图1 桑葚酵素饮料的工艺流程
Fig.1 The process of the mulberry ferment beverage
桑葚（Fru ctus mori）又叫桑果、桑椹、桑椹子、桑葚子，是桑树所结的果实，味甘性寒，归心、肝、肾经，具有滋阴补血、生津止渴、补肝益肾等功效[1]。桑葚果汁色泽艳丽，且富含维生素、胡萝卜素、黄酮醇、花青素、酚酸等多种生物活性物质，具有良好的保健功能[2]。目前对桑葚的加工形式有干果[3]、果汁[4]、复合饮料[5]、果酒[6-8]及果醋[9-11]等。
酵素按用途可分为食用酵素、环保酵素、日化酵素及饲用酵素。其中，食用酵素是指以动物、植物及菌类为原料，经微生物发酵而制得具有特定生物活性成分可食用的产品[12]。其中生物活性成分对生物现象有影响的微量或少量物质，包括多糖类、寡糖类、蛋白质、酶及多肽类、氨基酸类、维生素类、及醇、酯、酸、酚类等[13]。进行桑葚酵素的研究开发，可以丰富桑葚的深加工形成，满足市场需求。
超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是重要的生物活性因子，在保护细胞免受氧自由基的毒害中发挥着重要作用，在医药、食品工业及农业上均有广泛的应用前景[14-16]。SOD酶活力是优化酵素发酵工艺的常用指标之一，此类的研究报道较多。如利用SOD酶活力作为指标，刘鑫等优化了蓝莓酵素发酵工艺[17]，冯彦君等优化了蓝莓酵素发酵工艺[18]，韦仕静等优化了西兰花酵素发酵工艺[19]。
近年来，对桑葚酵素的研究开发也有报道。如Kwaw E等[20]以总酚为指标，优化了利用乳酸杆菌发酵桑葚果汁制备桑葚酵素饮料的工艺；韦仕静等[21]以桑葚干果粉混合苹果汁为原料，乳酸杆菌为发酵菌株，总酸与总糖为指标，优化了桑葚酵素的发酵工艺。本研究以桑葚果汁为原料，SOD酶活力为指标，先从酿酒酵母、醋酸杆菌及植物乳酸杆3种种属中优选出合适菌种组合，然后单因素及正交试验优化了桑葚酵素饮料的发酵工艺，并对优化发酵工艺下制得的桑葚酵素饮料做了质量评价。
1.1.1 原料、菌株与培养基
1.1.1.1 原料
桑葚（Fructusmori），产自广东省化州市。
1.1.1.2 菌株
酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae，CGMCC2.3853）：中国普通微生物菌种保藏管理中心，醋酸杆菌（Acetobacter pasteurianus，CICC 20064） 及植物乳酸杆菌（Lactobacillus plantarum，CICC 21790）：中国工业微生物菌种保藏管理中心。
1.1.1.3 培养基
LB 培养基：蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。YPD培养基：蛋白胨20 g，酵母粉 10 g，葡萄糖 20 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.0。
1.2.1 主要试剂
邻苯三酚：国药集团；其他试剂分析纯。
1.2.2 主要仪器
WJS1222F型榨汁机：广东美的电器股份有限公司；HH-2型数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；DHZ-DA型卧式恒温摇床：苏州培英实验设备有限公司；YP10002型电子天平：上海佑科上海佑科仪器仪表有限公司；Gene 1580R型台式高速冷冻离心机（Gene Company Limited），及L5S型紫外可见分光光度计：上海仪电科学仪器有限公司。
1.3.1 桑葚酵素饮料的工艺流程
桑葚酵素饮料的工艺流程如图1所示。
图1 桑葚酵素饮料的工艺流程
Fig.1 The process of the mulberry ferment beverage
包括桑葚分选、桑葚榨汁、桑葚果汁调配、菌种培养与洗涤、桑葚果汁纯菌体接种、发酵、发酵液静置2 h澄清、8 000 r/min 离心 10 min、0.45 μm 滤膜过滤、质量检测、分装等工序。
