中国酸菜的悠久历史可以追溯到3 000多年前的周朝，北魏贾思勰所著的《齐民要术》中就有详细记载。古人用腌渍方法来储存蔬菜，便有了酸菜的雏形，经过几千年的历史文化变迁，酸菜在中国的市场上仍然受追捧。酸菜通常是将新鲜的蔬菜浸泡在6%～8%的盐溶液中，然后密封，使生鲜菜叶子上的固有微生物发酵产生乳酸及各种风味物质而成[1-2]。乳酸菌群在酸菜的发酵体系中发挥主导作用[3]，其发酵产生的酸、醇、酯等呈味物质，赋予了酸菜特有的风味及口感[4]；乳酸菌代谢产生的乳酸和细菌素等物质可以抑制发酵体系中腐败菌的生长[5]。此外，酸菜中的乳酸菌及其代谢物还具有助消化、调节肠道菌群、降血脂等保健功效[6-7]。传统东北酸菜以白菜为原料经自然发酵而成，因其所处独特的地理环境及人文历史成为中国酸菜家族的典型代表，并成为东北独特的饮食文化元素[8]。目前，东北酸菜生产正在从传统自然发酵向工业化接种发酵发展。乳酸菌的性能决定了酸菜的品质，因为缺少性能优良的专用酸菜发酵剂，发酵周期长、品质不稳定、腐烂率高、亚硝酸盐高等一系列问题依然是阻碍酸菜的规模化、标准化生产的主要矛盾[9-11]。因此，从传统自然发酵的酸菜中筛选分离性能优良，既能产生独特的风味又能保证安全品质的酸菜发酵剂是实现酸菜工业化的必要保证。本研究主要以吉林长春地区百姓家中发酵品质良好的酸菜发酵液为样品，通过菌落形态、革兰氏染色、过氧化氢酶活性等分离乳酸菌，根据产酸特性、降亚硝酸盐能力、抑菌活性从中筛选优质菌株，再用分离菌株作为发酵剂发酵酸菜，经感官评价和风味成分分析最终得到理想的乳酸菌菌株，为东北酸菜实现高品质规模化工业化生产提供菌种资源。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料与试剂
自发酵酸菜汁10份，分别采自长春市绿园小区、万盛小区、中新花园小区10户市民家中，居民自述所用白菜均为“东北大矮”，用灭菌吸管吸取5mL酸菜汁，装入10 mL无菌离心管备用；大肠杆菌（ATCC8739）、金黄色葡萄球菌（ATCC95922）：国家标准菌株库，吉林大学食品安全实验室保存；沙门氏菌、李斯特菌：吉林大学人兽共患病研究室分离鉴定保存；MRS琼脂培养基、MRS肉汤培养基、LBS肉汤培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司；MRS琼脂培养基中加入1.5%的碳酸钙制成MRS-CaCO3选择培养基[12]。Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、pMD 18-T Vector连接试剂盒：上海生工生物工程股份有限公司；其他试剂均为实验室常备分析纯或色谱纯。
1.1.2 仪器与设备
HZQ-X400型恒温培养箱：太仓市科教器材厂；SW-CJ-1D型超净工作台：浙江苏州净化设备有限公司；PHS-3C型pH计：上海仪电科学仪器有限公司；LC-20A型超高效液相色谱仪：日本岛津公司；AMD9PLUS+AMD5型气相色谱质谱联用仪：东莞市欧若斯仪器有限公司；DP-6027型固相微萃取仪：北京亚欧德鹏科技有限公司；DYCP-31A稳压电泳仪、WD-9413A凝胶成像仪：北京六一仪器厂；YS2-H型显微镜：Nikon China；721G-100可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 乳酸菌的分离纯化
参照Wu等[13]的方法，分别取1mL酸菜汁用0.85%无菌生理盐水梯度稀释制备（10-1～10-8）浓度的酸菜汁，旋涡振荡混匀。依次选择10-4～10-7浓度的稀释样品，采用涂布平板法，在37℃厌氧条件下培养48 h～72 h，从MRS-CaCO3选择培养基上挑出明显溶钙圈的单菌落，再经过3次划线分离直至菌落镜检无杂菌。纯化后将革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性菌判断为乳酸菌并进行编号，MRS斜面培养基于4℃冰箱保存备用。
1.2.2 乳酸菌的产酸速度和产酸量测定
将分离菌株在MRS液态培养基中活化至109CFU/mL，以0.15%转接MRS液体培养基，37℃培养24 h，pH计测量pH值，空白培养基对照。产酸量参照GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》酸碱中和法测定。
1.2.3 抑菌活性检测
