中国是全球较早的茶叶出产和销售的国家，也是全球最大的茶叶消费国，随着经济全球化发展，茶叶的出口量也持续增加。蒽醌在自然界中广泛存在，茶叶中蒽醌的残留污染可能来源于农药残留或产品包装。因欧盟认为蒽醌具有致癌性，2014年10月，欧盟新发布的（EU）No1146/2014 中规定了茶叶中蒽醌的最高限量为0.02 mg/kg[1]。我国尚无最高限量要求。2014年我国茶叶出口同比下降。中国输欧茶叶因不符合限值要求被通报27 次，其中蒽醌8 次，居首位[2]。研究茶叶中蒽醌的污染来源和控制技术，降低茶叶中蒽醌污染物含量，破除欧盟技术壁垒是一个急需解决的问题，因此，建立茶叶中蒽醌的定量检测方法至关重要。
9，10-蒽醌，又名蒽醌（anthraquinone，CAS No.84-65-1），是一种黄色针状结晶，易溶于热苯、热甲苯、乙醇、乙醚和氯仿，不溶于水，蒽醌常存在于高等植物和低等植物地衣类和真菌类的代谢产物中，主要用于染料生产的中间体，是媒染染料、酸性染料和还原染料的主要原料。还用做纸制品印花的导氧剂。GB/T 23204-2008《茶叶中519 种农药及相关化学残留量的测定气相色谱-质谱法》[3] 涉及蒽醌残留量的测定，但为定性检测方法，不适合于茶叶中微量蒽醌的测定。目前报道的蒽醌类定量测定的方法主要有分光光度法[4-7]、高效液相色谱法[8-10]、气相色谱-质谱联用法[11]、气相色谱-串联质谱法[12-16]、高效毛细管电泳法[17]等。其中分光光度法和高效液相色谱法多为测定总蒽醌含量，不适合于茶叶中蒽醌的测定；气相色谱-质谱法和气相色谱-串联质谱法多为凝胶联合净化或SPE 小柱净化，能够较好的纯化分离出目标物，但净化过程比较繁琐，耗时较长；高效毛细管电泳法普及率比较低。本研究通过对样品前处理条件、色谱条件等的优化，建立了一种准确、快速测定茶叶中蒽醌的气相色谱-串联质谱法（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）内标分析方法。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Agilent 7010 三重四极杆气质谱联用仪[配电子轰击离子源（EI）]：美国 Agilent 公司；N-EVAP 112 氮吹浓缩仪：美国 OA-SYS 公司；CP-225D 电子天平：德国Sartorius 公司；ST-16R 高速冷冻离心机：美国Thermo公司；KS-500D 型超声波清洗器：宁波科生仪器厂；Milli-Q 超纯水系统：美国Millipore 公司。N-丙基乙二胺（Bondesil-PSA，40 μm，100 gm）、Bondesil-C18（40 μm，100 mg）：美国 Agilent 公司。无水硫酸钠（AR 级）：国药集团化学试剂有限公司；乙腈（HPLC 级）、丙酮（HPLC级）、环己烷（HPLC 级）、乙酸乙酯（HPLC 级）：德国Merck 公司；蒽醌（纯度≥98.0%）：上海安谱公司；蒽醌-D8 标准物质（纯度＞99.0%）：美国TRC 公司。
1.2 标准工作液的配制
称取0.010 0 g 蒽醌，加丙酮超声、溶解、稀释定容至10 mL，浓度为1 000 μg/mL，即为蒽醌标准储备液。取蒽醌标准储备液10 μL，加环己烷-乙酸乙酯（1+1）至 10 mL，即为蒽醌应用液，浓度为 1 μg/mL，于 0 ℃～4 ℃冰箱内避光保存。称取0.010 0 g 蒽醌-D8 标准物质，加丙酮超声、溶解、稀释定容至10 mL；再取100 μL，加环己烷-乙酸乙酯（1+1）至 1 mL，即为蒽醌-D8 内标应用液，浓度为 100 μg/mL，于 0 ℃～4 ℃冰箱内避光保存。
1.3 试验方法
1.3.1 色谱条件
色谱柱：HP-5MS（30 m×250 μm，0.25 μm）；载气：高纯氦气，纯度＞99.999%，恒流模式，进样口温度：280 ℃；流速1.0 mL/min；程序升温：初温100 ℃，保持1 min，以 10 ℃/min 升到 200 ℃，保持 2 min，继续以 25 ℃/min升到 280 ℃，保持 10 min；进样量：1 μL；进样方式：不分流进样。
1.3.2 质谱条件
电离方式：电子轰击离子源（EI）；离子源温度：230 ℃；接口温度：300 ℃；电子能量 70 eV；碰撞气：高纯氩气，纯度＞99.999%，；溶剂延迟：3.75 min；扫描方式：多反应监测模式（multiple reaction monitoring，MRM）扫描模式；驻留时间：0.10 s。标准的保留时间、定性离子、定量离子对等具体质谱参数见下表1。
