表1 试验因素编码及水平
Table 1 Code and level of experimental factors
水平A提取时间/minB提取温度/℃C液料比/（mL/g）-1 10 20 5∶1 0 30 30 10∶1 1 50 40 15∶1
柠檬苦素类化合物是存在于芸香科和楝科植物中的四环三萜类次生代谢产物，在柑橘类果实的核、内果皮和囊衣等部位均有分布，以果核中含量最高（1%左右），主要为柠檬苦素、诺米林和黄柏酮，是引起柑橘味苦的重要原因之一。柠檬苦素类化合物可增强体内谷胱苷肽S转移酶（glutathione S-transferase，GST）的活性，能抑制由化学物质引起的口腔癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌等肿瘤，具有镇痛消炎、抗疟、抗焦虑、抗高血压、抗菌、抗病毒、杀虫等作用，被认为是潜在的防癌剂，作为功能性食品配料和医药原料具有良好的开发应用前景[1-7]。
目前国内外有关柠檬苦素的提取研究较多，鲜见诺米林的提取研究报道，尚未见柠檬苦素、诺米林和黄柏酮同时提取的文献报道[8-16]。本文以柠檬苦素、诺米林和黄柏酮总得率为响应指标，采用Box-behnken响应面法优化超声辅助提取工艺，以期为柠檬苦素类化合物的开发利用提供技术参考。
橘核：产自浙江懼州，粉碎并过60目筛，30倍量石油醚回流脱脂后干燥备用；柠檬苦素、诺米林标准品（纯度均＞98%）：贵州医科大学药学院天然产物实验室自制；黄柏酮标准品（批号116A022，纯度＞98%）：北京索莱宝科技有限公司；乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。
Agilent 1290 DAD超高效液相色谱仪：美国Agilent公司；UC-10H加热超声波清洗器：上海泰坦科技股份有限公司；SHZ-C水浴恒温振荡器：上海浦东物理光学仪器厂；TGL-16G高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；BSA224S电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司。
1.2.1 柠檬苦素类成分的含量测定
1.2.1.1 色谱条件
色谱柱：UItimate AQ-C18（2.1 mm×100 mm）；流动相：乙腈-水（45∶55，体积比）；柱温：30℃；流速：0.21 mL/min；检测波长：210 nm；进样量：0.8 μL。
1.2.1.2 标准品溶液制备
取柠檬苦素、诺米林、黄柏酮标准品适量置10 mL量瓶，加甲醇溶解、定容，制得标准储备液，采用逐级稀释法配制系列标准工作溶液，按“1.2.1.1”项下条件检测。
1.2.1.3 供试品溶液制备
取橘核粉3.00 g置100 mL具塞锥形瓶，加入溶剂混匀、称重，于不同温度下超声辅助提取一定时间后冷却、称重并补足减失的重量、过滤。取供试品溶液按“1.2.1.1”项下条件检测，根据标准曲线测定檬苦素、诺米林、黄柏酮浓度，计算柠檬苦素类成分总得率Y=Y1+Y2+Y3。
1.2.2 单因素试验设计
以柠檬苦素类成分总得率为评价指标，固定其他条件不变，分别考察不同提取溶剂（石油醚、乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、异丙醇、无水乙醇、95%乙醇、甲醇、乙腈、水）、提取时间（10 min～90 min）、提取温度（20 ℃～60 ℃）、液料比[5 ∶1（mL/g）～25 ∶1（mL/g）]对柠檬苦素类成分提取的影响，确定工艺优化取值范围。
1.2.3 响应面试验设计
根据单因素试验结果，选择提取时间、提取温度、液料比为考察因素，以柠檬苦素类成分总得率Y/（mg/g）为响应指标，采用Box-behnken响应面法设计三因素三水平试验方案优化工艺条件，见表1。
表1 试验因素编码及水平
Table 1 Code and level of experimental factors
水平A提取时间/minB提取温度/℃C液料比/（mL/g）-1 10 20 5∶1 0 30 30 10∶1 1 50 40 15∶1
2.1.1 专属性
取标准品溶液和供试品溶液按“1.2.1.1”项下条件检测，结果见图1。
