茶起源于中国，是世界上仅次于水的第二大饮品，其发挥的益处被广泛熟知，深受人们的喜爱。茶多酚是茶叶或茶饮料中的重要活性成分，是茶叶中酚类及其衍生物的总称，茶多酚主要包括黄烷醇类（儿茶素类）、花色苷类、黄酮及黄酮醇类、酚酸及缩酚酸类等化合物。根据不同的制造工艺，茶可分为未发酵茶（绿茶）、半发酵茶（乌龙茶）、全发酵茶（红茶）和后发酵（黑茶）[1]。总体上全球绿茶年产量约为20%，乌龙茶约为2%，红茶约为78%[2]。茶叶中的茶多酚主要是儿茶素类，包括（-）-表儿茶素[（-）-epicatechin，EC]、（-）-表没食子儿茶素没食子酸酯[（-）-epigallocatechin gallate，EGCG]、（-）-表没食子儿茶素[（-）-epigallocatechin，EGC]和（-）-表儿茶素没食子酸酯[（-）-epicatechin gallate，ECG]和少量的其他儿茶素。不同茶叶的儿茶素组成和数量不同，一般来说，绿茶含有高水平的儿茶素单体，占所有酚类化合物的80%～90%，然而在发酵之后，红茶中的儿茶素单体含量仅占20%～30%，儿茶素聚合物即茶黄素和茶红素占红茶的60%～70%[3-4]。乌龙茶中单体和多聚体形式的儿茶素含量处于红茶和绿茶之间。随着国内外研究人员对茶多酚研究的不断深入，已发现茶多酚具有多种生物活性作用，包括抗辐射、抗炎症和抑菌等特性，在预防神经退行性疾病、代谢性疾病和癌症等方面也具有潜在的作用[5]，而抗氧化能力是茶多酚发挥多种功效的核心。
茶多酚是重要的天然抗氧化剂，本文以4种茶叶为原料，比较4种茶叶水提物的抗氧化性及与总酚、儿茶素含量的相关性，并对比分析不同浓度下茶多酚与VC 的抗氧化能力，为茶多酚的开发利用提供体外试验参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
高效液相色谱标准品：没食子酸（gallic acid，GA）、（+）-儿茶素[（+）-catechin，C]、EC、EGC、EGCG、ECG、（-）-没食子儿茶素[（-）-gallocatechin，GC]、（-）-儿茶素没食子酸酯[（-）-catechin gallate CG]、（-）-没食子儿茶素没食子酸酯[（-）-gallocatechin gallate，GCG]、茶多酚：维克奇生物科技有限公司；Vc：德国DRE 公司；DPPH、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2-azino-bis （3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；总抗氧化能力（T-AOC）检测试剂盒、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer，PBS）：北京索莱宝科技有限公司。以上试剂均为分析纯。
红茶：云南大叶种；乌龙茶：福建大白毫；绿茶：浙江武阳早；茉莉茶：广西大叶种。
1.2 仪器与设备
紫外可见分光光度计（UV-1800）、高效液相色谱仪器（LC-20A）：日本岛津仪器公司；酶标仪（Varioskan LUX）：赛默飞世尔科技有限公司；数显磁力搅拌水浴锅（HH-6SC）：常州普天仪器制造有限公司；高速离心机（Allegra 64R）：贝克曼库尔特公司。
1.3 方法
1.3.1 茶叶水提物的制备
取适量红茶、乌龙茶、绿茶以及茉莉花茶，用粉碎机研磨成粉末，分别取0.5 g 固体茶叶粉末于50 mL 离心管中，再以1 ∶50（g/mL）的料液比倒入煮沸后的双蒸水，每一个样品设立3 个平行，然后将离心管统一放入恒温水浴锅中，提取温度为85 ℃，提取时间为10 min，在此过程中用锡箔纸包住以避光，并加以恒定转速磁力搅拌，以进行充分提取。提取完之后将离心管取出，冷却至室温，之后以5 000 r/min 转速4 ℃离心10 min，将上清液即茶叶水提物分装，分别置于4 ℃及-20 ℃，密封避光保存，便于进行之后的分析。
1.3.2 茶叶水提物中总酚含量的测定
参考GB/T 8313-2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》，采用福林酚（Folin-Ciocalteu）试剂比色法测定茶叶中茶多酚的总量，在765 nm 波长条件下用分光光度计测定吸光值A，结果表示为每毫升样品提取物中没食子酸微克数[6]。
1.3.3 茶叶水提物中儿茶素含量的测定