表1 标准的质谱参数表
Table 1 The mass spectrometry parameters of standards
化合物名称 保留时间/min离子对（m/z）碰撞能量/eV 驻留时间/s蒽醌 14.136 208＞180 10 0.10 208＞152 10 0.10蒽醌-D8 14.026 216＞188 10 0.10
1.3.3 样品前处理
将100 g 茶叶用粉碎机粉碎，混匀，分装于两个50 mL 洁净棕色玻璃瓶中，一份用于遮光密闭保存留样，另外一份用于检测。
1.3.3.1 样品提取
精确称取2 g（精确至0.001 g）粉碎、混匀茶叶样品于50 mL 离心管中，加水3 mL，加蒽醌-D8 内标应用液 10 μL，涡旋 30 s 润湿样品，加 10 mL 乙腈，超声提取30 min，加无水硫酸钠2 g，涡旋混匀1 min，以8 000 r/min 离心10 min。上清液待净化。
1.3.3.2 样品QuEChERS 净化
取乙腈提取液约8 mL，加入0.8 g 无水硫酸钠，0.8 g PSA 粉末和0.4 g C18 固相吸附剂，涡旋1 min，8 000 r/min 离心 5 min。取上清液 5.0 mL，40 ℃氮吹浓缩至近干，加1.0 mL 乙腈溶解残渣，涡旋1 min，以8 000 r/min 离心 5 min，上清液过 0.22 μm 聚四氟乙烯过滤膜，待测定。
1.3.4 标准曲线绘制
分别准确吸取1.2 中蒽醌标准应用液（1 μg/mL）10、20、50、100、150、200 μL 于 1 mL 样品瓶中，分别各加入蒽醌-D8 内标应用液（100 μg/mL）5 μL，用乙腈定容至 1 mL，蒽醌-D8 的浓度为 0.50 μg/mL，蒽醌标准系列溶液浓度为 10、20、50、100、150、200 ng/mL。以蒽醌的浓度为横坐标，定量离子对（208＞180）的峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标绘制标准曲线。标准总离子流图见图1。
图1 标准总离子流图
Fig.1 The total ion chromatogram of standard
2 结果与讨论
2.1 色谱条件的选择与优化
由于茶叶中基质复杂，测定茶叶中蒽醌必须选择能够很好的把目标物与干扰物分离的色谱柱，试验比较了 HP-5MS、DB-5MS、DB-1701P 3 种不同的色谱柱，DB-5MS、DB-1701P 和 HP-5MS 3 种色谱柱的样品加标色谱图见图2、图3、图4。
改变色谱分离条件，观察分离情况，不同色谱柱对目标物的分离情况见下表2。
表2 结果表明，HP-5MS 较其他两种色谱柱分离效果更好。
进样口温度过高，会致使蒽醌分解，温度过低，蒽醌汽化不完全，灵敏度均会下降。考查了240 ℃到290 ℃之间的进样口温度，不同进样口温度对蒽醌峰面积的影响见图5。
由图5 发现温度在280 ℃时，蒽醌气化完全，未见分解。
2.2 质谱条件的选择与优化
图2 DB-5MS 样品加标色谱图
Fig.2 The total ion chromatogram of adding sample separating by DB-5MS chromatographic column
图3 DB-1701 样品加标色谱图
Fig.3 The total ion chromatogram of adding sample separating by DB-1701 chromatographic column
图4 HP-5MS 样品加标色谱图
Fig.4 The total ion chromatogram of adding sample separating by HP-5MS chromatographic column
表2 不同色谱柱的分离情况
Table 2 The separation results of adding sample by different chromatographic columns
是否分离到基线HP-5MS 14.136 805 614 13.588、13.810 是DB-5MS 13.812 768 254 13.310、13.912 否DB-1701P 13.602 748 396 13.510、13.668 否色谱柱 蒽醌保留时间/min 蒽醌峰面积 干扰物保留时间/min
图5 不同进样口温度对蒽醌峰面积的影响
