图1 上样和测定过程示意图
Fig.1 Schematic diagram of loading and detecting
孔雀石绿（malachite green，MG）和结晶紫（crystal violet，CV）均属于三苯甲烷类工业染料，由于其可以作为杀菌剂用于控制鱼类或鱼卵的寄生虫、真菌和细菌感染，早期在水产养殖上用来预防和治疗水产动物的鳃霉病、水霉病和水体环境消毒[1-2]。它们在被鱼类吸收后，大部分会快速地转化为隐色孔雀石绿（leucomalachite green，LMG）和隐色结晶紫（leucocrystal violet，LCV），代谢物由于其具有很好的亲脂性，因而在鱼类的脂肪组织中会形成比较稳定的残留[2]。研究表明，此类药物具有致癌、致畸、致突变等副作用[3]，欧盟、美国、日本以及我国等均宣布禁止其在水产品养殖过程中使用。但由于其价格低廉、效果显著，且尚无更好的替代品，所以在水产养殖中的使用屡禁不止。
目前国内外孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物的方法主要有高效液相色谱法（high performancy liquit chromatography，HPLC）[4-5]、高效液相色谱-串联质谱法（high performancy liquit chromatography-mass tande mass spectrometry，HPLC-MS/MS）[6-11]等。HPLC 方法前处理步骤复杂，检测灵敏度不高，且容易出现干扰，需要进一步的确证；HPLC-MS/MS方法前处理复杂，且水产样品基质复杂，容易产生基质效应。在线净化技术是针对质谱分析的高级在线复杂基质样品萃取技术，结合了扩散、化学和体积排除的原理，在捕获目标化合物的同时能够快速净化样品[12-14]。堵燕钰等[15]采用Turboflow在线净化技术与HPLC-MS/MS联用技术检测水产品中孔雀石绿及隐性孔雀石绿的残留，但未对结晶紫及隐色结晶紫残留进行研究。本研究是对在线净化技术的改进，通过两根不同净化柱的串联使用，进一步提高了复杂样品的净化效果。
1.1.1 仪器
TSQ Quantum Ultra AM三重四极质谱仪、Turboflow在线液相色谱系统（包括两个Transcend 600泵和CTC多功能进样器）、Aria OS及Xcalibur操作软件：美国Thermo Fisher公司；Waters 515液相泵：美国Waters公司；08895-67型超声波提取仪：美国 Cole Parmer公司；CR22高速离心机：日本日立公司；MILLI-Q纯水器：美国Millipore公司。
1.1.2 试剂
甲醇、乙腈和甲酸（HPLC纯）：美国Dikma公司；醋酸铵（色谱纯）：天津光复精细化工研究所；孔雀石绿（MG，纯度≥99%）、结晶紫（CV，纯度≥99%）、隐身孔雀石绿（LMG，纯度≥99%）、隐色结晶紫（LCV，纯度≥99%）、同位素内标孔雀石绿-d5（MG-d5，纯度≥99%），同位素内标隐色孔雀石绿-d6（LMG-d6，纯度≥99%）：美国Biopure公司。
储备液及工作液的配制：用乙腈将各固体标准品配制为0.1 mg/mL的标准储备液。取各储备液适量，用乙腈将储备液配制为1.0 μg/mL的混合工作液。
内标储备液及工作液的配制：用乙腈将MG-d5和LMG-d6标准品配制为0.1 mg/mL的标准储备液。取各储备液适量，用乙腈将储备液配制为1.0 μg/mL的混合中间液和0.1 μg/mL混合内标工作液。
采用针泵连续进样的方式，在正离子模式（ESI+）下，先对各个目标物进行母离子全扫描，然后对其子离子进行全扫描，分别选定定性离子和定量离子，并对喷雾电压、离子源温度、鞘气、辅助气、离子透镜电压等参数进行优化。
双柱在线净化技术通过柱切换实现样品的两步净化与测定一体化。主要包括3步：上样、一维净化、转移、二维净化、转移、测定，其中测定的同时包括在线净化柱的清洗与平衡。上样与测定步骤柱连接方式相同。图1为上样和测定过程的示意图，图2、图3分别为转移过程示意图，图中A、B、C和D分别表示不同的洗脱溶剂。
