木质素是植物细胞壁的重要组成部分，是一种非多糖高分子物质，在自然界中的产量仅次于纤维素[1]。木质素主要由愈创木基丙烷单元、紫丁香基丙烷单元和对羟基苯丙烷单元通过碳碳键和醚键联接聚合而成[2]，分子量 600 kDa～1 500 kDa[3]。木质素主要存在于植物的木质结构中，使细胞壁硬化，增加细胞的刚性[4]。在植物细胞壁中，木质素和半纤维素之间相互作用形成牢固的结合层将纤维素包埋其中，由于木质素的非水溶性，使酶与纤维素不能良好接触，限制了消化酶对细胞壁及细胞内容物的分解功能[5]。木质素是所有天然有机产物中最难降解的物质[6]。
相关研究表明，木质素采用物理法、化学法处理时存在能耗高、“二次污染”等缺陷；而微生物降解木质素具有专一性强和无环境污染等特点，具有良好的应用前景[7]。自然环境下，木质素降解是由多种微生物共同作用的结果，降解能力由强到弱依次为真菌、放线菌和细菌。真菌中属白腐菌对木质素降解能力最强，可以将木质素完全降解为CO2 和H2O[8]。白腐菌在降解天然木质纤维素时，先降解半纤维素，以产生大量的碳源供菌丝生长，然后开始降解木质素，最后半纤维素、木质素和纤维素三者同时被降解[9]。
木质素高聚物在微生物产生的木质素降解酶作用下，断裂结构单元间连接键，从而分解为低分子物质。木质素降解酶系主要包括漆酶（laccases，Lac）、锰过氧化物酶（manganese peroxidase，Mnp）和木质素过氧化物酶（lignin peroxidase，Lip）。漆酶在降解木质素时，同时催化解聚和聚合反应；在Lip 或Mnp 等其他酶协同作用时，以抑制产物重新聚合，会提高木质素降解效率[10-11]。漆酶广泛用于染料脱色，纸浆漂白以及畜牧业生产中。本研究从铁皮石斛生长的树皮中筛选到1 株产木质素降解酶的真菌——白黄小脆柄菇，并对其产漆酶条件进行优化，为后续白腐菌漆酶的工业化生产和应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 培养基
PDA 培养基（g/L）：去皮马铃薯 200，葡萄糖 20，琼脂20；苯胺蓝-PDA 培养基：灭菌后添加用无菌过滤器加入0.1 g/L 苯胺蓝[12]；愈创木酚-PDA 培养基：灭菌加入0.4%的愈创木酚[13]；初始产酶培养基（g/L）：去皮马铃薯 200，葡萄糖 20，蛋白胨 2，KH2PO4 1，酒石酸铵0.02，CuSO4 0.01，MgSO4 0.3，MnSO4 0.03。
1.1.2 主要试剂与仪器
葡萄糖、蛋白胨、乙酸、乙酸钠、酒石酸铵、KH2PO4、MnSO4、CuSO4、MgSO4：西陇化工股份有限公司，以上化学试剂皆为分析纯；ABTS：aladdin 公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增试剂及扩增引物：湖南擎科生物技术有限公司；SW-CJ-1D 型超净作台：江苏苏洁净化设备厂；SKY-2112B 型恒温双层摇床：上海苏坤仪器仪表有限公司。
1.2 菌种分离
取1 g 铁皮石斛生长的腐木用研钵研碎，加入9 mL的无菌水稀释，放入200 r/min 的振荡器中振荡1 h，制成10-1 腐木悬液，10 000 r/min 离心10 min，取上清液，依次10 倍递增系列稀释至10-6，每个梯度的样品取100 μL 接种到苯胺蓝-PDA 培养基上，置于 30 ℃培养箱中培养，培养10 d，后挑取在苯胺蓝-PDA 平板上有退色变化的单一菌种再接种到愈创木酚-PDA 培养基上，置于30 ℃培养箱中培养，培养10 d。培养基中苯胺蓝和愈创木酚分别可以检测过氧化物酶和漆酶的产生与否，通过两种培养基可以得到同时产过氧化物酶和漆酶的菌株。
1.3 菌种的鉴定
在筛选培养基上培养选出的单一菌株转接至PDA 培养基，30 ℃培养5 d～7 d，挑取菌丝在显微镜下观察其菌丝形态。
挑取筛选出的菌株的菌丝采用CTAB 法提取总DNA，采用真菌通用引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR 反应体系（50 μL）：PCR Mix 25 μL，ITS1（10 μmol/L）2μL，ITS4 （10 μmol/L）2 μL，Template 1 μL，ddH2O 20 μL。反应条件：①98 ℃，2 min，②98 ℃，10 s，54 ℃，10 s，72 ℃，10 s，35 个循环，③72 ℃，5 min。引物合成和 PCR 扩增产物测序由湖南擎科生物技术有限公司完成。菌株序列与GenBank 数据库序列进行相似性分析，并加入Phanerochaete chrysosporium （黄孢原毛平革菌——白腐真菌中对木质素降解研究最透彻的模式菌株[8，14]）的rDNA-ITS 基因序列作为外参，并用MEGA 6.06 软件包中 Neighbor-joining （kimura'2-parameter modle，bootstrap 1000）法构建系统发育树。
