不同陈酿方式对干化葡萄酒的影响分析

薛逸轩,王菁,肖世娣,张惠玲*

(宁夏食品微生物应用技术与安全控制重点实验室,宁夏大学农学院,宁夏 银川 750021)

摘 要:以宁夏贺兰山东麓地区赤霞珠葡萄为原料酿造干化葡萄酒,在橡木桶、不锈钢罐中陈酿1年后,采用固相萃取(solid-phase extraction,SPE)气质联用技术(gas chromatograph-mass spectrometer,GC-MS)对其的挥发性物质以及氨基甲酸乙酯进行测定分析。结果表明:经过橡木桶陈酿后的干化葡萄酒,橡木中的单宁、橡木内酯等物质进入到葡萄酒中,参与干化葡萄酒的香气与味感平衡,明显增加了椰子、香草药、玉簪花、紫罗兰等花果香气,优于不锈钢罐储存效果。在氨基甲酸乙酯含量方面,橡木桶陈酿的干化葡萄酒氨基甲酸乙酯含量低于不锈钢罐陈酿。

关键词:干化葡萄酒;陈酿方式;挥发性物质;氨基甲酸乙酯;气相色谱-质谱联用

干化葡萄酒是在葡萄完全成熟后并推迟采摘,在自然条件下进行干化处理,葡萄果实适度失水,可增加糖度、积累香气,使果实物质浓缩。当葡萄原料的糖度等指标达到工艺要求时,除梗破碎、浸渍发酵,陈酿后得到风味独特的优质干红葡萄酒[1]

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)是葡萄酒在酿造过程中产生的一种副产物,具有一定程度的致癌性,随着对葡萄酒中氨基甲酸乙酯形成机理的深入研究,发现酒中的氨基甲酸乙酯是乙醇和尿素、瓜胺酸等在偏酸性的条件下为主要途径生成的。干化葡萄酒相较于其他类型的葡萄酒乙醇含量较高,酒体中氨基甲酸乙酯含量就与酒精度大小有直接的关系。另外,不同的陈酿方式提供光照、酸碱环境以及氧气浓度的不同是造成氨基甲酸乙酯生成的关键影响因素[2]

本试验对两种不同陈酿方式的干化葡萄酒进行挥发性物质、氨基甲酸乙酯含量测定分析并进行对比,获得适合于干化葡萄酒的陈酿方式,为改善葡萄酒中挥发性物质和控制氨基甲酸乙酯的生成提供了理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

赤霞珠葡萄:2016年宁夏贺兰山东麓地区;亚硫酸(食品级):陕西芳草地工贸有限责任公司;XR 型酿酒活性干酵母、OENO 1 型乳酸菌:法国Lamothe-Abiet公司;果胶酶,7500PGNU:丹麦Novozymes 公司。

氨基甲酸乙酯(纯度≥99.0%):西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;氨基甲酸丙酯(纯度≥98.0%):Toronto Research Chemicals Inc;甲醇、正己烷:天津市科密欧化学试剂有限公司;二氯甲烷:天津市大茂化学试剂厂。以上试剂均为高效液相色谱纯。

1.2 仪器与设备

GCMS-QP2010 气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)联用仪:日本岛津公司;手动固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)装置:美国 Supelco 公司;DB-5MS 毛细管色谱柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)、DB-WAX 毛细管色谱柱 (30 m × 0.32 mm × 0.25 μm)、ChemElut 萃取柱12198006:美国安捷伦科技有限公司;NBS-I 型氮吹仪:合肥艾本森科学仪器有限公司;HHS-21-6 型电热恒温水浴锅:上海博讯实业有限公司医疗设备厂;225L 橡木桶:法国 Seguin Moreau。