儿茶素含量采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC） 分 析， 使 用Agilent ZORBAX SB-AQ 色谱柱，流动相A 为水，流动相B 为乙腈，流动相A 与B 都加入终浓度为0.2%乙酸作为稳定剂，柱温：35 ℃，检测波长：270 nm，流速：1 mL/min，进样量为20 μL，洗脱梯度为：10 min～15 min：3%B～10%B；15 min～20 min：10%B～20%B；20 min～25 min：20%B～25%B；25 min～30 min：25%B～30%B；30 min～35 min：30%B～35%B；35 min～40 min：35%B～3 %B；40 min～45 min：3%B，检测茶叶中GA、C、EC、EGC、EGCG、ECG、GC、CG 以及GCG 的含量，制作9 个单体的标准曲线。
1.3.4 抗氧化能力测试
分别准确称量50mg 茶多酚与VC，配制成1.0mg/mL的母液，然后稀释为终浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL的溶液，进行抗氧化能力比较，同时对4种茶叶水提物的抗氧化能力进行测试。
1.3.4.1 ABTS+·清除能力测定
ABTS 在适当的氧化剂作用下氧化成绿色的ABTS+·，在抗氧化物存在时，ABTS+·的产生会被抑制，在734 nm 测定吸光度即可测定并计算出样品的总抗氧化能力。配制终浓度为7 mmol/L ABTS 和2.45 mmol/L过硫酸钾的混合液，室温避光条件下静置过夜12 h，制得ABTS+·储存液，使用时用PBS 稀释至734 nm 处吸光度为0.70±0.05 的溶液，取0.1 mL 的样品与3.9 mL 稀释过的ABTS+·溶液在避光下反应5 min，用双蒸水作对照，在734 nm 处测吸光值A [7]。
ABTS+·清除率/%=（1-A样品/A 对照）×100
1.3.4.2 DPPH 自由基清除能力
DPPH 自由基在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其醇溶液呈紫色，且需低温避光储藏，具有单一电子，故能接受一个电子或氢离子，在波长为517 nm 下具有最大吸收。有自由基清除剂存在时，DPPH 自由基的单电子被捕捉而使其颜色变浅，在最大光吸收波长处的吸光值下降。用无水乙醇配制浓度为0.2 mmol/L的DPPH 溶液，取2 mL 不同浓度的样品与2 mL DPPH溶液混合均匀后，室温避光下反应30 min，在517 nm处测吸光值A[8]。
DPPH 自由基清除率/%=[1-（A样品-/A空白）A对照]×100
1.3.4.3 FRAP 法测定总抗氧化能力
按照T-AOC 试剂盒说明书进行检测，在酸性环境下，还原Fe3+-三吡啶三吖嗪（Fe3+-TPTZ）产生蓝色的Fe2+-TPTZ 的能力反映了总抗氧化能力，先配制不同浓度的Fe2+-TPTZ 溶液，在λ 为593 nm 处测吸光值A，制作标准曲线，样品的抗氧化能力以达到同样吸光度变化值（△A）所需的标准液离子浓度表示。
2 结果与分析
2.1 茶叶水提物总酚含量及儿茶素含量
4种茶叶水提物总酚含量见表1。
表1 4种茶叶水提物总酚含量
Table 1 Total polyphenol contents of four kinds of tea water extracts
注：同一列不同字母表示显著性差异（P<0.05，n=3）。
茶叶水提物 总酚含量(μg GAE/mL)红茶水提物 2 323.1±31.83d乌龙茶水提物 2 801.65±54.53a绿茶水提物 2 488.12±9.9c茉莉花茶水提物 2 712.54±58.01b
根据表1可以看出，4种茶叶水提物中乌龙茶所含的总酚含量最高，其次是茉莉花茶、绿茶，最后是红茶。各类茶叶水提物总酚含量及各组分含量不同主要与其加工方式有关，本试验样品分别属于不发酵茶，半发酵茶及发酵茶，绿茶和茉莉花茶属于不发酵茶，乌龙茶属于半发酵茶，红茶属于发酵茶，除了红茶外，另外3 种茶在加工过程中都要经过杀青步骤，这一步通过高温使得多酚氧化酶失活，因此总酚含量比较高，而红茶则未经杀青，经过萎凋，再揉捻或揉切、发酵等步骤，不断氧化聚合，形成茶黄素或茶红素等酚类氧化聚合物，因此酚类含量较低[9]。
4种茶叶水提物儿茶素含量见图1。
图1 4种茶叶水提物儿茶素含量