1.4 菌株液体发酵
保藏于PDA 斜面的菌株SHIHU-X2，经新制的PDA 培养基平板上活化，28 ℃下培养7 d，在菌株活化后的平板上用无菌打孔器制造出直径为5 mm×5 mm菌塞块，将10 个菌块转接到50 mL 的产酶培养基中（250 mL 三角瓶），30 ℃摇床培养 5 d，5 000 r/min，离心10 min 取上清液测定木质素降解酶活力。
1.5 木质素降解酶培养基的优化
对初始产酶培养基发酵液Mnp、Lip 和Lac 进行测定，比较3 种木质素降解酶活的大小，确定以漆酶产量为评价指标来优化SHIHU-X2 产木质素降解酶培养基。
1.5.1 Plackett-Burman 试验设计
Plackett-Burman 试验可以快速地从众多的因素中有效地确定最主要的几个因素，供进一步研究[15]。分别从蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、MnSO4、酒石酸铵 CuSO4 6 个因素中筛选出对菌株SHIHU-X2 产漆酶影响最重要的几个因素。采用Design-Expert 8.0.5 设计试验，进行N=12 次试验，其中添加5 组为虚拟变量，以漆酶产量为评价指标。试验设计见表1。
表1 Plackett-Burman 设计因子水平及编码
Table 1 The two levels of variables used in the Plackett-Burman design
变量因素/（g/L）低水平（-1）高水平（1）A蛋白胨 2 3 B KH2PO4 1 1.5 C MgSO4 0.3 0.45 D MnSO4 0.03 0.045 E酒石酸铵 0.02 0.03 F CuSO4 0.01 0.015 G，H，I，J，K 虚拟变量
1.5.2 最陡爬坡试验
根据Plackett-Burman 试验结果得到3 个对白黄小脆柄菇产Lac 关键因素为蛋白胨、MgSO4 和MnSO4，KH2PO4、酒石酸铵和CuSO4 取初始浓度，然后按梯度减少蛋白胨的浓度，并按梯度增加MgSO4 和MnSO4的浓度，测定发酵液的Lac 活力的变化，从而确定此3个因素的最适浓度范围。
1.5.3 Box-Behnken 设计
以Plackett-Burman 试验筛选得到的对发酵液的Lac 影响显著的因素作为设计因素，以最陡爬坡试验得出的浓度作为中心点，根据表2进行试验，进行三因素三水平，共17 个试验组响应面试验设计，以发酵液的漆酶产量为响应值。
表2 Box-Behnken 设计水平表
Table 2 Levels of variables used in the Box-Behnken design
水平A 蛋白胨/（g/L）B MgSO4/（g/L）C MnSO4/（g/L）-1 1 0.5 0.05 0 1.25 0.55 0.055 1 1.5 0.6 0.06
1.6 酶活的测定
取1 mL 发酵液用蒸馏水稀释10 倍后测定其木质素降解酶活力，以沸水浴30 min 的酶液作空白对照。木质素过氧化物酶（Lip）活力测定用黎芦醇法[16]，锰过氧化物酶（Mnp）活力测定用 MnSO4 法[17]，漆酶（Lac）活力测定用ABTS 法[18]。酶活力定义为每分钟氧化1 μmol底物所需的酶量为1 个酶活力单位（U）。
酶活的计算方法：酶活力（U/mL）=（ΔOD×106×n×10-3）/（Δt×ξ）。式中：n 为发酵液稀释倍数；ΔOD 为吸光度变化；106 为将 mol 换算成 μmol 的系数；Δt 为反应时间，min；ξ 为摩尔消光数，L/（M·cm）；ABTS 氧化产物的摩尔吸光系数为3.6×104 L/（M·cm），三价锰离子的摩尔吸光系数为8.1×103 L/（M·cm），藜芦醛的摩尔吸光系数9.3×103 L/（M·cm）。
2 结果与分析
2.1 木质纤维素降解菌的筛选结果
苯胺蓝脱色法对检测降解木质素的过氧化物酶类专一性强，能有效的检测出木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶等过氧化物类型酶[19]。愈创木酚定性的测定菌株是否能降解木质素具有漆酶活性的菌株，可在菌落周围形成鲜艳而均匀的红棕色氧化圈，氧化圈的大小和颜色的深浅可以很好地反映出漆酶的活性大小[20-21]。菌株SHI-X2 在苯胺蓝-PDA 平板上的退色和愈创木酚-PDA 平板显色反应见图1。