采用牛津杯定量扩散法，以沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌为指示菌，在37℃培养 8 h～12 h，测量抑菌圈直径[13]。
1.2.4 分子生物学鉴定
采用16S rDNA序列同源相似性分析做菌种鉴定，测序委托生工生物工程（上海）有限公司完成，测序引物设计如表1。
表1 测序引物序列设计
Table 1 Sequence of the primer
名称 序列5’→3’ 扩增序列 PCR长度7F 1540R CAGAGTTTGATCCTGGCT AGGAGGTGATCCAGCCGCA 16S rDNA 1 500 bp左右27F 1492R AGTTTGATCMTGGCTCAG GGTTACCTTGTTACGACTT 16S rDNA 1 500 bp左右
1.2.5 发酵性能评价
1.2.5.1 不同菌株发酵剂制备及酸菜发酵工艺
MRS活化乳酸菌至对数生长期，4℃下6 000 r/min低温离心10 min收集菌泥，加3倍体积保护剂（10%脱脂乳+6%海藻糖+1%麦芽糊精+1%甘油）[14-15]，-80℃下预冻2 h，用真空冷冻干燥机获得冻干菌粉。
工艺：白菜整理→清洗→晾干→切分→入缸→注入盐水→接种→密封→发酵→成品
盐水浓度为2%，发酵剂接种量为白菜重量的0.2%；20℃～25℃密封发酵20 d。
1.2.5.2 酸菜感官评价
参照陈功、赵国忠等的标准[16-17]做相应调整，请10名同学担任评价员，评价前统一培训，按照表2感官评定标准打分，品评两个样品需间隔3 min以上，每个指标满分10分，根据总分判断优劣。感官评价标准见表2。
表2 酸菜感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standard table of fermented sauerkraut
分值 色泽 香气 组织状态8分～10分 菜心嫩黄色，菜帮半透明有光泽具有酸菜特有的芳香气味，气味醇厚，无异味结构完整，清脆，有韧性5分～7分 颜色略暗，呈黄绿色，光泽不明显部分组织软绵，部分保持清脆5分以下 颜色较暗，呈灰绿色，无光泽过酸或酸气较弱，稍有腐臭味香气很弱，腐臭味严重组织软绵无弹性
1.2.5.3 发酵性能评价
酸菜中亚硝酸盐测定采用盐酸萘乙二胺法[18]。总酸的测定同1.2.2。酸菜中的还原糖测定参照GB 5009.7-2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》。酸菜中的有机酸种类及含量测定参照GB 5009.157-2016《食品安全国家标准食品中有机酸的测定》。
1.3 数据统计
使用SPSS软件21.0和OriginLab OriginPro 2017 SR2进行分析。所有数据均以平均值±标准偏差（standarddeviation，SD）表示。对总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检索并对Nist2005和Wiley275标准质谱图进行核对，确定酸菜中挥发性风味成分，用峰面积归一化法确定各成分的相对质量分数。
2 结果与讨论
2.1 乳酸菌的分离
从10份酸菜汁样品中经MRS-CaCO3选择培养基3次划线分离共得到73株菌株，再经革兰氏染色镜检和过氧化氢酶阴性试验得到19株乳酸菌，分别编号为S1～S19，菌落形态描述见表3，部分菌株显微镜下形态见图1。
表3 乳酸菌菌落形态及生物学鉴定
Table 3 Colonial morphology of the isolated strains and authenticate
注：+表示阳性；-表示阴性。
菌株编号 菌落特征 革兰氏染色过氧化氢酶S1 圆形、白色菌落、不透明、光滑有凸起 + -S2 圆形、白色、中间凸起、边缘半透明 + -S3 圆形、白色、不透明、边缘整齐、有光泽 + -S4 圆形、白色半透明、边缘整齐、扁平 + -S5 圆形、白色不透明、边缘整齐、有凸起 + -S6 圆形、白色不透明、边缘波浪、有光泽 + -S7 圆形、白色不透明、边缘整齐、有光泽 + -S8 圆形、白色不透明、边缘整齐、有光泽 + -S9 圆形、白色不透明、边缘整齐、有光泽 + -S10 圆形、白色不透明、边缘整齐、有光泽 + -S11 圆形、白色不透明、边缘整齐、有光泽 + -S12 圆形、白色不透明、菌落较小、边缘整齐 + -S13 圆形、白色不透明、菌落较小、边缘整齐、有光泽+ -S14 圆形、白色不透明、边缘整齐、有光泽 + -S15 圆形、中间凸起、边缘半透明 + -S16 圆形、白色、不透明、边缘整齐、有凸起 + -S17 圆形、白色、不透明、边缘整齐、有光泽 + -S18 圆形、白色、不透明、边缘整齐、有凸起 + -S19 圆形、白色、不透明、边缘整齐、有色泽 + -