Fig.1 Catechin content of four kinds of tea water extracts
由图1可以计算出儿茶素总量由高到低依次为茉莉花茶（2 396.472 μg/mL）、乌龙茶（2 386.404 μg/mL）、绿茶（2 235.539 μg/mL）及红茶（867.901 μg/mL），与总酚含量趋势基本一致。在各个儿茶素单体中，EGCG 含量最高，4种茶叶所含的EGCG 含量大小为茉莉花茶＞绿茶＞乌龙茶＞红茶，而含有GA 的顺序为红茶＞乌龙茶＞绿茶＞茉莉花茶。红茶中的没食子酸含量略高，可能是制作过程中酚类物质降解造成的，另外不同产地、不同季节采摘等因素都会对其品质有所影响。
2.2 4种茶叶水提物抗氧化能力及相关性分析
本试验采用3 种常见的抗氧化能力测试方法对4种茶叶水提物的体外抗氧化能力进行评估，其结果如表2所示。
表2 4种茶叶水提物抗氧化能力
Table 2 Antioxidant capacity of four kinds of tea water extracts
注：同一列不同字母表示显著性差异（P＜0.05）。
茶叶水提物抗氧化能力ABTS+·清除率/% DPPH·清除率/% FRAP/（μmol/mL）红茶 84.32±0.01a 89.09±0.01d 0.455 2±0.045 1b乌龙茶 83.26±0.27b 93.90±0.14a 0.870 5±0.119 9a绿茶 83.40±0.01b 92.50±0.14c 0.879 0±0.026 6a茉莉花茶 83.26±0.27b 93.03±0.07b 0.822 6±0.001 2a
整体上不发酵或半发酵茶的抗氧化能力高于发酵茶的抗氧化能力，在ABTS 法测抗氧化活性试验中，红茶ABTS+·清除能力较高，为84.32%，而乌龙茶、绿茶、茉莉花茶的ABTS+·清除率无显著性差异（P ＞0.05），分别为83.26%、83.40%、83.26%；在DPPH 法测抗氧化活性试验中，乌龙茶的DPPH·清除率达到93.90%，茉莉花茶和绿茶次之，分别为93.03%、92.50%，红茶DPPH·清除率较低为89.09 %，4种茶叶的DPPH·清除能力具有显著性差异（P＜0.05）；FRAP 法测抗氧化活性试验结果，以达到同样吸光度变化值的Fe2+浓度表示，4种茶叶水提物的抗氧化能力顺序依次为绿茶（0.879 0 μmol/mL）＞乌龙茶（0.870 5 μmol/mL）＞茉莉花茶（0.822 6 μmol/mL）＞红茶（0.455 2 μmol/mL），且绿茶、乌龙茶及茉莉花茶并无显著性差异（P ＞0.05）。
将抗氧化能力测试结果与总酚含量（total phenolics，TP）或各个儿茶素单体含量进行相关性分析，结果如表3所示。
表3 总酚及儿茶素单体含量与不同抗氧化能力测试的相关性分析
Table 3 Correlation coefficients amongst TP，catechins and the antioxidant capacities determined by different types of assays
注：*表示差异显著（P ＜0.05）；**表示显著性极差异（P ＜0.01）。
项目 TP GA GC EGC C EC EGCG GCG ECG CG 儿茶素总量ABTS-0.801** 0.859**-0.907**-0.911**-0.498 0.434-0.927** 0.553-0.804** 0.776**-0.931**DPPH 0.891**-0.71 0.971** 0.967** 0.471-0.434 0.907**-0.558 0.877**-0.787* 0.969**FRAP 0.656-0.907** 0.948** 0.942** 0.191-0.713* 0.950**-0.777* 0.967**-0.917** 0.954**
