三聚氰胺的单分子含氮量较高，它不能在体内代谢，过多的摄入会严重危害人体健康。我国卫生部等相关部门规定[1]：婴儿配方食品中三聚氰胺的限量值为1 mg/kg，其他食品中三聚氰胺的限量值为2.5 mg/kg。因此快速有效地检测奶制品中的三聚氰胺是食品安全领域的迫切需求。目前，用于三聚氰胺的检测方法主要有气相色谱-质谱联用法[2]、液相色谱-质谱联用法[3-4]、高效液相色谱法[5-6]等。但上述种方法的样品前处理步骤繁琐、耗时长、技术成本高，不利于快速检测。
拉曼光谱（Raman spectroscopy）是一种能够表征分子振动能级的光谱，具有极高的分子特异性，但其散射强度较弱且易受到荧光干扰[7]。1974年Fleischmann等[8]在粗糙银电极表面获得吡啶的增强拉曼散射信号，这种表面增强效应与金属粗糙表面相关，该效应被称为表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）效应。SERS 技术快速、灵敏、无损，具备分子指纹专一性和单分子灵敏性的特点，能在分子水平上提供物质结构的丰富信息，已逐渐成为化学、生物、环境、食品等领域一种强有力的检测手段[9-12]。在食品检测领域，SERS 方法检测三聚氰胺引起了人们广泛的研究兴趣。汤俊琪等[12]采用碱性银胶表面增强拉曼光谱技术分析了牛奶中的三聚氰胺，该试验未对牛奶进行预处理，蛋白质含量高的奶制品基质会影响分析物与基底之间的吸附，拉曼增强效果不明显；且银胶易被氧化，稳定性及均一性不强。
因此本试验使用乙腈提取奶粉中的三聚氰胺，以去除基质干扰，将均一性及稳定性较强的Au@Ag NPs作为增强基底，对三聚氰胺进行SERS 检测。本方法能有效降低基质对待测分析物的干扰，使得待测分析物与增强基底更好的结合，进而提高三聚氰胺的检测灵敏度。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
三聚氰胺标准品（纯度99.05%）：Dr.Ehrenstrofer GmbH 公司；乙腈（色谱纯）：MERCK 公司；氯化钠（优级纯）、抗坏血酸（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）：国药集团化学试剂公司；氯金酸（纯度99.99%）：J & K Scientific 公司；柠檬酸三钠（纯度99%）：J & K Scientific 公司；硝酸银（分析纯）：西陇科学股份有限公司。
便携式拉曼光谱仪（FoodDefender RM）：Thermo Fisher Scientific 公司；超纯水仪（型号 A10）：Milli-Q 公司；高速离心机（型号 A-14C）：Sartorius 公司；磁力搅拌仪（型号C-MAG HS7）：IKA 公司；超声仪（型号S300H）：Elmasonic 公司；紫外-可见分光光度计（型号UV2700）：岛津公司。
1.2 试剂配制
5.0 mol/L NaCl 的制备：准确称取 29.22 g 的 NaCl，用超纯水定容至100 mL。必要时可稀释到1.0 mol/L。
5.0 mol/L NaOH 的制备：准确称取20.00 g 的NaOH，用超纯水溶解后转移定容至100 mL。必要时可稀释到1.0 mol/L。
金溶胶 Au NPs（Nanoparticles 纳米颗粒）的制备[13]：精确称取0.050 g 氯金酸于500 mL 容量瓶，用超纯水溶解并定容，得到0.1 g/L 的氯金酸溶液。精确称取1.000 g 柠檬酸三钠于100 mL 容量瓶，用超纯水定容，得到10 g/L 的柠檬酸三钠溶液。准确量取100 mL 氯金酸溶液于三口烧瓶，在磁力搅拌速率为1 100 r/min 的条件下油浴加热至沸腾（约150 ℃），迅速速加入1 mL 上述柠檬酸三钠溶液，继续加热至颜色呈酒红色后持续加热15 min，即得到酒红色的金溶胶溶液，冷却后倒入棕色瓶中，4 ℃避光保存。
银溶胶 Ag NPs 的制备[14]：称取 45.00 mg AgNO3 于圆底烧瓶中，加入250 mL 超纯水溶解，安装好冷凝回流装置，加热至沸，立刻加入5 mL 质量浓度为10 g/L柠檬酸三钠水溶液，继续加热1 h 后停止，颜色依次呈现淡黄、深黄、黄绿、灰色。冷却至室温（25 ℃）后于冰箱内4 ℃避光保存。
银包金溶胶 Au@Ag NPs 的制备[15]：取 50 mL 的 2×10-4 moL/L 氯金酸水溶液于圆底烧瓶，油浴加热至沸，磁力搅拌下迅速加入0.74 mL 的10 g/L 柠檬酸三钠溶液，继续加热5 min，至液体呈红色不变色，冷却至室温（25 ℃）。取3 mL 上述红色液体于10 mL 容量瓶中，加入400 μL 0.1 mol/L 抗坏血酸，并用磁力搅拌器搅拌，边搅拌边逐滴加入1 mmol/L AgNO3 溶液（每次添加10 μL，每隔 30 s 加一次），共加入 AgNO3 溶液 0.9 mL，所得Au@Ag NPs 于冰箱内4 ℃避光保存。
1.3 样品检测方法