图1 部分菌株在显微镜下的菌体形态
Fig.1 Microbial morphology of some strains under microscope
2.2 各菌株产酸速度和产酸量
19株乳酸菌按0.15%接种24 h后的pH值变化如图2。
由于酸的产生和乳酸菌的生长能力有关，乳酸菌菌株的生长速率与测定到的pH值降低呈正相关，所以比较菌株的生长速率以及产酸量可反应乳酸菌的发酵性能[19]。试验数据表明，19株乳酸菌接种24 h后其培养液的pH值均显著下降，pH值在4.5以下的菌株为 S3、S5、S7、S9、S11、S12、S14、S17、S18，其中 S7 和S9最低，均为4.02±0.01。各菌株的产酸量如图3所示。
图2 各菌株接种24 h的pH值变化
Fig.2 pH changes of strains for 24 h
图3 菌株接种24 h的产酸量
Fig.3 Acid production of strains inoculated for 24 h
排在前五的菌株为 S3、S19、S7、S5、S4，产酸量分别达到1.87%、1.69%、1.54%、1.51%、1.49%。本文分离的乳酸菌产酸能力优于很多报告，牛文静等对分离自锦州腌渍小菜的28株耐盐性乳酸菌的产酸能力进行分析，结果显示pH值降低最显著的为4.6，最高产酸量为1.03%[20]，贾志成从酸菜中分离培养的菌株最大产酸量为1.08%[21]。
2.3 分离菌株发酵液的抑菌活性
本文用牛津杯法检测了19株乳酸菌分别对沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈，结果如表4。
除 S13、S15、S16 对沙门氏菌，S15、S16、S17 对单增李斯特菌没产生抑菌圈，其余均表现不同程度抑菌作用，且抑菌圈大小与产酸能力成正相关。乳酸菌在发酵过程中通过产酸可抑制其他腐败菌和致病菌的增殖，也有乳酸菌可以产生抗菌肽，是否存在产抑菌肽的菌株有待进一步筛选。
表4 分离菌株培养液的抑菌效果
Table 4 Strains inhibition effect of indicator bacteria
注：平均数±标准差，n=3；-表示无抑菌圈。
菌株编号抑菌圈直径/mm沙门氏菌 单增李斯特菌 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌S1 11.67±1.27 11.4±0.36 14.23±2.58 11.67±0.42 S2 12.3±2.1 11.33±0.47 13.77±0.45 14.33±0.87 S3 12.43±1.45 11.33±0.57 14.7±0.62 14.83±0.46 S4 13.83±1.56 11.7±0.50 16±2.52 14.17±2.51 S5 13.27±0.50 14.07±0.25 10.55±0.64 11.77±2.20 S6 9.5±1.04 8.7±0.26 15±0.95 10.8±0.46 S7 10.57±0.95 13.03±0.76 12.27±0.90 12.27±0.78 S8 11.17±0.65 12.23±1.82 12.9±2.07 10.83±0.93 S9 11.47±0.80 12.4±1.71 12.53±1.29 14.33±3.32 S10 9.47±0.35 11.27±0.55 11.67±0.61 14.13±1.39 S11 11.1±0.44 13.43±1.23 13.67±±3.99 11.2±0.46 S12 10.47±1.36 11.77±0.35 12.57±0.55 13.03±2.27 S13 - 13.3±1.27 13.35±1.34 11.95±1.34 S14 10.15±1.06 12.25±0.49 14.65±0.21 13.05±1.48 S15 - - 13.65±1.34 13.65±2.12 S16 - - 15.05±1.06 13.9±0.42 S17 10.05±2.19 - 11.55±0.21 16.1±1.13 S18 16.25±3.75 8.75±0.07 13.7±0.71 14.4±0.57 S19 13.2±0.85 14±0.28 12.1±0.14 16.9±0.14