ABTS 法抗氧化能力值与总酚含量（r=-0.801）、GC（r=-0.907）、EGC（r=-0.911）、EGCG（r=-0.927）、ECG（r=-0.804）显示极强负相关，而与GA（r=0.859）、CG（r=0.776）含量呈现极强正相关；而DPPH 法抗氧化测试值与总酚含量（total phenolics，TP）（r=0.891）、GC（r=0.971）、EGC（r=0.967）、EGCG（r=0.907）、ECG（r=0.877）显示极强的正相关，与CG（r=-0.787）显示强负相关；FRAP 法测定的抗氧化能力结果与GC（r=0.948）、EGC（r=0.942）、EGCG（r=0.950）、ECG（r=0.967）含量呈极强正相关，与EC（r=-0.713）、GCG（r=-0.777）呈强负相关。其中总酚含量与DPPH 自由基清除能力以及FRAP 与EGCG 含量的正相关关系，也在LvHP等的研究中有所报道[10]，值得注意的是，ABTS 与EGCG含量呈现极强负相关，与Wu Z 等报道的结论[11]正好相反，儿茶素总量与DPPH 与FRAP 法呈现极强正相关，与高玉萍等结果一致[12]，但是与ABTS 法呈现极强负相关。不同的儿茶素结构不同，对不同自由基反应不同，这可能是影响不同茶叶水提物抗氧化能力高低的主要原因，另外茶叶水提物含有的除了儿茶素之外的其他物质也会不同程度地影响其抗氧化能力，具体的原因有待进一步研究分析。
2.3 茶多酚与VC的抗氧化能力比较
本试验采用3 种抗氧化能力测试法对茶饮料中VC 和茶多酚常见浓度水平（0～1 mg/mL）进行比较，得到的结果如图2、图3、图4所示。
图2 茶多酚与VC对ABTS+·清除率的比较
Fig.2 Comparations of ABTS cation radical scavenging capacity of tea polyphenols and VC
总体上同浓度的茶多酚抗氧化能力高于VC，在ABTS 法比较抗氧化能力试验中，在低浓度即0～0.4mg/mL范围内，茶多酚抗氧化活性高于VC，而0.4mg/mL～1mg/mL浓度范围内，二者抗氧化活性均保持较高水平，无显著性差异；DPPH 法比较抗氧化能力试验中，在所测试的范围内，茶多酚与VC 的抗氧化能力处于较高水平，其中茶多酚DPPH·清除值略低于VC，可能由于茶多酚本身为淡黄色，造成一定的背景干扰有关；在FRAP 法测茶多酚与VC 的抗氧化能力试验中，茶多酚和VC 的抗氧化能力均随浓度的增大而增加，且茶多酚的FRAP值始终高于VC。
图3 茶多酚与VC对DPPH 自由基清除率的比较
Fig.3 Comparations of DPPH radical scavenging capacity of tea polyphenols and VC
图4 茶多酚与VC对铁离子还原抗氧化能力的比较
Fig.4 Comparations of ferric reducing antioxidant potential（FRAP）of tea polyphenols and VC
3 结论
本试验结果表明，不同的茶叶水提物均有很强的体外抗氧化活性，且对不同的抗氧化能力测试方法中的自由基或离子反应不同，因此在对某一活性物质进行抗氧化能力评价时，要综合多种方法。总体上，不发酵茶及半发酵茶的抗氧化能力高于发酵茶，绿茶、茉莉花茶、乌龙茶的DPPH 法及FRAP 法抗氧化活性测试结果优于红茶，4种茶叶的ABTS 法抗氧化活性测试结果均处于较高水平，且红茶的ABTS+·清除率略高于其他3 种茶。ABTS 法抗氧化能力值与总酚含量、GC、EGC、EGCG、ECG 显示极强负相关，而与GA、CG 含量呈现极强正相关；而DPPH 法抗氧化测试值与TP、GC、EGC、EGCG、ECG 显示极强的正相关，与CG 显示强负相关；FRAP 法测定的抗氧化能力结果与GC、EGC、EGCG、ECG 含量呈极强正相关，与EC、GCG 呈强负相关，另外儿茶素总量与DPPH 与FRAP 法呈现极强正相关，证明茶叶水提物中的儿茶素在这两种抗氧化活性测试中发挥重要作用，相反儿茶素总量与ABTS 法呈现极强负相关，茶叶水提物成分复杂，多酚类物质除儿茶素之外，还有槲皮素、山柰酚等，并且水提物中还有茶多糖、茶氨酸等物质，影响其抗氧化能力。
VC 因其抗氧化性而广泛应用于食品加工制作中，本试验将茶多酚与VC 的抗氧化能力进行比较，结果发现同浓度的茶多酚抗氧化能力高于VC，在ABTS 法比较抗氧化能力试验中，在低浓度即0～0.4 mg/mL 范围内，茶多酚抗氧化活性高于VC，而0.4 mg/mL～1 mg/mL浓度范围内，二者抗氧化活性均保持较高水平，在DPPH法比较抗氧化能力试验中，茶多酚与VC 的抗氧化能力处于较高水平；在FRAP 法测茶多酚与VC 的抗氧化能力试验中，茶多酚和VC 的抗氧化能力均随浓度的增大而增加，且茶多酚的FRAP 值始终高于VC。表明茶多酚具有良好的抗氧化性能，为茶多酚作为抗氧化剂应用到食品加工中提供了一定的依据。
