hydrolysis
A.1.0%中性蛋白酶；B.1.0%木瓜蛋白酶；C.0.5%中性蛋白酶与0.5%木瓜蛋白酶复合酶解；D.0.5%中性蛋白酶与0.5%菠萝蛋白酶复合酶解。
由图1可以看出，中性蛋白酶单酶酶解的酶解效果最好，蛋白质回收率最高达85.0%，15 g 牡蛎匀浆得0.617 g 残渣，两种复合酶解方案结果与中性蛋白酶单酶酶解效果相差不大，木瓜蛋白酶效果最差，最终决定以中性蛋白酶单酶酶解。
2.1.2 加酶量优化
加酶量对酶解效果的影响见图2。
图2 加酶量对酶解效果的影响
Fig.2 Effect of addition volume of protease on enzymatic hydrolysis
由图2可以看出，随着加酶量的增加，蛋白质回收率呈逐渐增大，残渣干重呈逐渐减小的趋势，当加酶量为0.6%时，二者趋于平稳，蛋白回收率为80.4%，残渣干重为0.621 g，酶解基本充分，因此选择中性蛋白酶加酶量为0.6%。
2.1.3 酶解时间优化
酶解时间对酶解效果的影响见图3。
图3 酶解时间对酶解效果的影响
Fig.3 Effect of time on enzymatic hydrolysis
由图3可以看出，随着酶解时间的增加，蛋白质回收率呈逐渐增大，残渣干重呈逐渐减小的趋势，酶解3 h 与4 h 的蛋白质回收率无明显差别，酶解3 h 的蛋白质回收率为82.0%，残渣干重为0.545 g，酶解基本充分，因此选择酶解时间为3 h。综上所述，牡蛎酶解最佳工艺条件为：0.6%中性蛋白酶在pH7.0 50 ℃条件下酶解3 h。
2.2 壳聚糖脱腥
添加和不添加壳聚糖杂质和脂肪去除效果的比较见表1。
壳聚糖（chitosan，（1，4）-2-胺基-2-脱氧-β-D-葡聚糖）是由甲壳素（chitin，（1，4）-2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-葡聚糖）经脱乙酰化反应得到的一种生物高分子，壳聚糖线性分子链上具有游离氨基，其氮原子上还有一对未结合电子，使其呈现弱碱性，能从溶液中结合一个氢原子，从而使壳聚糖成为带阳电荷的聚电解质，与酶解液中所含的大量带负电荷的悬浮物相互作用，使酶解液中的悬浮物缠绕于具有线性分子结构的壳聚糖分子中，使微小颗粒变为大颗粒而沉降[13]，从而展示出优异的絮凝作用。壳聚糖作为絮凝剂有无毒、用量少的优点，本身还具有免疫调节、防癌、调节肠道菌群、排除体内有毒有害物质等功能活性，美国环保局已批准壳聚糖作为饮用水的净化剂，其在食品添加中的安全性有所保障[15]。
表1 添加和不添加壳聚糖杂质和脂肪去除效果的比较
Table 1 Comparison of impurity substance and fat removal effects adding chitosan or not
注：表中反映了添加和不添加壳聚糖时，不同离心时间时，固形物在各相中的百分比分布；a 为脂肪在各相中的分布百分比；b 为脂肪占本相干重的百分比；-表示不存在该相。
固形物百分比/%脂肪百分比/%絮凝条件 油状漂浮物 絮状漂浮物 清液 残渣 油状漂浮物 絮状漂浮物 清液 残渣不添加壳聚糖离心15 s 6.3 93.7--28.7(a)；49.1(b) 71.3；26.6--离心60 s 7.5 92.5--39.5；50.6 60.5；22.8--离心15 min 5.4-82 5.4 76.9；51.7-13.6；4.9 9.5；28.9添加壳聚糖离心15 s--81.8 18.2--7.6；4.1 92.4；48.8离心60 s--81.4 18.6--6.8；4.1 93.2；49.8离心15 min--80.5 19.5--6.7；3.8 93.3；54.9