1.3.2 原料的预处理
将-20℃冰箱保藏的桑葚转移到4℃冰箱中24 h，使结冰完全融化，于榨汁机中榨汁，纯桑葚榨汁不加水，榨汁后加入终浓度0.2 g/L偏重亚硫酸钾防氧化。桑葚果汁装瓶封口，-20℃冰箱保存，试验前在4℃冰箱中解冻24 h。
1.3.3 菌株培养与洗涤
酿酒酵母（YPD培养基，30℃、180 r/min振荡培养）、醋酸杆菌（LB培养基，30℃、180 r/min振荡培养）与植物乳酸杆菌（LB培养基，37℃、180 r/min振荡培养）培养至对数生长中后期，分别按接种量取培养液，离心去除培养基，无菌水洗涤菌体2次后，菌体接入桑葚果汁进行发酵。
1.3.4 SOD酶活力测定
采用邻苯三酚自氧化法测定桑葚果汁及桑葚酵素样品的SOD酶活力[22-23]。
邻苯三酚的自氧化速率测定：在试管中加入4.00mL蒸馏水、4.50 mL PBS（phosphate buffer saline）缓冲液（pH 8.3、50 mmol/L）、1.00 mL EDTA（ethylene diamine tetraacetic acid）溶液（10 mmol/L），混匀，25 ℃平衡20 min；然后加入0.50 mL邻苯三酚溶液（3 mmol/L、25℃预热），迅速摇匀，立即倾入比色杯中，在325 nm波长处测定光吸收值，每隔30 s读数一次，测定4 min内每分钟光吸收值的变化速率。空白对照为4.00 mL蒸馏水、4.50 mL PBS缓冲液（pH 8.3、50 mmol/L）、1.00 mL EDTA溶液（10 mmol/L）混合0.50 mL HCl（10 mmol/L）。
样品光密度值变化速率测定：桑葚果汁及桑葚酵素样品8 000 r/min、离心10 min，取上清液稀释10倍。在试管中加入0.20 mL稀释后的样品、3.80 mL蒸馏水、4.50 mL PBS 缓冲液（pH 8.3、50 mmol/L）、1.00 mL EDTA 溶液（10 mmol/L），混匀，25℃平衡 20 min；然后加入0.50 mL邻苯三酚溶液（3 mmol/L、25℃预热），迅速摇匀，立即倾入比色杯中，在325 nm波长处测定光吸收值，每隔30 s读数一次，测定4 min内每分钟光吸收值的变化速率。空白对照同前。
式中：V1为反应液总体积，mL；V2为测定样品体积，mL；n为样品稀释液倍数；ODA为邻苯三酚的自氧化速率；ODB为样品光密度值变化速率。
1.3.5 确定最佳发酵菌种
设置7个菌种组合：植物乳酸杆菌、醋酸杆菌、酿酒酵母、植物乳酸杆菌+酿酒酵母、植物乳酸杆菌+醋酸杆菌、醋酸杆菌+酿酒酵母、植物乳酸杆菌+醋酸杆菌+酿酒酵母；菌株组合体积比例为1∶1和1∶1∶1。桑葚果汁量为120 mL，调初始糖度为6 Brix，接种量为5%（菌种活化培养与洗涤后接入菌体），发酵温度设置为30℃，180 r/min振荡培养，发酵时间设置为48 h。取样测定各个菌株组合发酵液的单位SOD酶活力（每组测3个平行样），比较其显著性，选单位SOD酶活力最高的菌种组合进行进一步探究。
1.3.6 单因素试验
选取确定最佳发酵菌种试验中发酵液单位SOD酶活力最高的菌种组合作为桑葚酵素的发酵菌种，进行发酵温度、接种量、初始糖度及发酵时间等单因素试验，以单位SOD酶活力为指标，研究各因素对桑葚酵素发酵的影响。
1.3.6.1 发酵温度
发酵温度设置为 26、28、30、32、34、36 ℃共 6 个水平。桑葚果汁量为120 mL，初始糖度为6 Brix，接种量为10%（菌种活化培养与洗涤后接入菌体），180 r/min振荡培养，发酵时间设置为24 h。取样测定各个水平发酵液的单位SOD酶活力（每水平测3个平行样），t-检验比较其显著性。
1.3.6.2 接种量
接种量设置5%、10%、15%、20%、25%、30%共6个水平（菌种活化培养与洗涤后接入菌体）。桑葚果汁量为120 mL，初始糖度为6 Brix，发酵温度选取发酵温度因素试验中的最优发酵温度，180 r/min振荡培养，发酵时间设置为24 h。取样测定各个水平发酵液的单位SOD酶活力（每水平测3个平行样），比较其显著性。