根据孔雀石绿等药物性质，优化选择一维净化柱，试验不同上样溶液及洗脱溶液对药物的富集效果。一维富集后，药物洗脱至二维净化柱，优化选择二维净化柱类型，选择适当活性的萃取柱，试验不同洗脱溶剂的洗脱效果。
图1 上样和测定过程示意图
Fig.1 Schematic diagram of loading and detecting
根据优化选择不同的流动相，使各药物质谱响应最佳。优化梯度洗脱程序，使各化合物峰形尖锐，对称。
图2 转移至二维净化过程示意图
Fig.2 Schematic diagram of transferring to the second cleanup-column
图3 转移至分析柱净化过程示意图
Fig.3 Schematic diagram of transferring to analysis column
以空白样品提取液，分别加入孔雀石绿等药物混标工作液以及内标工作液适量，配制系列标准基质溶液（0.1、0.2、0.5、1、2 ng/mL，内标为 1 ng/mL）进行测试，以药物浓度为横坐标，药物与相应内标峰面积比为纵坐标（孔雀石绿-d5作为孔雀石绿和结晶紫的内标，隐色孔雀石绿-d6作为隐形孔雀石绿和隐色结晶紫的内标），绘制标准工作曲线。
优化建立与在线净化相适应的前处理方法，样品经简单的溶剂提取过滤后直接上机测定。比较不同溶剂的提取效果，以空白样品添加一定浓度的标准溶液，以绝对回收率评价提取效果。
以未检测出孔雀石绿等药物的鱼肉作为空白基质，加入标准混合溶液及内标，选择优化后的前处理条件和仪器条件，上机检测，计算回收率。
1.9.1 色谱条件
表1 双柱在线净化系统洗脱程序表
Table 1 Elution program of positive electrospray ionization
时间/min MCX柱操作条件 C8柱操作条件 分析柱操作条件位置 乙腈/% 水相/% 流速/（mL/min）0 100 0 2.0 B 100 0 2.0 B 5 95 0.3 上样1.0 100 0 2.0 B 100 0 2.0 B 5 95 0.3 MCX柱淋洗步骤说明上样液/B阀%洗脱液/%流速/（mL/min）A阀位置上样液/%洗脱液/%流速/（mL/min）
一维净化柱为Cyclone MCX（50 mm×0.5 mm），上样溶剂为0.1%甲酸水溶液，洗脱溶液为乙腈-丙酮-氨水（47.5+47.5+5，体积比），洗脱流速 0.4 mL/min。二维净化柱为C8XL（50 mm×0.5 mm），上样溶剂为0.1%甲酸水溶液，洗脱溶液为1%氨水甲醇溶液，洗脱流速0.3 mL/min。分析柱为Atlantis dC18色谱柱（150 mm×2.1mm，3μm），流动相为0.1%甲酸溶液（含有0.01mol/L甲酸氨）+乙腈，洗脱程序见表1。进样量100 μL（每次进样 25 μL，共 4 次，计 100 μL），外标法定量。
续表1 双柱在线净化系统洗脱程序表
Continue table 1 Elution program of positive electrospray ionization
时间/min MCX柱操作条件 C8柱操作条件 分析柱操作条件位置 乙腈/% 水相/% 流速/（mL/min）1.1 0 100 0.4 A 100 0 2.0 B 5 95 0.3 MCX柱开始洗脱2.5 0 100 0.4 A 100 0 2.0 B 5 95 0.3 转移至C8柱2.6 0 100 2.0 B 0 100 0.3 A 5 95 0.3 MCX开始洗脱4.1 0 100 2.0 B 0 100 0.3 A 5 95 0.3 转移至分析柱4.6 0 100 2.0 B 0 100 2.0 B 5 95 0.3 分析柱平衡8.6 100 0 2.0 B 0 100 2.0 B 82 18 0.3 分析柱洗脱9.6 100 0 0.5 B 100 0 2.0 B 82 18 0.3 分析柱洗脱10.6 100 0 0.5 B 0 100 2.0 B 82 18 0.3 分析柱洗脱14.6 100 0 0.5 B 0 100 2.0 B 82 18 0.3 分析柱平衡16.0 100 0 2.0 B 100 0 2.0 B 5 95 0.3 系统平衡步骤说明上样液/B阀%洗脱液/%流速/（mL/min）A阀位置上样液/%洗脱液/%流速/（mL/min）