牡蛎的腥味物质一般是脂溶性的醛类、酮类物质[12]，试验研究发现，内脏团及油脂是腥味主要来源，所以重点针对这些脱除。在不添加壳聚糖情况下（如表1所示），酶解液用4 800 r/min 离心15 s 或60 s 后，清液和残渣不能明显地分离开，大部分是浑浊的絮状漂浮物，小部分是上层的油状漂浮物，没有残渣。4 800 r/min 离心15 min 时，溶液可分为3 层——上层油状漂浮物（固形物5.4%）、中层清液和下层内脏团残渣相（固形物5.4%），76.9%的脂肪分布在上层油相漂浮物中，28.9%的脂肪分布在下层残渣中。但直接离心后，三相的分离去除操作困难，中间层的清液难以单独分离出来。对三相进行感官评价发现，清液几乎没有腥味，而油相和残渣相的腥味强烈，而该现象在以往的报道中鲜有提及。因此本研究希望通过壳聚糖絮凝，将上层油状漂浮物转移至残渣相，再配合离心将酶解液分为残渣和清液两相，从而轻易地将清液分离出来，达到良好的脱腥脱脂和去除杂质的效果。
向酶解液中添加其质量1.0%的壳聚糖溶液（用乙酸溶液溶解制成3%的壳聚糖溶液），静置离心。由表1可以看出，添加壳聚糖后离心15 s，即可达到很好的絮凝效果，酶解液分为清液和残渣两相，没有油状漂浮物和絮状漂浮物，二者全部被絮凝至残渣相，其中包括酶解液92.4%的脂肪也转移至残渣相，18.2%的干重杂质全部转移至残渣中，81.8%的固形物全都转移至清液，并且可以轻易去除残渣、保留清液。而在残渣干重中，48.8%的成分是油脂，还有部分蛋白质、糖类等。增加离心时间至60 s、15 min，絮凝效果相差不大，脱腥效果和脂肪去除率基本没有差别。因此4 800 r/min离心15 s，即可达到预想效果，想较于不添加壳聚糖直接离心，大大缩短了离心时间，并且达到了很好的脱腥脱脂和去除杂质的效果。添加壳聚糖前后清液的成分分析见表2。
表2 添加壳聚糖前后清液的成分分析
Table 2 Component analysis before and after adding chitosan in clear liquid
注：脂肪清除率/%=（1-清液中脂肪含量/酶解液中脂肪含量）×100；蛋白回收率/%=清液中蛋白含量/酶解液中蛋白含量×100
絮凝条件 残渣固形物占比/% 固形物回收率/% 蛋白回收率/% 脂肪清除率/%不加壳聚糖离心15 min 5.4 82.0 80.4 86.4添加壳聚糖离心15 s 18.2 80.5 79.5 92.4
由表2可以看出，不加壳聚糖离心15 min 和添加壳聚糖离心15 s 相比较，后者的固形物回收率和蛋白质回收率稍有降低，但可以忽略不计；前者的残渣干重占5.4%，后者达到18.2%，当残渣聚合在一起时可以更轻易去除；前者的脂肪清除率虽然可以达到86.4%，但是清液不易分离，后者可达92.4%且易离心分离。
壳聚糖作为一种天然的絮凝剂，目前在水处理、中草药和果汁澄清方面具有广泛应用，但用于水产制品的絮凝、脱腥还鲜有报道。本试验的研究重点是通过添加壳聚糖絮凝离心，在保证蛋白质和固形物损失率很低的前提下，解决了酶解液直接离心清液不易分离的问题，同时也将杂质和漂浮物中的油脂去除，这不仅去除了脂溶性的腥味物质，同时降低了脂质氧化的风险，提高了产品的稳定性。分离后的清液经喷干或冻干得到的牡蛎多肽粉，可迅速溶于水，水溶液清澈透明，为淡黄色液体，无腥味，无沉淀析出，入口清爽鲜香。
2.3 多肽性质分析
2.3.1 多肽分子量测定
多肽分子量的SuperdexTM 30 Increase 10/300 GL色谱图见图4。
由图4可以看出，牡蛎多肽各组分基本可以完全分离开，标准曲线线性关系良好，牡蛎多肽的分子量都在5 000 Da 以下，其中1 000 Da 以下的组分占93.1%，500 Da 以下的组分约占49.7 %，多为二肽或三肽。Oshima 等[16]最早报道食品蛋白源ACE抑制肽是由细菌胶原酶降解明胶获得的6 条活性肽，并证实抑制ACE 活性的肽分子质量主要集中在1 500 Da 以下。王桂春等[17]通过分布酶解酪蛋白制备小分子ACE抑制肽，两次酶解的产物分子量集中在1 000 Da 以下，这与本研究的结果相似。有研究发现二肽或者三肽由于能够抵抗胃肠道肽酶的作用，直接被吸收，从而能有效的发挥降血压作用。牡蛎蛋白经过中性蛋白酶酶解之后，分子质量大大减小，这为之后研究小分子肽的ACE抑制作用提供了一定的基础。
2.3.2 ACE抑制活性分析
Zorbax SB-Aq C18 分析样品的ACE抑制活性见图5。
图4 多肽分子量的SuperdexTM 30 Increase 10/300 GL 色谱图