1.3.6.3 初始糖度
用白砂糖调节桑葚果汁初始糖度为6、10、14、18、22、26 Brix共6个水平。桑葚果汁量为120 mL，接种量设置为接种量因素试验中的最优接种量（菌种活化培养与洗涤后接入菌体），发酵温度选取发酵温度因素试验中的最优发酵温度，180 r/min振荡培养，发酵时间设置为24 h。取样测定各个水平发酵液的单位SOD酶活力（每水平测3个平行样），t-检验比较其显著性。
1.3.6.4 发酵时间
发酵时间设置为 8、16、24、32、40、48 h 共 6 个水平。桑葚果汁量为120 mL，初始糖度为初始糖度因素试验中的最优初始糖度，接种量设置为接种量因素试验中的最优接种量（菌种活化培养与洗涤后接入菌体），发酵温度选取发酵温度因素试验中的最优发酵温度，180 r/min振荡培养，发酵时间设置为24 h。取样测定各个水平发酵液的单位SOD酶活力（每水平测3个平行样），t-检验比较其显著性。
1.3.7 正交试验
依据单因素试验结果，选取发酵温度、接种量、初始糖度及发酵时间4个因素各3个显著水平，进行四因素三水平L9（34）正交试验，以桑葚酵素中单位SOD酶活力为指标，确定最优桑葚酵素发酵工艺。
1.3.8 质量评价
采用优化所得的发酵条件，按桑葚酵素饮料的工艺流程制备葚酵素饮料，参照GB/T 10789-2015《饮料通则》[24]、GB/T 31121-2014《果蔬汁类及其饮料》[25]、及GB/T 30884-2014《苹果醋饮料》[26]等相关标准，对桑葚酵素饮料的感官、理化及微生物指标进行评价。
1.3.9 数据处理
试验数据用统计软件SPSS 20.0进行处理与分析，组间差异比较采用t-检验方法。
7个菌种组合发酵所得桑葚酵素，均没有异味，风味上均可以接受。菌种对桑葚酵素发酵的影响见图2。
图2 菌种对桑葚酵素发酵的影响
Fig.2 Effect on mulberry ferment with fermentation strain
t-检验与最小值（酿酒酵母）比较，*表示差异显著（p＜0.05），**表示差异极为显著（p＜0.01）。
由图2可知，与单位SOD酶活力最低的（酿酒酵母）比较，植物乳酸杆菌、醋酸杆菌、植物乳酸杆+菌醋酸杆菌为发酵菌种的差异极为显著（p＜0.01），植物乳酸杆菌+酿酒酵母、醋酸杆菌+酿酒酵母、植物乳酸杆菌+酿酒酵母+醋酸杆菌为发酵菌种的差异显著（p＜0.05），说明发酵菌种对桑葚酵素的发酵有明显影响。其中，以醋酸杆菌为发酵菌种的桑葚酵素单位SOD酶活力（19 146.2 U/mL）最高，因此选取醋酸杆菌为发酵菌种，进行后续研究。
2.2.1 发酵温度
酵温度对桑葚酵素发酵的影响见图3。
由图3可知，在初始糖度为6 Brix、发酵菌种为醋酸杆菌、接种量为10%、发酵时间24 h情况下，发酵温度对桑葚酵素的单位SOD酶活力有明显影响；随着发酵温度的升高桑葚酵素的单位酶活力逐渐升高，当温度达到30℃时单位酶活力达到最高，当温度超过30℃时，单位酶活力明显下降。因此选取28、30、32℃此3个发酵温度水平进行正交试验。
图3 发酵温度对桑葚酵素发酵的影响
Fig.3 Effect on mulberry ferment with ermentation temperature
t-检验与最小值（36℃）比较，*表示差异显著（p＜0.05），**表示差异极为显著（p＜0.01）。
2.2.2 接种量
接种量对桑葚酵素发酵的影响见图4。
图4 接种量对桑葚酵素发酵的影响
Fig.4 Effect on mulberry ferment with inoculum
t-检验最小值（30%）比较，*表示与差异显著（p＜0.05），**表示差异极为显著（p＜0.01）。
由图4可知，在初始糖度为6 Brix、发酵菌种为醋酸杆菌、发酵温度为30℃、发酵时间24 h情况下，接种量对桑葚酵素的单位SOD酶活力有明显影响；接种量为5%时桑葚酵素的单位酶活力较低，随着菌种接种量的提高单位酶活力逐渐升高，当接种量达到10%时单位酶活力达到最高，接种量超过10%单位酶活力开始明显下降。因此选取5%、10%、15%此3个接种量水平进行正交试验。