Fig.5 The effect of different inlet temperatures on anthraquinone peak area
在优化的色谱条件下进行全扫描（Scan），得到蒽醌的质谱图，选择质核比较大，相对丰度高的离子作为产物离子。再用MRM 方式扫描，为保证扫描结果的准确度，按待测组分保留时间分组，使待测物有充足的时间扫描。分别选择了丰度较高的两组离子m/z 208，180，m/z 208，152 为定量和定性离子对，对产物离子进行扫描。为提高检测的灵敏度，根据离子信息，选取不同的碰撞能量观察离子对的响应情况，最终选取了10 eV 做为定量和定性离子对的碰撞能量。
2.3 样品的基质效应
气相色谱串联质谱法测定样品时，有时基质对待测物的离子具有抑制或增强效应，因此选用内标法定量以提高灵敏度和准确性。分别制备用空白基质样品溶液和乙腈稀释的蒽醌和蒽醌-D8 标准工作溶液，对空白茶叶样品进行低、中、高3 个浓度的添加水平试验，用内标法进行定量，乙腈配制与空白基质样品溶液配制的工作曲线回收率没有明显差异，比较接近，故选用了乙腈配制标准工作液。不同溶剂蒽醌的加标回收率和相对标准偏差见表3。
表3 不同溶剂蒽醌的加标回收率和相对标准偏差
Table 3 The recovery rate and relative standard deviation（RSD）of anthraquinone in different solvents
标准稀释溶剂添加水平/（ng/mL） 回收率/%RSD/%乙腈 20 90.5～93.8 3.11 50 90.1～95.6 3.35 200 93.2～96.8 2.74空白基质样品溶液 20 90.6～93.7 2.95 50 89.9～95.8 3.69 200 92.7～96.4 2.57
2.4 样品前处理条件的优化
2.4.1 提取效应
为了测试茶叶样品加水后检测，对检测结果有无影响。试验称取了8 份蒽醌阳性茶叶样品，其中4 份加水3 mL，涡旋30 s 润湿样品，另4 份不加水，分别加入10 mL 乙腈，后续步骤按照1.3.3.1 和1.3.3.2 提取、净化。试验数据显示，茶叶样品加水润湿后再加溶剂提取、净化，回收率更高。结果见表4。
表4 样品测试结果比较
Table 4 The comparison of sample results
样品编号 加水样品结果/（mg/kg） 不加水样品结果/（mg/kg）1# 0.021 5 0.010 4 2# 0.024 8 0.011 8 3# 0.029 6 0.013 9 4# 0.026 8 0.012 1
2.4.2 样品净化的选择
分别选用了SPE 小柱和QuEChERS 两种净化方式进行比较。首先选用了TPC（ProElut TPC-2 固相萃取柱，6 mL，迪马公司）小柱填充物上加入1 g 无水硫酸钠，用 10 mL 乙腈-甲苯（3+1，体积比）活化；乙腈提取液 5.0 mL 上样，弃去流出液；用 8 mL 甲苯-乙腈（1+3，体积比）淋洗，弃去流出液；再用12 mL 甲苯-乙腈（1+3，体积比）洗脱，抽干，收集洗脱液。40 ℃氮吹浓缩至近干，加 1.0 mL 乙腈溶解残渣，涡旋 1 min，8 000 r/min 离心5 min，上清液过0.22 μm 聚四氟乙烯过滤膜，待测定。QuEChERS 净化方式一：取乙腈提取液约8 mL，加入0.8 g 无水硫酸钠，0.8 g 石墨化炭黑粉末和0.4 g C18 固相吸附剂，涡旋 1 min，8 000 r/min 离心 5 min。取上清液5.0 mL，40 ℃氮吹浓缩至近干，加1.0 mL 乙腈溶解残渣，涡旋1 min，以8 000 r/min 离心5 min，上清液过0.22 μm 聚四氟乙烯过滤膜，待测定。QuECh－ERS 净化方式二同1.3.3.2。不同净化方式对蒽醌回收率的影响见图6。
图6 不同净化方式对蒽醌回收率的影响
Fig.6 The effect of different purification ways on the recovery rate of Anthraquinone
图6 检测结果表明，选用QuEChERS 净化方式二净化效果较好和回收率最高，因此选用了1.3.3.2 QuEChERS 净化方式。
2.5 线性范围及检出限