样品处理方法：取0.500 g 奶粉于试管中，加入3 mL乙腈，超声2 min，静置20 s，用吸管吸取上清液至离心管，以10 000 r/min 离心5 min。取2 mL 上清液于试管中，加入凝聚剂（1 mL 的 5 mol/L NaCl 和 1 mL 的 1 mol/L NaOH），振荡20 s 静置分层，取1 mL 下层溶液至1.5 mL 离心管，以 10 000 r/min 离心 5 min，取上清液50 μL 于拉曼样品池，加入 200 μL 水，混匀后加 50 μL增强基底Au@Ag NPs，混匀4 min 后置于便携式拉曼光谱仪中测定。
测定条件：激光光源波长785 nm，激光光源功率为250 mW，光谱采集范围250 cm-1～2 875 cm-1。为了保证自制银包金溶胶Au@Ag NPs 增强信号的重现性，得到的数据具有说服力，每个样品需重复3 次试验，每次试验需采集5 条光谱计算其平均值。
2 结果与分析
2.1 三聚氰胺标准溶液的拉曼光谱图及峰归属
三聚氰胺的常规拉曼光谱图如图1所示。
图1 三聚氰胺的SERS 信号图
Fig.1 SERS signal diagram of melamine
在704、1 072 cm-1 附近的特征峰在图谱中清晰可见。其中704 cm-1 为环呼吸振动峰，1 072 cm-1 为C-NC 键弯曲振动峰[16]。上述谱峰均可作为定性鉴别三聚氰胺分子的特征谱峰。
2.2 凝聚剂的考察
8 份3 mg/kg 的加标奶粉使用不同的凝聚剂按1.3试验方法进行测定，得到结果见图2。
图2 不同凝聚剂对SERS 信号的影响
Fig.2 Effect of different coagulants on SERS signal
仅使用NaOH 作为凝聚剂时，特征峰信号强，但基线噪音波动大；仅使用NaCl 作为凝聚剂时，无拉曼信号出现。这说明NaOH 可使拉曼信号增强，而NaCl 可平滑基线噪音，故使用NaCl 与NaOH 的混合溶液作为凝聚剂。使用1 mol/L NaCl+1 mol/L NaOH 作为凝聚剂时，各特征峰信号均很弱；使用1 mol/L NaCl+5 mol/L NaOH 作为凝聚剂时，1 072 cm-1 处的特征峰信号较弱。使用5 mol/L NaCl+1 mol/L NaOH 或者5 mol/L NaCl+5 mol/L NaOH 作为凝聚剂时，各特征峰信号清晰可见，且基线平稳，这是因为该溶液能有效的控制金属纳米颗粒的表面化学，如pH 值、离子强度、结构等，使得分析物与金属纳米颗粒良好接触，等离子体共振被激发，从而得到较好的拉曼增强效果[17]。选择使用5 mol/L NaCl+1 mol/L NaOH 作为凝聚剂。
2.3 三聚氰胺与增强基底的反应时间考察
将3 mg/kg 的加标奶粉按1.3 试验方法分别在0、1、2、3、4、5、6 min 进行测定，得到结果见图 3。
图3 反应时间对SERS 信号的影响
Fig.3 Influence of reaction time on SERS signal
加入增强基底Au@Ag NPs 后，三聚氰胺需要一定的时间与其反应，4 min 即完成反应，4 min 后所测得的拉曼光谱信号无明显差异，可见Au@Ag NPs 与三聚氰胺反应迅速，且两者结合稳定。4 min 后即可测定。
2.4 比较Au@Ag、Au和Ag NPs基底活性
2.4.1 3 种纳米粒子的紫外可见吸收光谱（ultravioletvisible absorption spectrum）表征
将 1.2所制备的 3 种纳米粒子 Au@Ag NPs、Ag NPs、Au NPs 分别置于紫外-可见分光光度计测定，得到结果见图4。
图4 Au@Ag、Au 和 Ag NPs 的 UV-vis 光谱
Fig.4 UV-vis spectra and sol color of Au@Ag，Au and Ag NPs
1 mmol/L AgNO3 加入量为 0.9 mL 的 Au@Ag NPs显明亮的黄色，不同于灰色的Ag NPs 和红色的Au NPs。此时的Au@Ag NPs 的最大吸收峰位与Ag NPs 接近。比较Au@Ag NPs 和Ag NPs 的UV-Vis 光谱可观察到，Ag 谱线吸收峰略不对称且相应的半峰宽比Au@Ag NPs 宽，说明Au@Ag NPs 比纯Ag NPs 的颗粒更均匀，分散性更好。Ag 壳共振变强Au 核共振弱，结果Au@Ag NPs 共振范围从320 nm 到550 nm，共振峰宽且强，这使得它比纯金属Au 和Ag NPs 有略强的增强效果。
2.4.2 3 种纳米粒子的三聚氰胺SERS 比较
3 份3 mg/kg 的加标奶粉分别使用金溶胶Au NPs、银溶胶Ag NPs、银包金溶胶Au@Ag NPs 作为增强基底，按1.3 试验方法进行测定，结果见图5。
图5 3 种纳米粒子的三聚氰胺SERS 信号
Fig.5 Melamine SERS signal of three kinds of nanoparticles
使用金溶胶Au NPs 做为增强基底时，荧光很强，无拉曼信号；而使用银溶胶Ag NPs 或银包金溶胶Au@Ag NPs 作为增强基底时，各个特征峰响应信号较强，能得到很好的拉曼图谱。说明金纳米颗粒对三聚氰胺无SERS 增强效应，银纳米颗粒能有效的增强三聚氰胺的SERS 信号。而Au@Ag NPs 溶胶表面为银纳米颗粒，即能增强三聚氰胺的SERS 信号，又具有金溶胶良好的均匀性、分散性和稳定性[15]，故选择Au@Ag NPs溶胶作为增强基底。