图1 标准品（A）和供试品（B）超高效液相色谱图
Fig.1 Ultra performance liquid chromatograms of reference substances（A）and sample（B）
1.柠檬苦素；2.诺米林；3.黄柏酮。
由图1可知柠檬苦素、诺米林、黄柏酮的保留时间分别为3.07、3.95、5.54 min，各色谱峰完全分离且无杂质峰干扰，表明方法专属性良好。
2.1.2 标准曲线
以浓度X（μg/mL）为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，柠檬苦素、诺米林、黄柏酮的回归方程分别为：Y1=1.965 5X-13.268 0（3.71 μg/mL～1 900 μg/mL，R2=0.999 5）；Y2=1.786 1X-9.153 2（2.93 μg/mL～1500 μg/mL，R2=0.9998）；Y3=4.5880X-40.0650（3.71μg/mL～950μg/mL，R2=0.9994）。
提取溶剂、提取时间、提取温度和液料比对柠檬苦素类成分总得率的影响见图2。
图2 各因素对柠檬苦素类成分总得率的影响
Fig.2 Effects of each factor on extraction yield of three limonoids constituents in citrus seed
由图2可知，以甲醇作提取溶剂时，柠檬苦素类成分总得率最高；随着提取时间延长、提取温度升高、液料比增加，柠檬苦素类成分总得率均先增幅明显，随之变缓并趋于平稳，说明目标物质的溶出基本完全，故确定提取时间、提取温度、液料比的最佳取值范围分别为10 min～50 min、20 ℃～40 ℃、5 ∶1（mL/g）～15 ∶1（mL/g）。
2.3.1 试验结果及回归模型分析
响应面试验结果见表2，回归模型的方差分析见表3。
表2 响应面试验设计及结果
Table 2 Experimental design and results of response surface
试验号A/min B/℃C/（mL/g）Y1/（mg/g）Y/（mg/g）1 10 20 10 3.560 9 2.913 0 0.709 1 7.183 1 2 50 20 10 4.632 1 4.207 9 1.016 0 9.856 0 3 10 40 10 4.430 1 4.165 1 0.813 2 9.408 4 4 50 40 10 5.078 0 4.296 2 0.852 0 10.226 2 5 10 30 5 3.261 1 3.166 0 0.568 4 6.995 5 6 50 30 5 3.421 9 3.963 9 0.856 2 8.242 0 7 10 30 15 3.969 0 3.591 4 0.969 1 8.529 5 8 50 30 15 5.862 2 4.699 3 0.988 6 11.550 1 9 30 20 5 3.225 1 3.400 0 0.636 0 7.261 1 10 30 40 5 4.000 8 4.101 0 0.691 2 8.793 0 Y2/Y3/（mg/g） （mg/g）
续表2 响应面试验设计及结果
Continue table 2 Experimental design and results of response surface
试验号A/minB/℃C/（mL/g）Y1/（mg/g）Y/（mg/g）11 30 20 15 4.285 0 3.987 1 0.892 1 9.164 2 12 30 40 15 5.160 1 4.577 8 0.925 1 10.662 9 13 30 30 10 5.450 2 4.550 6 0.840 6 10.841 4 14 30 30 10 5.659 0 4.810 3 0.920 0 11.389 2 15 30 30 10 5.700 9 4.663 0 0.876 0 11.240 0 Y2/Y3/（mg/g） （mg/g）
表3 回归模型的方差分析
Table 3 Analysis of variance for fitted quadratic polynomial model
