根据世卫组织研究报道，中国当前超重人口超过3亿，已成为拥有超重人口最多的国家，而且这个数字还在飞速增长。科研人员发现[1]肥胖病人患高血压、高血脂、心脑血管等疾病的概率比一般人要高。肥胖往往和人们摄入过多高脂、高热量食物有关，降低脂肪摄入，可以有效降低体重。人体摄入的脂肪先通过消化系统中的胰脂肪酶（porcine pancreatic lipase，PPL）水解[1]，然后被吸收转换成能量。在脂肪水解过程中，胰脂肪酶作为重要的水解酶可以把油脂水解为甘油和单分子脂肪酸[2]，因此抑制或降低体内胰脂肪酶的活性可以对脂肪的水解和吸收进行抑制，以此达到减重和控制肥胖的目的[3]。目前已发现多种能抑制脂肪酶活性的功能成分，如黄酮类物质[4-7]、多酚类物质[8-10]、香水莲花提取物[11]等，但目前还未有绿茶中脂肪酶抑制剂提取的报道。
国内外对绿茶的诸多研究表明，绿茶中的活性成分具有调节血脂[12-13]和控制肥胖[14-15]等多种保健功能，在崂山绿茶中提取分离能抑制脂肪酶活性的功能性成分，并优化其提取工艺，不但可以改善目前日益严重的人群肥胖问题，对开发绿茶资源进而服务新旧动能转换也具有重大的意义。
超声波对生物细胞有破坏作用[16]，可以强化萃取系统物质的传递作用，与传统溶剂法提取工艺相比，能使有效成分更好的溶出[17]。该文对萃取液施加超声波，对超声波辅助提取崂山绿茶中脂肪酶抑制剂的影响因素进行探讨，并筛选出较佳的提取工艺条件。
崂山绿茶：市售，晒干后粉碎，备用；猪胰脂肪酶（酶活≥30 000 U/g）：Sigma公司；硝基苯基月桂酸酯底物溶液（P-nitropenyl laurate，pNPL）：月桂酸 4-硝基苯酯：安徽酷尔生物工程有限公司；pH 7.5磷酸缓冲液（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
LTB-1000数显温控超声波清洗机：济宁鲁通超声电子设备有限公司；RE-2001A旋转蒸发仪：上海亚荣仪器厂；ZNCL-GS磁力搅拌器：上海一科仪器有限公司；2-16N高速常温离心机：湖南恒诺仪器设备有限公司；5202P型数显pH计：登科普瑞（北京）科技有限公司；DNM-9606酶标分析仪：北京普朗新技术有限公司。
1.3.1 胰脂肪酶活性检测方法
37℃恒温下，把底物与胰脂肪酶放置3 min，底物1 min内释放1 μmol对硝基苯酚所需要的酶量为一个酶活力单位，U。
在试管中加入pH 7.5的磷酸缓冲溶液350 μL、450 μL pNPL底物、样品溶液 50 μL，37℃预热 10 min后加入 150 μL 胰脂肪酶（0.2 mg/mL），混匀，37℃避光反应60 min，16 000 r/min离心3 min，取上清于405 nm波长测吸光度[18-19]。用缓冲溶液代替样品液做对照组做3次平行试验。抑制率按公式（1）进行计算率。
式中：A1、A2分别为对照组和不同样品溶液在405 nm处的吸光度。
1.3.2 崂山绿茶提取物得率的计算
提取物冷冻干燥后，称量，按公式（2）计算提取物的得率。
式中：Y 为提取物得率，%；m′为提取物质量，g；m为崂山绿茶质量，g。
1.3.3 崂山绿茶中脂肪酶抑制剂活性部位筛选
取粉碎后的崂山绿茶1 kg，按1∶7（g/mL）的料液比加入95%乙醇，浸提3次，每次半小时。浓缩提取液，按1∶3（g/mL）的料液比分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取至有机层无色，浓缩并冷冻干燥各有机相提取物，配成所需浓度后按1.3.1所述方法测定各极性溶剂提取物的抑酶活性。
1.3.4 超声波提取崂山绿茶中脂肪酶抑制剂的单因素试验
称取20 g崂山绿茶6份于烧杯中，置于超声清洗仪中超声提取，分别对乙醇浓度、超声功率、超声提取温度、超声提取时间等影响因素进行单因素试验，把得到的浸提液进行浓缩，再用有机溶剂萃取，冷冻干燥有机溶剂萃取液，干燥后的粉末物质即为崂山绿茶中抑制脂肪酶的活性成分[20-21]。
1.3.4.1 乙醇浓度对脂肪酶抑制剂的得率和抑制率的影响
以1∶15（g/mL）料液比分别加入 20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇，30℃下超声浸提 30 min，超声波功率为300 W。测量超声波下不同浓度乙醇对提取物的得率和对脂肪酶活性抑制率的影响。
1.3.4.2 超声功率对脂肪酶抑制剂的得率和抑制率的影响