2.4 16S rDNA菌株鉴定
综合产酸能力和抑菌活性，本文筛选S3、S5、S11、S18、S19做16S rDNA鉴定，结果如表5。
S3、S5、S11、S18、S19 分别与植物乳杆菌（L.plantarum K25）、植物乳杆菌（L.plantarum KC28）、植物乳杆菌（L.plantarum X7021）、植物乳杆菌（L.plantarum K259）、植物乳杆菌（L.plantarum 7-5）同源性 100%。16S rDNA基因序列比对中，最低同源性为95%属于同一个属[22]，当同源性＞97%时，属于同一个种[23]，无疑，这5株菌均为植物乳杆菌（L.plantarum）。天然发酵酸菜中后期植物乳杆菌是优势菌群，主导发酵过程[24]，所以不少学者在酸菜中分离出植物乳杆菌。赵山山等从传统东北酸菜中分离出5株性能优良的菌株，经鉴定均为植物乳杆菌[25]。
2.5 发酵性能评价
2.5.1 酸菜成品感官评价
将分离鉴定的5株植物乳杆菌作为酸菜发酵剂，经过20 d发酵，得到5份酸菜样品，感官评价得分如表6。
表5 5株性能良好菌株的16S rDNA鉴定结果
Table 5 Results of 16S rDNA identification
编号 鉴定参考菌 最高分 总分 NCBI序列比对/% 最高相似度/% 登记号S3 植物乳杆菌K25 2 789 13 909 100 99 CP020093.1 S5 植物乳杆菌KC28 2 795 13 953 100 100 CP026743.1 S11 植物乳杆菌X7021 2 784 13 886 100 100 CP025412.1 S18 植物乳杆菌K259 2 798 13 949 99 100 CP025590.1 S19 植物乳杆菌7-5 2 459 13 893 100 100 MG890195.1
表6 酸菜样品感官评分
Table 6 Sensory evaluation scores of fermented sauerkraut samples
样品 分值色泽 香气 组织状态 总分S3 8.3±0.8 8±1.0 7.8±0.9 24.1±1.8 S5 7.7±1.0 7.9±0.8 7.5±1.2 23.1±2.5 S11 8.3±0.5 7.5±1.5 7.2±0.9 23±2.2 S18 7.8±1.4 7.5±1.2 7.6±1.0 22.9±3.0 S19 7.9±0.9 7.6±0.9 7.3±1.1 22.8±2.3
5份酸菜样品均具有东北传统发酵酸菜的柔和酸味和香气，且口感爽脆，菜心嫩黄色，菜帮半透明有光泽，无腐烂。其中S3样品的感官评分最高，且色泽、气味和组织状态评分都高于其他样品，从感官评分认定为最优菌株。
2.5.2 酸菜样品中的亚硝酸盐、总酸和还原糖含量
酸菜样品中的亚硝酸盐、总酸和还原糖含量见图4。
图4 酸菜样品中的亚硝酸盐、总酸和还原糖含量
Fig.4 The nitrite content，titrate acid content and sugar content
亚硝酸盐含量是评判酸菜质量及其食用安全性的一个重要因素。我国国家标准规定腌制蔬菜中亚硝酸盐（以NaNO2计）含量不能超过20 mg/kg，而绿色食品中不能超过4 mg/kg。本研究用筛选的乳酸菌发酵酸菜20d，5个样品亚硝酸盐含量为5.7mg/kg～10.2mg/kg，都符合国标。孟繁博等[26]研究3种商业乳酸菌（鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌）按等量配比，3%接种量，在发酵第8天亚硝酸盐降至6.05 mg/kg，虽然本文是20 d发酵，但也达到了理想的降亚硝酸盐效果。乳酸菌对亚硝酸盐的降解分为NiR降解和酸降解，pH值低于4.0后，亚硝酸盐主要以酸降解为主，乳酸菌的产酸能力与降解亚硝酸盐能力成正相关[27]。本文筛选的乳酸菌降解亚硝酸盐能力应该归功于于其产酸能力。酸味是酸菜的主体风味，可以给人爽口的感觉，并且具有开胃解腻、促进消化等功效，而总酸是表征酸菜酸味的理化指标，本文5种样品的总酸含量分别为 （5.84±0.72）、（5.24±0.71）、（6.41±0.69）、（6.3±0.1）、（5.34±0.57）g/100 g。