图1 苯胺蓝-PDA 平板褪色反应和愈创木酚-PDA 平板显色反应图
Fig.1 Fading reaction on aniline blue-PDA plates and color reaction on guaiacol-PDA plates
由图1可知，愈创木酚对SHI-X2 有一定的抑制作用，在愈创木酚-PDA 平板上生长缓慢，但红棕色圏比菌落大很多，说明可以产漆酶能力较强；在苯胺蓝-PDA 平板生长正常，裸色圈直径大于菌落直径，说明具有良好的产降解木质素过氧化物酶的能力。
2.2 SHIHU-X2的鉴定
显微镜观察菌丝状况如图2所示。
图2 SHIHU-X2 的菌丝
Fig.2 The mycelium of SHIHU-X2
SHIHU-X2 形态结构观察：菌株SHIHU-X2 在培养的过程，菌落中心突起，菌丝呈白色。
将菌株ITS1～ITS4 序列测定结果与2018年4月的NCBI 中数据库进行BLASTn 序列比对分析，选取结果中相似度最高的菌属作为对应菌株分类标准，绘制系统进化树，见图3。
图3 菌株SHIHU-X2 基于ITS1～ITS4 序列的系统发育树
Fig.3 The phylogenetic position based on ITS1-ITS4 sequences of strain SHIHU-X2
利用MEGA 6.06 构建菌株系统发育树，菌株SHIHU-X2 的 ITS1～ITS4 序列基因序列与 Psathyrella属的菌株rDNA-ITS 基因序列相似度为99%，与登入号MF401519.1 的白黄小脆柄菇菌亲缘关系最为相近，Bootstrap 支持率达到93%。因此将该菌株SHIHUX2 初步鉴定为白黄小脆柄菇。
2.3 液体发酵液酶活结果
测定初始产酶培养基发酵液的3 种木质素降解酶 Mnp、Lip 和 Lac，结果发现 Mnp、Lip 的酶活为2.47×10-3 U/mL，1.86×10-3 U/mL，Lac 的酶活是 1.11 U/mL，与傅恺[22]的研究类似，白黄小脆柄菇的Mnp、Lip 产量较小，Lac 产量较大，所以将以Lac 为指标优化SHIHUX2 产酶培养基。
2.4 Plackett-Burman试验设计结果与分析
Plackett-Burman 试验设计结果见表3，采用Design-Expert 8.05 软件对表3中的Lac 产量数据进行回归分析，见表4。
表3 Plackett-Burman 试验设计与结果
Table 3 Plackett-Burman experiment design and response values
试验号ABCDEFGHIJKLac/（U/mL）1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1.44 2 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 1.98 3 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1.80 4 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 1.68 5 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 2.10 6 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 1.90 7 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 0.80 8 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1.62 9 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1.34 10 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 2.13 11 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 2.00 12 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 1.20
表4 Plackett-Burman 试验显著性方差分析
Table 4 Analvsis of variance of the Plackett-Burman tests