方差来源 平方和 自由度 均方 F P模型 33.91 9 3.77 46.83 0.000 3 A 7.52 1 7.52 93.50 0.000 2 B 3.96 1 3.96 49.18 0.000 9 C 9.28 1 9.28 115.31 0.000 1 AB 0.86 1 0.86 10.69 0.022 2 AC 0.79 1 0.79 9.78 0.026 0 BC 0.000 3 1 0.000 3 0.003 4 0.955 6 A2 4.19 1 4.19 52.02 0.000 8 B2 3.15 1 3.15 39.16 0.001 5 C2 5.89 1 5.89 73.19 0.000 4误差 0.40 5 0.080失拟 0.24 3 0.081 1.01 0.533 7纯误差 0.16 2 0.080 R2=0.988 3合计 34.31 14 R2Adj=0.967 2
应用Design Expert 10.0.7软件对表2数据进行完全二次方程拟合，得柠檬苦素类成分总得率的回归方程：Y=-11.127 7+0.233 4A+0.695 8B+1.097 6C-0.002 3AB+0.004 4AC-0.000 3BC-0.002 7A2-0.009 2B2-0.0505C2。由表3可知模型P＜0.01，表明该模型极显著；失拟项P＞0.05不显著，说明试验误差小；R2=0.988 3，R2Adj=0.967 2，表明该模型拟合度良好；A、B、C 和 A2、B2、C2对柠檬苦素类成分提取影响极显著，AB、AC对柠檬苦素类成分提取影响显著。
2.3.2 响应曲面分析与优化
采用Design Expert 10.0.7软件绘制响应面图和等高线图，见图3。
由图3响应面图可知液料比对柠檬苦素类成分提取影响最为显著，表现为曲面较陡，提取时间影响次之，提取温度相对影响最小；由图3等高线图可知，提取时间和提取温度交互作用对柠檬苦素类成分提取影响最大，表现为等高线呈较扁的椭圆形，提取时间和液料比交互作用影响次之，提取温度和液料比交互作用影响较小。通过Design Expert 10.0.7软件分析，得到柠檬苦素类成分最佳提取工艺条件：提取时间39.99 min、提取温度 32.56℃、液料比 12.54 ∶1（mL/g）。
2.3.3 验证试验
为方便实际操作将最佳提取工艺参数调整为提取时间 40 min、提取温度 33℃、液料比 13∶1（mL/g），经3次验证试验，柠檬苦素类成分平均总得率为11.804 5 mg/g，与模型预测值11.756 9 mg/g的偏差为0.404 9%，表明该模型预测性良好，具有实用价值。取优化条件供试品溶液回收甲醇得干燥品，按“1.2.1”项下方法测得柠檬苦素类物质纯度72.642 5%，其中柠檬苦素36.599 4%、诺米林29.662 8%、黄柏酮6.380 3%，表明基于该工艺可有效获得高纯度柠檬苦素类化合物。
图3 各因素对柠檬苦素类成分总得率影响的响应面和等高线图
Fig.3 Responsive surface and contour of effects of each factor on extraction yield of three limonoids constituents in citrus seed
我国柑橘资源丰富，其产量居世界首位，但柑橘加工业还十分落后，大量的副产物没有合理利用，特别是橘核由于味苦，通常被当作生活垃圾丢弃。若能高效合理地提取柠檬苦素类化合物，并将其投至食品医药行业发展，将会带来显著的经济和社会效益。
超声辅助提取是常用的中药提取方法，具有快速、高效、环保，且设备简单、操作方便等特点[17]。本文应用响应面法首次建立了橘核中3种柠檬苦素类成分的超声辅助提取方法，得到优化提取工艺条件为甲醇作提取溶剂、提取时间40 min、提取温度33℃、液料比13∶1（mL/g），此条件下柠檬苦素类成分总得率为11.804 5 mg/g，产物中柠檬苦素类物质纯度高，有利于柠檬苦素、诺米林和黄柏酮的后续单体纯化，对其新型保健食品和新药研发有重要意义。本工艺具有经济、高效、合理、重复性好等特点，用于柑橘果实中柠檬苦素类化合物的提取切实可行，为柠檬苦素类化合物的进一步开发利用奠定了基础。
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