2.2.3 初始糖度
初始糖度对桑葚酵素发酵的影响见图5。
由图5可知，在发酵菌种为醋酸杆菌、接种量为10%、发酵温度为30℃、发酵时间24 h情况下，初始糖度对桑葚酵素的单位SOD酶活力有明显影响；初始糖度为6Brix时，桑葚酵素的单位酶活力较低，随着初始糖度的提高单位酶活力逐渐升高，初始糖度达到14 Brix时桑葚酵素的单位酶活力达到最高，超过14 Brix后，单位酶活力开始逐渐下降。因此选取10 Brix、14 Brix、18 Brix此3个初始糖度水平进行正交试验。
图5 初始糖度对桑葚酵素发酵的影响
Fig.5 Effect on mulberry ferment with initial sugar content
t-检验与最小值（26 Brix）比较，*表示差异显著（p＜0.05），**表示差异极为显著（p＜0.01）。
2.2.4 发酵时间
发酵时间对桑葚酵素发酵的影响见图6。
图6 发酵时间对桑葚酵素发酵的影响
Fig.6 Effect on mulberry ferment with fermentation time
t-检验与最小值（48 h）比较，*表示差异显著（p＜0.05），**表示差异极为显著（p＜0.01）。
由图6可知，在发酵菌种为醋酸杆菌、初始糖度为6 Brix、接种量为10%、发酵温度为30℃情况下，初始糖度对桑葚酵素的单位SOD酶活力有明显影响；桑葚酵素的单位SOD酶活力随发酵时间的延长，呈先升高后降低的趋势，发酵时间为24 h时，桑葚酵素的单位SOD酶活力达最高。因此选取16、24、32 h此3个发酵时间水平进行正交试验。
依单因素试验结果，选取A发酵温度（28、30、32℃）、B 发酵时间（16、24、32 h）、C 初始糖度（10、14、18 Brix）及D接种量（5%、10%、15%）进行L9（34）正交试验。结果如表1所示。
表1 桑葚酵素发酵L9（34）正交试验结果
Table 1 Orthogonal experiment results of fermentation for mulberry ferment L9（34）
水平D接种量/%1 1（28） 1（16） 1（10） 1（5） 20 779.2 2 1（28） 2（24） 2（14） 2（10） 21 933.6 3 1（28） 3（32） 3（18） 3（15） 20 923.5 4 2（30） 1（16） 2（14） 3（15） 23 088.0 A发酵温度/℃B发酵时间/h因素 单位SOD酶活力（U/mL）C初始糖度/Brix
续表1 桑葚酵素发酵L9（34）正交试验结果
Continue table 1 Orthogonal experiment results of fermentation for mulberry ferment L9（34）
水平A发酵温度/℃B发酵时间/h因素 单位SOD酶活力（U/mL）C初始糖度/Brix D接种量/%5 2（30） 2（24） 3（18） 1（5） 22 799.4 6 2（30） 3（32） 1（10） 2（10） 22 510.8 7 3（32） 1（16） 3（18） 2（10） 22 077.9 8 3（32） 2（24） 1（10） 3（15） 21 356.4 9 3（32） 3（32） 2（14） 1（5） 21 645.0 k1 21 212.1 21 981.7 21 548.8 21 741.2 k2 22 799.4 22 029.8 22 222.2 22 174.1 k3 21 693.1 21 693.1 21 933.6 21 789.3 R 1 587.3 336.7 673.4 423.9
桑葚酵素发酵的A发酵温度、B发酵时间、C初始糖度及D醋酸菌接种量4个因素的极差（R）表现为：RA（1587.3）＞RC（673.4）＞RD（423.9）＞RB（336.7），因此影响桑葚酵素发酵的主次影响因素依次为发酵温度、初始糖度、醋酸菌接种量、发酵时间。