以1∶15（g/mL）料液比加入60%乙醇，设不同超声功率（100、200、300、400、500、600 W）在 30 ℃下提取30 min。测量不同超声功率对提取物的得率和对脂肪酶活性抑制率的影响。
1.3.4.3 超声提取温度对脂肪酶抑制剂的得率和抑制率的影响
以1∶15（g/mL）料液比加入60%乙醇，不同温度下（20、30、40、50、60、70 ℃）下超声提取 30 min，超声功率为300 W。测量不同提取温度对提取物的得率和对脂肪酶活性抑制率的影响。
1.3.4.4 超声提取时间对脂肪酶抑制剂的得率和抑制率的影响
以 1∶15（g/mL）料液比加入 60%乙醇，30℃下超声提取若干分钟（10、20、30、40、50、60 min），超声功率为300 W。测量不同提取时间对提取物的得率和对脂肪酶活性抑制率的影响。
1.3.5 提取工艺的正交试验
在单因素试验的基础上，以脂肪酶抑制剂的得率和抑制率为指标，以乙醇浓度、超声功率、超声提取温度、超声提取时间作为正交试验的考察因素，选用L9（34）正交试验，因素和水平见表1。
表1 L9（34）正交试验的因素和水平
Table 1The factors and levels of L9（34）orthogonal test
水平 A乙醇浓度/%D超声提取时间/min 1 50 200 30 10 2 60 300 40 20 3 70 400 50 30 B超声功率/W C超声提取温度/℃
不同溶剂提取物对脂肪酶活性的抑制作用见图1。
图1 不同溶剂提取物对脂肪酶活性的抑制作用
Fig.1 Inhibitory effects of different solvent extracts on lipase activity
由图1可见，5种不同极性提取物对脂肪酶活性的抑制作用从大到小依次为：乙酸乙酯提取物>水相提取物>正丁醇提取物>氯仿提取物>石油醚提取物。其中乙酸乙酯提取物的抑制效果显著，当提取物浓度为10 mg/mL时，对脂肪酶活性的抑制率可达89.3%。不同溶剂提取物抑制脂肪酶活性的IC50见表2。
表2 不同溶剂提取物抑制脂肪酶活性的IC50
Table 2 IC50of different solvent extracts to inhibit lipase activity
不同溶剂提取物IC50/（mg/mL）水提取物 3.95石油醚提取物 9.64×106氯仿提取物 34.73乙酸乙酯提取物 0.69正丁醇提取物 21.61
根据图1计算得出不同极性溶剂提取物对脂肪酶活性的抑酶IC50，如表2所示，乙酸乙酯提取物对脂肪酶活性的抑制效果最好，石油醚提取物抑制效果最差。因此选择用乙酸乙酯作为超声提取脂肪酶抑制剂工艺的萃取剂。
2.2.1 乙醇浓度对脂肪酶抑制剂的得率和抑制率的影响
测量不同浓度乙醇条件下提取物的得率和对脂肪酶的抑制率见图2。
图2 乙醇浓度对脂肪酶抑制剂得率和抑制率的影响
Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield and inhibition rate of lipase inhibitors
由图2可知，脂肪酶抑制剂的得率随着乙醇浓度的增加而增加，但当乙醇浓度大于50%时，得率增加不大；脂肪酶抑制剂的抑制率在乙醇浓度为50%时最大，高于50%时抑制率反而下降，这可能是因为随着乙醇浓度增加，非抑制成分醇溶物增加，虽然得率增加，但抑制剂含量下降，从而导致抑制率下降。
2.2.2 超声功率对脂肪酶抑制剂的得率和抑制率的影响
测量不同超声功率下提取物的得率和对脂肪酶的抑制率见图3。
图3 超声功率对脂肪酶抑制剂得率和抑制率的影响
Fig.3 Effect of ultrasound power on the yield and inhibition rate of lipase inhibitors
由图3可知，提取物得率和对脂肪酶的抑制率都在400 W时达到最大。这是因为随着超声功率增加，热效应也逐渐加强，脂肪酶抑制剂的活性降低。
2.2.3 超声提取温度对脂肪酶抑制剂的得率和抑制率的影响
测量不同超声提取温度下提取物的得率和对脂肪酶的抑制率见图4。
图4 提取温度对脂肪酶抑制剂得率和抑制率的影响
Fig.4 Effect of extraction temperature on the yield and inhibition rate of lipase inhibitors
由图4可知，提取物得率与提取温度成正比，而抑制率随着温度升高先增加后降低，在40℃时抑制率最大。可见，温度升高虽然可增加得率，但却使脂肪酶抑制剂降低了活性。