[1]Cheng M，Zhang X，Guo X，et al.The interaction effect and mechanism between tea polyphenols and intestinal microbiota：Role in human health[J].Journal of Food Biochemistry，2017，41(6)：e12415
[2]Jilani H，Cilla A，Barberá R，et al. Biosorption of green and black tea polyphenols into Saccharomyces cerevisiae improves their bioaccessibility[J].Journal of Functional Foods，2015，17：11-21
[3]Heber D，Zhang Y，Yang J，et al. Green tea，black tea，and oolong tea polyphenols reduce visceral fat and inflammation in mice fed highfat，high-sucrose obesogenic diets[J]. Journal of Nutrition，2014，144(9)：1385-1393
[4]Van D J，Vaughan E E，Van D F，et al. Interactions of black tea polyphenols with human gut microbiota：implications for gut and cardiovascular health[J]. American Journal of Clinical Nutrition，2013，98(6)：1631S
[5]Yang C S，Wang H，Sheridan Z P. Studies on prevention of obesity，metabolic syndrome，diabetes，cardiovascular diseases and cancer by tea[J].Journal of Food & Drug Analysis，2018，26(1)：1-13
[6]国家市场监督管理总局，国家标准化管理委员会.茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法：GB/T 8313-2018[S].北京：中国标准出版社，2018
[7]孙世利，刘淑媚，赵超艺，等.茶多酚与维生素C/E 的协同抗氧化作用研究[J].广东农业科学，2013，40(1)：96-98
[8]杨皓彬，杨娜，柏雪，等.白茶中茶多酚提取工艺及抗氧化活性的研究[J].中国食品学报，2014，14(12)：24-31
[9]Tenore G C，Campiglia P，Giannetti D，et al.Simulated gastrointestinaldigestion，intestinal permeation and plasma protein interaction of white，green，and black tea polyphenols[J]. Food Chemistry，2015，169：320-326
[10]Lv H P，Zhang Y，Shi J，et al. Phytochemical profiles and antioxidant activities of Chinese dark teas obtained by different processing technologies[J]. Food Research International，2017，100(Pt 3)：486-493
[11]Wu Z，Teng J，Huang L，et al.Stability，antioxidant activity and in vitro bile acid-binding of green，black and dark tea polyphenols during simulated in vitro gastrointestinal digestion [J]. Rsc Advances，2015，112(5)：92089-92095
[12]高玉萍，唐德松，龚淑英.茶提取物抗氧化活性与茶多酚、儿茶素关系探究[J].中国食品学报，2013，13(6)：40-47