2.5 三聚氰胺标准溶液与基质加标的拟合曲线对比
分别取 0.5 mL 的 0.3、0.5、1、2、3、5 μg/mL 三聚氰胺标准溶液于试管中，按1.3 的检测方法进行测定，所得拉曼光谱图见图6。
图6 三聚氰胺标准溶液的SERS 信号
Fig.6 SERS signal of melamine standard solution
图中均有明显的特征峰，且基线平稳。选择704cm-1处特征峰进行定量，将其换算为1 000 cm-1 曝光的峰高强度，并与标准溶液的浓度做归一化线性拟合处理，所得标曲见图7，三聚氰胺在该浓度范围内有良好的线性关系。
图7 三聚氰胺标准溶液的拟合曲线
Fig.7 Fitting curve of melamine standard solution
称取0.5 g 奶粉6 份，分别加入一定量的三聚氰胺标准溶液，得到浓度为 0.3、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mg/kg的加标样，按1.3 的检测方法进行测定，所得拉曼光谱图见图8，同理绘制拟合曲线见图9。
图8 基质加标三聚氰胺的SERS 信号
Fig.8 SERS signal of matrix addition melamine
图9 基质加标三聚氰胺的拟合曲线
Fig.9 Fitting curve of matrix addition melamine
三聚氰胺在该基质加标浓度范围内有良好的线性关系，满足定量测定要求。
2.6 检出限的确定
将三聚氰胺含量为0.3 mg/kg 的加标奶粉按1.3操作并测定10 次，选择704 cm-1 处特征峰读出信噪比，用3 倍信噪比求得检出限为0.008 5 mg/kg。该值远低于GB/T 22388-2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》[18]方法一的定量限2 mg/kg。
2.7 样品测定及加标回收试验
将随机购买的2 批实际样品分别按1.3 操作，为了减小基质干扰，采用基质加标曲线计算其浓度，2 批样品均未检出三聚氰胺。2 批实际样品均做加标回收试验，每个加标水平分别取6 份平行样，加标后浓度分别为 1、3、5 mg/kg，所得 SERS 信号图见图10、11，结果如表1所示。回收率在71.07%～91.15%之间，相对标准偏差（n=6）在1.52%～4.22%之间，该方法有较高的准确度和重现性，适用于奶粉中的三聚氰胺检测。
图10 样品1 各浓度加标试验的平均拉曼光谱图
Fig.10 Average SERS signal of different concentrations plus standard sample1
图11 样品2 各浓度加标试验的平均拉曼光谱图
Fig.11 Average SERS signal of different concentrations plus standard sample2
3 结论与讨论
本研究建立表面增强拉曼光谱快速测定奶粉中三聚氰胺的方法。用乙腈提取奶粉中的三聚氰胺，去除基质对拉曼检测的影响；制备三种纳米粒子并用UV-Vis 对其进行表征，得知Ag@Au NPs 有较好均匀性、分散性及拉曼增强效果；比较3 种纳米粒子对三聚氰胺的拉曼增强效果再次验证Ag@Au NPs 的SERS 增强效果较好；优化凝聚剂、反应时间等拉曼增强条件，以获得最佳的SERS 信号。本方法检出限为0.008 5 mg/kg，回收率在71.07%～91.15%，RSD 相对标准偏差（n=6）在1.52%～4.22%，准确度及精密度好，灵敏度高，操作简单，10 min 内能完成检测，可实现快速测定奶粉中三聚氰胺，有望应用于其他复杂基质食品的分析测定。
表1 样品的测定结果及加标回收实验结果
Table 1 Determination results of sample and results of recovery experiments
样品 本底值/（mg/kg）加标值/（mg/kg）测得值/（mg/kg） 回收率/% RSD/%样品1 0 1.023 0.727 71.07 1.69 3.068 2.569 83.74 1.52 5.110 4.658 91.15 3.58样品2 0 1.023 0.784 76.64 3.98 3.068 2.497 81.39 4.22 5.110 4.602 90.06 3.46
[1]中华人民共和国卫生部.卫生部等5 部门关于三聚氰胺在食品中的限量值的公告 (2011年第10 号)[EB/OL].http：//www.nhfpc.gov.cn/zwgkzt/wsbysj/201104/51355.shtml[2011-04-20]
[2]杨瑞琴,邢卓,郭震,等.固相微萃取-气质联用法快速筛查肝脏中常见投毒农药[J].分析试验室,2017,36(11)：1259-1263