Fig.4 The chromatography of oyster peptide by SuperdexTM 30 Increase 10/300 GL
流动相：10 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH7.4，含150mmol/L NaCl）；柱温：25℃；检测方法：紫外215nm；流速：0.7 mL/min。标准品：L-色氨酸（M=204.23 Da）、谷胱甘肽氧化型（M=612.63Da）、杆菌肽（M=1422.69Da）、牛胰岛素（M=5 733.49 Da）。
图5 Zorbax SB-Aq C18 分析样品的ACE抑制活性
Fig.5 The chromatogram of ACE inhibitory activity of sample by Zorbax SB-Aq C18
对于ACE抑制活性的测定方法，相较于用乙酸乙酯萃取马尿酸后测定吸光值的方法来说，HPLC 结果更为准确、误差更小，而选择合适的柱子和方法将HHL 与HIP 完全分离开是关键。本试验方法在赵元晖[14]研究的基础上，减少HHL 的用量，从而减少图谱中HHL 的峰高，更好地凸显产物HIP 的峰形，减少HIP的峰面积误差，并且整个体系用量减少一倍，从而降低了检测成本。由图5可以看出，经改进后的方法可以将HHL 和HIP 完全分离开，空白组中HHL 的洗脱时间为5.454 min，HIP 洗脱时间为6.160 min，样品中HHL的洗脱时间为5.469 min，HIP 洗脱时间为6.166 min，样品浓度为2 mg/mL 时，ACE抑制率达79.13%。不同浓度牡蛎肽的ACE抑制活性见图6。
图6 不同浓度牡蛎肽的ACE抑制活性
Fig.6 The ACE inhibitory activity of different concentration oyster peptide
图6表示了不同浓度样品的ACE抑制活性，经计算样品的IC50 为0.475 mg/mL。于娅等[18]采用酶解方法制备的牡蛎功能短肽，0.4 mg/mL 对ACE抑制率为51.4%。邱娟等[19]采用复合蛋白酶和碱性蛋白酶对牡蛎进行分步酶解，得到牡蛎多肽的ACE抑制活性IC50 为0.8 mg/mL。欧成坤等[20]经酸性蛋白酶得到的水解度为16%的酶解产物，蛋白质浓度为1 mg/mL 时，对ACE的抑制率为71.7%。Bordenave 等[21]检测了太平洋牡蛎酶解产物的ACE抑制活性，水解物对ACE的IC50 为72mg/L。赵元晖[14]酶解海地瓜经超滤分离后得到的ACE抑制肽，其IC50 为0.62 mg/mL。与现有文献报道，本研究得到的牡蛎ACE抑制肽的活性处于中等偏上水平。但因检测方法和蛋白浓度测定方法的不同，各个结果都有一定误差，改进后的方法重现性和适用性良好，分析时间短，灵敏度和准确性高。
3 结论
本研究优选中性蛋白酶对牡蛎进行酶解，优化了酶解条件：用0.6%中性蛋白酶在pH7.0、50 ℃条件下酶解3 h，加酶量少，酶解时间短，工艺简单。创新点在于应用壳聚糖对优化后的牡蛎酶解液进行絮凝离心脱腥，填补了壳聚糖对水产制品絮凝脱腥的空白，4800r/min离心15 s 即可达到显著的脱腥效果，固形物保留率80.5%，蛋白质保留率79.5%，脂肪清除率达92.4%，在保证蛋白质和固形物损失率很低的前提下，解决了酶解液直接离心清液不易分离的问题，同时也将漂浮物中的油脂去除，这不仅去除了脂溶性的腥味物质，同时降低了脂质氧化的风险，提高了产品的稳定性。在得到透明无腥味的牡蛎多肽后，对多肽分子量进行分析，1 000Da 以下的占93.1%，500 Da 以下的约占49.7%，对牡蛎多肽的ACE抑制活性进行研究，IC50 为0.475mg/mL，活性处于中等水平。研究为制备低分子量、较高ACE抑制活性的脱腥牡蛎肽提供了理论支持。不足之处在于还需要对不同脱乙酰度和不同分子量的壳聚糖絮凝脱腥情况作进一步的深入研究。
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