随着发酵的进行，乳酸菌不断利用还原糖产生乳酸等一系列代谢产物，蔬菜中的还原糖因消耗而含量不断降低，可间接反应乳酸菌的发酵性能。沈昳潇等比对了腌渍过程还原糖的变化情况，测得鲜白菜中还原糖含量为1.22%，腌制19 d时含量降至最低，此后不再能检出[28]。马欢欢等研究报道发酵从0 d～15 d还原糖含量较高，为乳酸菌大量繁殖提供了丰富的营养物，随着乳酸菌数量增加，在发酵15 d～20 d，还原糖含量由1.93%下降到0.10%[8]。本文在腌制前测得白菜中还原糖含量为2.39%，腌制20 d后测得5种样品中的还原糖含量分别为（0.54±0.3）%、（0.72±0.21）%、（0.53±0.17）%、（0.52±0.3）%、（0.68±0.62）%，结果与文献报道基本一致。
2.5.3 有机酸测定结果
许多文献报道，草酸、琥珀酸、柠檬酸、乳酸、醋酸是酸菜中的主要有机酸[29]。柠檬酸温和且具有新鲜感；乳酸稍带涩感、酸度较高；醋酸和草酸具有刺激性；而琥珀酸具有鲜味[30]。酸菜中的有机酸含量测定结果如表7所示。
表7 酸菜中的有机酸含量
Table 7 Organic acids contents of sauerkraut
注：平均数±标准差，n=3。
样品编号琥珀酸/（mg/g）S3 1.82±0.11 25.65±0.96 2.7±0.13 2.24±0.11 9.38±0.86 S5 5.03±0.52 23.45±1.02 2.46±0.18 2.02±0.05 1.08±0.46 S11 3.22±0.14 20.21±0.96 2.16±0.20 1.82±0.16 0.82±0.06 S18 1.7±0.08 14.1±0.75 24.73±1.3 4.91±0.21 0.71±0.05 S19 1.21±0.09 12.68±0.29 17.52±0.86 2.42±0.22 1.73±0.20草酸/（mg/g）乳酸/（mg/g）醋酸/（mg/g）柠檬酸/（mg/g）
5个样品中乳酸是主要有机酸，分别为（25.65±0.96）、（23.45±1.02）、（20.21±0.96）、（14.1±0.75）mg/g和（12.68±0.29）mg/g，乳酸在东北酸菜酸感形成中起主导作用。马艺荧等[31]采用自然发酵法研究东北酸菜不同发酵时间有机酸变化及对产品酸感的影响，结果表明酸菜中的乳酸随发酵时间而含量不断增高，在发酵120 d时达到（15.25±0.11）mg/g。与传统发酵相比，筛选的乳酸菌直投发酵20 d就达到相当的乳酸含量，大大缩短了发酵时间。S18和S19醋酸含量也较高，分别达到（24.73±1.3）mg/g和（17.52±0.86）mg/g，可能在发酵过程中污染了醋酸菌。蔬菜含有大量的草酸，能够干扰钙等矿物元素吸收，是典型的抗营养因子。马艺荧等[31]研究报道，草酸在发酵过程中可从起初占有机酸比例的83.96%降至3.08%。本文结果在发酵20d后，草酸含量仅为（1.21±0.09）mg/g～（5.03±0.52）mg/g，占所测的5种有机酸总量在5%以下，直投发酵有效降解了白菜中的草酸。S3样品中琥珀酸含量最高，为（9.38±0.86）mg/g，远远超过其他4个样品[（1.08±0.46）、（0.82±0.06）、（0.71±0.05）mg/g 和（1.73±0.20）mg/g]，而琥珀酸可以提升酸菜的鲜味和愉悦的口感，这些有机酸含量及比例合适时对东北酸菜酸感柔和起到促进作用，反之会破坏酸感柔和。在感官评价中，S3样品获得最高评分，与其最佳的有机酸比例相关。
3 结论
东北传统发酵酸菜是天然的乳酸菌资源库，从中可以分离到性能优良的乳酸菌菌株。本研究从传统发酵酸菜中分离出73株乳酸菌，通过产酸能力、抑菌活性、降解亚硝酸盐等筛选鉴定获得5株发酵性能优良的菌株，经16S rDNA鉴定均为植物乳杆菌（L.plantarum），其中S3号菌株性能最优。通过作为直投发酵剂发酵酸菜评价，筛选的乳酸菌可利用发酵基质中还原糖作为能量快速增殖，降低发酵体系的pH值，有效降解酸菜中亚硝酸盐和草酸含量，在20℃～25℃发酵20 d即可具备酸菜的美好风味，比传统发酵时间大大缩短。菌株的遗传稳定性和其他耐受性能还需要进一步研究，为开发利用奠定理论基础。
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