[3]周艳芬,王芳焕,王泽岚,等.串联双柱固相萃取-高效液相色谱-电喷雾多级质谱法测定盐酸二甲双胍制剂中的盐酸二甲双胍及残留物三聚氰胺和双氰胺[J].色谱,2018,36(2)：159-166
[4]Tkachenko A, Clark J, Knutson N, et al.Investigation of melamine and cyanuric acid deposition in pig tissues using LC-MS/MS methods[J].Food and Chemical Toxicology,2015,80：310-318
[5]Faraji M,Adeli M.Sensitive determination of melamine in milk and powdered infant formula samples by high-performance liquid chromatography using dabsyl chloride derivatization followed by dispersive liquid-liquid microextraction [J].Food chemistry,2017,221：139-146
[6]孙治安,祁玉霞,王霞,等.三聚氰胺磁性表面分子印迹聚合物的制备及其在牛奶样品中的应用[J].色谱,2018,36(8)：716-722
[7]段涛,彭同江,唐永建.表面增强拉曼光谱技术在纳米材料研究中的新进展[J].材料导报,2008,22(11)：93-97
[8]Fleischmann M,Hendra P J,and Mc Quillan A J.Raman spectra of pyridine adsorbed at a silver electrode[J].Chemical Physics Letters,1974,26(2)：163-165
[9]Mahmoud K A, Zourob M.Fe3O4/Au nanoparticles/lignin modified microspheres as effectual surface enhanced Raman scattering(SERS)substrates for highly selective and sensitive detection of 2,4,6-trinitrotoluene(TNT)[J].Analyst,2013,138(9)：2712-2719
[10]Zhu C, Meng G, Zheng P, et al.A Hierarchically Ordered Array of Silver-Nanorod Bundles for Surface-Enhanced Raman Scattering Detection of Phenolic Pollutants[J].Advanced Materials, 2016,28(24)：4871-4876
[11]朱颖洁,郭磊,刘易,等.基于壳层隔绝纳米粒子和在线裂解-吹扫捕集的血液氰化物表面增强拉曼光谱快速检测方法[J].分析化学,2017(5)：627-632
[12]汤俊琪,田超,曾崇毅等.碱性银胶的表面增强拉曼效应及对牛奶中三聚氰胺的检测[J].光谱学与光谱分析,2013,33(3)：709-713
[13]FRENS, G.Controlled Nucleation for the Regulation of the Particle Size in Monodisperse Gold Suspensions[J].Nature Physical Science,1973,241(105)：20-22
[14]Lee P C , Meisel D J J .Adsorption and Surface-Enhanced Raman of Dyes on Silver and God Sols[J].The Journal of Physical Chemistry,1982,86(17)：3391-3395
[15]Lu P, Huang Y, Li C, et al.Detection of triphenylmethane drugs in fish muscle by surface-enhanced raman spectroscopy coupled with Au-Ag core-shell nanoparticles[J].Journal of Nanomaterials,2014,2014：3
[16]林翔.SERS 基底的制备及其用于食品中污染物的快速检测[D].哈尔滨：哈尔滨工业大学,2016：37-38
[17]Alvarez-Puebla R A,Liz-Marzan L M.Traps and cages for universal SERS detection[J].Chemical Society Reviews,2012,41(1)：43-51
[18]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.中华人民共和国国家标准：GB/T 22388-2008[S].北京：中国标准出版社,2008：1-10