变量 回归系数 标准误差 F 值 p 值 贡献值/% 重要性A 蛋白胨 -0.165 8 0.073 5.212 0.071 3 18.20 2 B KH2PO4 0.032 5 0.073 0.200 0.673 3 0.70 5 C MgSO4 0.225 8 0.073 9.666 0.026 6 33.75 1 D MnSO4 0.159 2 0.073 4.802 0.080 0 16.77 3 E 酒石酸铵 0.000 8 0.073 0.000 0.991 3 0.00 6 F CuSO4 0.140 8 0.073 3.759 0.110 2 13.13 4
由表4可知，在白黄小脆柄菇产Lac 的过程中，在a=0.10 的显著水平上，蛋白胨、MgSO4 和MnSO4 对 Lac产量影响显著。其中MgSO4 和MnSO4 的浓度对产Lac是正效应，蛋白胨为负效应，因此将KH2PO4、酒石酸铵和CuSO4 取低水平，以蛋白胨、MgSO4 和MnSO4 作为主要因素进一步做优化试验。
2.5 爬坡试验设计与结果
最陡爬坡试验设计及其结果见表5。
表5 最陡爬坡试验设计及其结果
Table 5 Steepest ascent path design and results
试验号 蛋白胨/（g/L）MgSO4/（g/L）MnSO4/（g/L）Lac/（U/mL）1 2.00 0.40 0.040 2.09 2 1.75 0.45 0.045 2.17 3 1.50 0.50 0.050 2.28 4 1.25 0.55 0.055 2.32 5 1.00 0.60 0.060 1.73 6 0.75 0.65 0.065 1.70
如表5所示，随着蛋白胨、MgSO4 和MnSO4 浓度的变化，发酵液的Lac 酶活先升后降，当蛋白胨、MgSO4和 MnSO4 浓度分别为 1.25、0.55 g/L 和 0.055 g/L 时，发酵液的Lac 酶活达到最大值，以此浓度作为中心点，进行下一步响应面优化试验。
2.6 响应面优化试验
2.6.1 Box-Behnken 试验结果
以蛋白胨、MgSO4 和MnSO4 3 个重要因素为自变量，采用Box-Behnken 试验设计对产Lac 的发酵培养基进行优化，设计了17 个试验组，各因素水平选择以及结果见表6。
表6 BOX-Behnken 试验设计和结果
Table 6 Experimental design and results of Box-Behnken tests
试验号A 蛋白胨B MgSO4C MnSO4 Lac/（U/mL）1-1 -1 0 1.54 2 1-1 0 1.59 3-1 1 0 1.89 4 1 1 0 1.84 5-1 0 -1 1.72 6 1 0-1 1.51 7-1 0 1 2.06 8 1 0 1 2.01-1 -1 1.54 10 0 1 -1 1.76 11 0 -1 1 1.69 12 0 1 1 2.02 13 0 0 0 2.34 14 0 0 0 2.28 15 0 0 0 2.27 16 0 0 0 2.12 17 0 0 0 2.05 9 0
2.6.2 模型的建立与显著性检验
利用Design Expert 8.05 软件分析Box-Behnken试验结果，通过对数据进行二次多元回归拟合，得到自变量与粗纤维降解率（Y）对得到二次多项式方程：Y=2.21－0.032A＋0.14B＋0.16C－0.025AB＋0.040AC＋0.028BC－0.21A2－0.28B2－0.17C2，此模型的方差分析见表7。
表7 模型回归方程方差分析
Table 7 Analysis of variance of regression equations
注：R2=0.923 8，R2Adj=0.825 8，* 代表显著（p＜0.05），** 代表极显著（p＜0.01）。
因素来源 平方和 自由度 均方 F 值 p 值 显著性模型 1.115 262 9 0.123 918 9.426 584 0.003 7 **A 0.008 45 1 0.008 45 0.642 801 0.449 1 B 0.165 313 1 0.165313 12.575 51 0.009 4 **C 0.195 313 1 0.195 313 14.857 64 0.006 3 **AB 0.002 5 1 0.002 5 0.190 178 0.675 9 AC 0.006 4 1 0.006 4 0.486 855 0.507 8 BC 0.003 025 1 0.003 025 0.230 115 0.646 1 A2 0.190 082 1 0.190 082 14.459 74 0.006 7 B2 0.341 933 1 0.341 933 26.011 25 0.001 4 C2 0.128 906 1 0.128 906 9.806 057 0.016 6残差 0.092 019 7 0.013 146失拟项 0.031 875 3 0.010 625 0.706 636 0.596 3纯误差 0.060 144 4 0.015 036