1.9.2 质谱条件
电喷雾离子源（ESI），正离子模式，喷雾电压设定为3 000 V，喷雾加热器温度350℃，离子传输管温度300℃，鞘气压力8 750 kPa，辅助气压力2 625 kPa。
采用选择性反应监测模式（selective reaction monitoring，SRM）采集质谱数据，质谱条件分别见表2。
表2 SRM质谱分析条件
Table 2 Experimental condition of tandem mass spectrometry
注：*表示定量离子。
离子透镜电压/V MG 10.02 329.0 313.0* 35 95 208.0 36 MG-d5 10.01 334.0 318.0* 35 95 CV 10.82 372.0 356.4* 34 110 340.4 52 LCV 13.75 374.3 358.5* 31 100 239.2 34 LMG 14.02 331.0 239.0* 36 100 316.0 21 LMG-d6 13.91 337.0 240.0* 36 100化合物 保留时间/min母离子/m/z子离子/m/z碰撞能量/eV
1.0 μg/mL标准溶液直接泵入质谱，在ESI+模式进行一级全扫描，调节喷雾电压、鞘气、辅助气、离子透镜电压等质谱条件，获得丰度较高的各化合物准分子离子峰，优化各母离子的离子透镜电压。以其作为母离子进行二级质谱扫描，选取响应信号最强的两个特征碎片离子，作为子离子，较高的作为定量离子，次之的为定性离子，优化子离子碰撞能量，最终优化后质谱参数见表2。
2.2.1 一维净化柱的操作条件优化
孔雀石绿等药物为阳离子药物，同时其极性较弱，因此其在阳离子交换柱（MCX）和反相C18或C8上都有较好的保留。由于MCX作用机理主要是离子交换，其抗干扰能力和选择性由于反相净化柱。因此选择MCX作为一维净化柱。
上样溶剂选择0.1%甲酸水最为方便，酸性条件有利于孔雀石绿等药物在净化柱上的保留。纯水作为上样溶剂经过洗脱后，活性无法完全恢复，影响孔雀石绿等药物的吸附。
MCX作为离子交换柱，洗脱溶剂需要一定浓度的氨水，且由于孔雀石绿等药物极性较弱，洗脱溶剂极性需要调节适当。洗脱溶剂试验了甲醇-氨水体系，乙腈-氨水体系，乙腈-丙酮-氨水体系，采用乙腈-丙酮-氨水体系时结晶紫和隐色结晶紫洗脱峰尖锐，其他溶剂体系洗脱能力不够，最终优化采用乙腈-丙酮-氨水（47.5+47.5+5，体积比）作为一维净化柱的洗脱溶剂。
2.2.2 二维净化柱的操作条件优化
孔雀石绿等药物经一维MCX柱净化后转移至二维净化柱，进一步富集净化。二维净化柱选择与一维净化柱不同净化机理的有助于进一步去除干扰，因此二维净化柱选择反相柱。由于反相C18或C8上都有较好的保留，试验优化了 HLB、C18P、C18XL、C8XL 等反相净化柱，发现各净化柱对结晶紫和隐色结晶紫吸附能力为HLB>C18P>C18XL>C8XL，由于二维净化柱洗脱液进入分析柱，需要该净化柱适当保留即可，洗脱液洗脱能力过大将影响分析柱上的保留及洗脱，最后导致峰形较差，影响定量。因此选择C8XL作为二维净化柱。
C8XL净化柱的洗脱液可使用机溶剂，试验发现一定浓度的氨水可以提高洗脱能力，避免使用极性较弱的溶剂影响孔雀石绿等药物在分析柱上的保留。洗脱溶剂要求极性越强越好，氨水比例越低越好，经优化1%的氨水-甲醇即可完成C8XL柱的洗脱。
为获得良好的峰形，最佳的质谱响应，考察了甲酸溶液、甲酸氨-甲酸溶液分别作为水相，甲醇、乙腈分别作为有机相，试验优化发现采用甲酸氨-甲酸溶液+乙腈作为流动相，梯度洗脱，各化合物峰形最尖锐，且质谱响应最佳。