k1、k2、k3分别为各因素各水平所对应的单位SOD酶活力的平均值，由表2可知，在 A 因素中，k2＞k3＞k1；在 B 因素中，k2＞k1＞k3；在 C 因素中，k2＞k3＞k1；在 D 因素中，k2＞k3＞k1。因此，各因素水平对结果影响的强弱顺序是：A2＞A3＞A1，B2＞B1＞B3，C2＞C3＞C1，D2＞D3＞D1；由此可得出荔枝酵素发酵工艺的最优方案为A2B2C2D2。
综合分析，最终确定桑葚酵素发酵工艺为：发酵温度为30℃、初始糖度14 Brix、醋酸菌接种量为10%、发酵时间为24 h。在此工艺条件下，3次重复验证试验结果为，桑葚酵素的SOD酶活力为24 122.2 U/mL，大于正交试验中的最大值23 088 U/mL。
2.4.1 桑葚酵素饮料的感官指标
桑葚酵素饮料感官指标的评价结果见表2。
表2 桑葚酵素饮料的感官评价表
Table 2 Sensory evaluation of the mulberry ferment beverage
项目 桑葚酵素饮料 相关标准指标色泽 紫红色 具有该品种固有的色泽香气 具有桑葚的果香和醋香 具有该品种独特的气味滋味 酸味柔和，无异味 酸味柔和，无异味体态 清澈透明有光泽，无沉淀 澄清
结果表明，以桑葚为原料采用最佳发酵工艺酿制的桑葚酵素饮料色泽紫红鲜艳，酸味柔和，口感上佳，体态透明清澈无沉淀，具有桑葚果香和醋香。该桑葚酵素饮料感官指标符合及GB/T 30884-2014《苹果醋饮料》[26]等相关标准。
2.4.2 桑葚果汁与桑葚酵素饮料理化成分指标比较
对桑葚酵素饮料中SOD酶活、总酸、总糖、还原糖进行测定，得到桑葚酵素饮料的理化指标，结果见表3。
表3 桑葚果汁与桑葚酵素饮料的理化指标
Table 3 Physicochemical indexes of the mulberry juice and the mulberry ferment beverage
注：-表示相关准中没有规定该项具体指标。
项目 SOD酶活/（U/mL）总酸/（g/L）总糖/%还原糖/%桑葚果汁 10 818.7 1.63±0.14 10.36±0.04 4.240±0.025桑葚酵素饮料 24 122.2 3.82±0.08 5.37±0.08 2.154±0.016相关标准指标 - ≥3 - -
桑葚酵素饮料的SOD酶活力为24 122.2 U/mL，比较于桑葚果汁的SOD酶活力（10 818.7 U/mL）提高了123%；总酸为（3.82±0.08）g/L，总糖为（5.37±0.08）%，还原糖为（2.154±0.016）%，符合 GB/T 30884-2014《苹果醋饮料》[26]等相关标准。
2.4.3 桑葚酵素饮料的微生物指标
桑葚酵素饮料微生物指标的评价结果见表4。
表4 桑葚酵素饮料的微生物指标
Table 4 Microbial indicators of the mulberry ferment beverage
项目 菌落总数/（cfu/mL）大肠菌群/（MPN/100 mL）霉菌/（cfu/mL） 致病菌桑葚酵素饮料 ≤42 未检出 未检出 未检出标准 ≤100 ≤3 ≤20 不得检出
表4表明桑葚酵素饮料微生物指标符合GB/T 31121-2014《果蔬汁类及其饮料》[25]及GB/T 30884-2014《苹果醋饮料》[26]等相关标准。
本研究以桑葚果汁为原料，SOD酶活力为指标，先从酿酒酵母、醋酸杆菌及植物乳酸杆3种种属中优选出合适菌种组合，然后单因素及正交试验优化了桑葚酵素饮料的发酵工艺。
优化后的桑葚酵素饮料的发酵工艺为：发酵菌种为醋酸菌，初始糖度14 Brix，接种量10%，发酵温度30℃、发酵时间24 h；此工艺条件下制备的桑葚酵素饮料的SOD酶活力达24 122.2 U/mL，比桑葚果汁的SOD酶活力（10 818.7 U/mL）提高了123%；桑葚酵素饮料色泽紫红鲜艳，酸味柔和，口感上佳，体态透明清澈无沉淀，具有桑葚果香和醋香，其感官指标、理化指标及微生物指标符合相关国家标准。
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