2.6.3 响应面分析
图4～图6是由响应值和试验因素构成间的三维响应面图，显示了蛋白胨、MgSO4和MnSO4 中任意1 个变量取零水平时，其余两个变量对漆酶活力的影响。
图4 蛋白胨与MgSO4 对漆酶产量的影响
Fig.4 Effect of peptone and MgSO4 on laccase production
由图4可知，在试验水平范围内，当蛋白胨为某一定值时，随着MgSO4 的增大，漆酶活力呈现先上升后下降，变化范围较大，特别是在到达0 点之前上升趋势明显，超过0 点之后下降较缓；当MgSO4 浓度一定时，随着蛋白胨的增大，漆酶活力呈现先上升后下降，变化范围较小，结合等高线的疏密程度，说明MgSO4 比蛋白胨对漆酶活力的影响更显著。
图5 蛋白胨与MnSO4 对漆酶产量的影响
Fig.5 Effect of peptone and MnSO4 on laccase production
由图5可知，在试验水平范围内，当蛋白胨为某一定值时，随着MnSO4 的增大，漆酶活力呈现先上升后下降，上升时坡度较大，下降时坡度较缓；当MgSO4 浓度一定时，随着蛋白胨的增大，漆酶活力呈现先上升后下降，变化范围较小，结合等高线的疏密程度，说明MgSO4 比蛋白胨对漆酶活力的影响更显著。
图6 MgSO4 与MnSO4 对漆酶产量的影响
Fig.6 Effect of MgSO4 and MnSO4 on laccase production
由图6可知，在试验水平范围内，当MgSO4 为某一定值时，随着MnSO4 的增大，漆酶活力呈现先上升后下降，且上升趋势明显；当MnSO4 浓度一定时，随着MgSO4 浓度的的增大，漆酶活力呈现先上升后下降，变化的趋势更缓慢，结合等高线的疏密度，说明MnSO4的主效应大于MgSO4。
2.6.4 最佳培养基的确定及验证试验
通过Design-Expert 软件对回归方程求解得到模型最大值，即蛋白胨1.24 g/L，MgSO4 0.56 g/L，MnSO4 0.057 g/L，此时发酵液的漆酶活力最大值为2.27 U/mL。
在预测最佳培养基配方条件下进行发酵试验，做3 个重复，所得的实际发酵液漆酶活力为2.32 U/mL，与预测值2.27 U/mL 接近，说明该模型能较好的预测实际发酵情况。
3 结论与讨论
采用苯胺蓝-PDA 平板法和愈创木酚-PDA 平板法从从铁皮石斛生长的树皮中筛选到菌株SHIHUX2，经ITS 测序分析将SHIHU-X2 鉴定为白黄小脆柄菇。采用Plackett-Burman 法从6 个因素中筛选对SHIHU-2 产漆酶影响最重要因素，结果表明，蛋白胨、MgSO4、MnSO4和对白黄小脆柄菇液体发酵产漆酶活力影响较大。在此基础上，用最陡爬坡试验及Box-Behnken 设计进一步优化，利用Design-Expert 软件进行二次回归分析，得到各因素的最佳浓度为蛋白胨1.24 g/L，MgSO4 0.56 g/L，MnSO4 0.057 g/L，在此条件下实际发酵液漆酶活力可达到2.32 U/mL，所得值与模型预测值2.27 U/mL 相接近，较初始产酶培养基的漆酶活力提高了109%。
傅恺[22]以去皮马铃薯300 g/L，葡萄糖20 g/L，KH2PO4 3 g/L，MgSO4 3 g/L 为培养基，液体培养白黄小脆柄菇，其野生菌株培养至第6 天漆酶活力达高峰1.48 U/mL；经紫外诱变选育到的漆酶高产诱变菌株U10-11 培养至第3 天时漆酶活力高峰4.63 U/mL。张丽等[23]以去皮马铃薯 300 g/L，葡萄糖 20 g/L，KH2PO4 3 g/L，MgSO4 3 g/L 为培养基，液体培养白黄小脆柄菇，培养至第3天漆酶活力达高峰31 525 IU/L。白腐菌白黄小脆柄菇可以产生少量锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶，尤其是产漆酶潜力巨大，若通过基因工程等手段选育出漆酶高产的工程菌株，则有望应用到漆酶大规模工业化生产中。
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