在本试验条件下，按照1.3 的试验条件进行测定，以蒽醌的浓度为横坐标，定量离子对（208＞180）的峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标绘制标准曲线。结果显示：蒽醌在10 ng/mL～200 ng/mL 范围内线性关系良好。同时做空白样品加标试验，以3 倍信噪比计算检出限（limit of detection，LOD），以信噪比 10 倍计算定量限（limit of quantitative determination，LQD），结果见表5。
表5 蒽醌的线性方程、线性范围、相关系数、LOD、LQD
Table 5 The linear equation，linear range，correlation coefficient，LOD，LQD of anthraquinone
化合物线性方程线性范围/（ng/mL）相关系数（r）LOD/（μg/kg）LQD/（μg/kg）9，10-蒽醌 Y=0.016 2x-0.005 8 10～200 0.999 5 3 10
2.6 加标回收率和精密度
选取了未检出蒽醌的绿茶、红茶、乌龙茶、白茶4种样品，分别称取2 g（精确至0.001 g）样品于50 mL离心管中，分别添加质量浓度为20、50、200 ng/mL 的标准溶液，每个添加水平取6 份平行样，充分混匀后，按照最佳前处理和色谱质谱分析条件进行测定，回收率在 87.1%～98.4%之间，RSD 为 1.23%～4.12%，结果见表6。茶叶样品总离子流图见图7，茶叶样品加标总离子流图见图8。
表6 蒽醌的加标回收率和相对标准偏差
Table 6 The recovery and relative standard deviation（RSD）of anthraquinone
样品名称 添加水平/（ng/mL）回收率/%RSD/%绿茶 20 88.5～94.4 4.01 50 89.8～95.6 3.75 200 91.5～97.1 2.89红茶 20 92.5～96.8 2.15 50 89.4～96.1 3.89 200 90.2～95.7 1.97乌龙茶 20 87.1～97.4 4.12 50 90.8～94.3 1.89 200 93.4～97.3 1.29白茶 20 91.5～95.8 2.14 50 93.8～98.4 2.09 200 95.4～98.4 1.23
2.7 样品测定
随机采集市售茶叶50 份，包括绿茶15 份、红茶15 份、乌龙茶10 份、白茶10 份。其中蒽醌检出12 份，检出率24.0%，其中红茶检出率最高为33.3%，白茶检出率最低为13.3%；超标8 份，超标率为16.0%，其中、绿茶 2 份、红茶 3 份、乌龙茶 2 份、白茶 1 份。通过测定结果可以看出，茶叶中的蒽醌确有检出。该方法适用于茶叶中蒽醌的测定。
3 结论
本研究通过对茶叶样品的前处理条件和色谱质谱条件的优化，选择了最佳检测条件，实现了对茶叶中蒽醌的测定，达到了很好的分离效果。该方法具有操作简便、线性范围宽、检出限低、灵敏度高、杂质干扰少及结果准确可靠等优点。因茶叶中干扰物复杂，本文选用了QuEChERS 净化方式，选用了无水硫酸钠、
图7 茶叶样品的总离子流图
Fig.7 The total ion chromatogram of tea sample
图8 茶叶样品加标的总离子流图
Fig.8 The total ion chromatogram of adding tea sample
PSA 粉末和C18 固相吸附剂，既能实现茶叶中复杂干 扰物的去除又能实现待测物的完全保留和洗脱，实现了气相色谱串联质谱法对茶叶中蒽醌的定量检测，满足了茶叶中蒽醌的分析测试要求。
[1]COMMISSION REGULATION.Amending Annexes II,III,IV and V to Regulation (EC)No 396/2005 of the European Parliament and of the Council as regards maximum residue levels for anthraquinone,benfluralin, bentazone,bromoxynil, chlorothalonil, famoxadone, imazamox,methyl bromide,propanil and sulphuric acid in or on certain products[R].European Union： Official Journal of the European Union,2014,L308：3-59
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