2.2.4 超声提取时间对脂肪酶抑制剂的得率和抑制率的影响
超声提取时间对提取物的得率和对胰脂肪酶活性的抑制率的影响如图5所示。
由图5可知，提取率随时间不同而不同，如果超声提取时间过短，则有效成分来不及从绿茶细胞中溶出，影响提取率，但当绿茶中脂肪酶抑制剂基本浸出完毕后，增加提取时间对得率影响不大，其抑制率反而有所下降，因为活性成分在溶液中长时间受热可能使部分结构被破坏。从图5可以看出超声提取20 min时抑制率最大。
图5 超声提取时间对脂肪酶抑制剂得率和抑制率的影响
Fig.5 Effect of ultrasonic extraction time on the yield and inhibitory rate of lipase inhibitors
在单因素试验的基础上，对乙醇浓度、超声功率、超声提取温度、超声提取时间4个影响提取工艺的因素进行正交试验，结果如表3所示。
表3 超声提取崂山绿茶中脂肪酶抑制剂的正交试验结果
Table 3 Orthogonal test of ultrasonic extraction of lipase inhibitors from Laoshan green tea
抑制率/%1 1 1 1 1 27.2 69.8 2 1 2 2 2 27.6 71.6 3 1 3 3 3 27.8 67.5 4 2 1 2 3 28.4 78.1 5 2 2 3 1 27.8 79.4 6 2 3 1 2 28.1 75.9 7 3 1 3 2 28.7 61.5 8 3 2 1 3 28.8 63.6 9 3 3 2 1 27.9 66.8得率K1 82.6 84.3 84.1 82.9 K2 84.3 84.2 83.9 84.4 K3 85.4 83.8 84.3 85.0 R 2.8 0.5 0.4 2.1优水平 3 1 3 3主次顺序 A D B C抑制率K’1 208.9 209.4 209.3 216 K’2 233.4 214.6 209 209 K’3 191.9 210.2 207 209.2 R 41.5 5.2 2.3 7优水平 2 2 1 1主次顺序 A D B C试验号 A乙醇浓度B超声功率C超声提取温度D超声提取时间得率/%
由表3可以看出，影响提取物得率的因素的主次顺序为A>D>B>C，即乙醇浓度对得率影响最大，其次是超声提取时间，然后是超声功率和超声提取温度。最优组合为A3B1C3D3，即用70%乙醇，超声波功率为200 W，在50℃下超声提取30 min。对于抑制剂抑制率，影响因素的主次顺序为A＞D＞B＞C，即乙醇浓度对抑制率影响最大，其次是超声提取时间，然后是超声功率和超声提取温度，最优组合为A2B2C1D1，即用60%乙醇，超声功率为300 W，在30℃下提取10 min。经综合评价，确定A2B2C1D1为最终优化工艺条件。
用60%乙醇，设定超声功率为300 W，在30℃下超声提取10 min，以此条件进行3次验证试验，结果见表4。
表4 崂山绿茶中脂肪酶抑制剂最佳提取工艺条件
Table 4 Verification of the optimum conditions for inhibitor
编号 得率/% 相对标准偏差（得率）/%平均抑制率/%1 29.1 78.9 2 28.9 0.86 29.2 79.2 0.36 79.2 3 29.5 79.6平均得率/%抑制率/%相对标准偏差（抑制率）/%
3次验证试验相对标准偏差值皆在2%之内，说明此工艺稳定性好。在此工艺条件下，提取物平均得率为29.2%，平均抑制率为79.2%。
用不同极性溶剂对崂山绿茶中脂肪酶抑制剂的活性部分进行筛选，水、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇组分对崂山绿茶中脂肪酶抑制的IC50值分别为3.95、9.64、34.73、0.69、21.61 mg/mL，脂肪酶抑制剂重要集中在乙酸乙酯组分中，因此提取工艺先用乙醇提取，再用乙酸乙酯萃取。经综合评定，确定超声波法法提取崂山绿茶中脂肪酶抑制剂的最佳工艺条件为：用60%乙醇，超声功率为300 W，在30℃下超声提取10 min，得率和抑制率分别为29.2%和79.2%。与单纯用溶剂浸提相比，超声波辅助提取工艺提高了脂肪酶抑制剂的得率和抑制率，并大大缩短了提取时间。
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