流动相起始比例为95%水相，用于稀释转移至分析柱的高比例有机相及中和氨水，试验发现转移过程中各药物无不保留流出情况，梯度洗脱，逐渐增加有机相比例，各药物依次洗脱，分离良好且峰形尖锐、对称。优化后1 ng/mL混合标准溶液定量离子色谱图见图4。
图4 标准溶液SRM定量离子色谱图
Fig.4 Quantitative ion chromatography
1.MG；2.MG-d5；3.CV；4.LCV；5.LMG；6.LMG-d6。
孔雀石绿等4种药物为阳离子型药物，同时极性较弱，可以使用一定极性有机溶剂提取。为获得最大的提取效率，试验了甲醇、乙腈、甲醇-甲酸、甲醇-氨水、乙腈-甲酸、乙腈-氨水等提取溶剂，试验发现酸化乙腈对4种药物提取效果最好，进一步试验发现1%甲酸最佳。
以空白样品提取液，配制系列标准基质溶液（0.1、0.2、0.5、1、2 ng/mL，内标为 1 ng/mL）曲线进行测试，绘制标准工作曲线，各药物线性回归方程、相关系数（R2）、线性范围和定量限（10倍信噪比）。
表3 孔雀石绿等4种药物的线性回归方程、相关系数（R2）及定量限（LOQs，S/N=10）
Table 3 Regression equation correlation coefficient（R2）and limits of quantization（LOQs，S/N=10）of four drug
药物回归方程R2线性范围/（ng/mL）定量限/（μg/kg）MG Y=2.312 66x-0.017 383 9 0.999 2 0.1～2.0 0.5 CV Y=1.391 62x-0.003 022 9 0.999 0 0.1～2.0 0.5 LCV Y=1.635 23x+0.004 332 1 0.999 4 0.1～2.0 0.5 LMG Y=3.809 56x+0.035 294 6 0.999 6 0.1～2.0 0.5
方法的准确度和精密度通过加标回收试验进行评价。在空白鱼肉样品中按0.5、1.0、2.0 μg/kg的水平进行标准添加，测定回收率，平行测定6份，考察方法的回收率与重现性，结果见表4。
应用本方法对市售20个鱼样品进行测定，其中1个样品检出隐色孔雀石绿，含量为0.68 μg/kg，同时检出低于定量限的孔雀石绿及结晶紫；其他样品各药物均未检出。实际样品测定结果显示，各药物基线平稳，峰形对称，无明显杂峰干扰，说明在线净化效果较好。 阳性样品SRM定量离子色谱图见图5。
表4 空白鱼样的加标回收率和相对标准偏差（n=6）
Table 4 Spiked recoveries and relative standard deviations（RSD）（n=6）%
药物相对标准偏差MG 105.7 7.9 97.6 8.3 90.6 2.6 CV 108.1 5.4 109.4 3.7 106.0 5.7 LCV 87.6 14.1 79.0 6.8 76.8 2.0 LMG 99.3 2.3 95.7 5.0 90.9 2.3 0.5 μg/kg 1.0 μg/kg 2.0 μg/kg平均回收率相对标准偏差平均回收率相对标准偏差平均回收率
图5 阳性样品SRM定量离子色谱图
Fig.5 Quantitative ion chromatography of postive sample
1.MG；2.MG-d5；3.CV；4.LCV；5.LMG；6.LMG-d6。
本研究利用双柱在线净化、HPLC-MS/MS技术，建立了一种快速、灵敏测定鱼中孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、隐色孔雀石绿的方法。该方法4种药物的定量限为0.5 μg/kg，达到较高灵敏度。双柱在线净化，实现了样品净化的自动化，节省了检测成本，同时净化效率高，净化效果好，加快了检测速度。本方法回收率稳定，重现性好，适合于鱼肉样品中孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、隐色孔雀石绿的快速测定。
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