1.3 试验方法

1.3.1 干化葡萄酒制备

1)原料预处理

在卫生、空旷、干燥、通风状态良好的室内拉好铁丝,每行铁丝相隔50 cm,葡萄采收后,将葡萄悬挂于铁丝上,每串葡萄间隔10 cm 进行干化处理,每天对葡萄颗粒的品质进行观察,确保每颗葡萄无腐烂、无霉变、无污染,如果有腐烂霉变的果实及时剔除。需要时可适当喷撒亚硫酸(食品级)进行防腐处理[3],当葡萄含糖的达到35%左右即可。除梗破碎入不锈钢发酵罐(600 L),按照 60.00 mg/L 添加 6 %亚硫酸(食品级),根据40.00 mg/L 的比例添加果胶酶,于10 ℃条件下浸渍7 d。

2)活化酵母

按0.20 g/L 称取活性酿酒酵母粉,37 ℃水浴活化30 min,在活化过程中加入少量葡萄汁,使酿酒酵母适应葡萄汁发酵环境,备用。

3)接种发酵

在处理好的发酵罐中,接入活化好的酵母菌,于18 ℃~20 ℃低温条件下进行酒精发酵,期间定时打循环,测定葡萄酒温度、比重,并压帽。

4)皮渣分离

当比重小于0.996,还原糖含量在4.00 g/L 左右时进行皮渣分离,倒罐澄清,接种乳酸菌进行苹果酸-乳酸发酵[4]

5)陈酿

发酵结束后,将其下胶过滤,得到的清澈酒体分别入橡木桶和不锈钢罐体中,在16 ℃左右的环境中进行陈酿,陈酿1年后取样测定,对比分析。

1.3.2 干化葡萄酒挥发性物质检测

1)样品前处理

挥发性物质的提取采用顶空固相微萃取(headspace solid phase microextraction,HS-SPME)技术,取一个20.00 mL 顶空瓶,用移液枪加入10.00 mL 待分析的干化葡萄酒,将顶空瓶放入40 ℃的水浴锅中水浴10 min,接着插入CAR/DVB/PDMS 纤维头吸附30 min,GC 解吸 5 min,用于 GC-MS 分析[5-6]

2)色谱-质谱条件

气相色谱条件:色谱柱为DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm),升温程序:40 ℃保持 2 min,以 10 ℃/min 的升温速度升至260 ℃,保持 10 min。载气为He(99.999%),体积流量为3 mL/min,进样口温度为250 ℃,分流进样,分流比为 20 ∶1。

质谱条件为:电子电离源(electronic ionization,EI)电子能量为70 eV,灯丝电流为0.20 mA。检测器电压为350 V。扫描范围为20 m/z~450 m/z,离子源温度200 ℃,出峰时间 1.5 min。

3)定性定量分析

利用美国国家标准技术研究所(National Institute of Standards and Technology,NIST)107 标准谱库自动检索各组分质谱数据,根据化合物的结构特征,与NIST11s.lib 谱库中标准化合物的图谱进行比较判别化合物类型,并根据挥发性风味物质的总离子流色谱图计算香气化合物的百分含量。

4)主体风味成分分析

采用ROAV 法[7]评价挥发性成分对干化葡萄酒风味影响的大小。定义对样品风味贡献最大的组分为ROAVstan=100,其他组分(A)的ROAV 按下式计算:

式中:CA 为各挥发性组分的相对含量,%;TA 为各挥发性组分的香气阈值,mg/kg;Cstan 为对样品风味贡献最大组分的相对含量,%;Tstan 为对样品风味贡献最大组分的香气阈值,mg/kg。

以相对含量最大挥发性物质ROAVstan=100[8],计算得到其他化合物的ROAV;当ROAV 不小于1 时,确定为挥发性物质为干化葡萄酒的主体风味成分;当0.1≤ROAV≤1 时,确定为挥发物质对干化葡萄酒总体风味具有重要贡献[9]

1.3.3 干化葡萄酒氨基甲酸乙酯含量检测

1.3.3.1 标准溶液的配置

称取0.10 g 氨基甲酸乙酯于100.00 mL 容量瓶中,用甲醇溶液定容,配制成1 000.00 mg/L 的储备液;再移取0.50 mL 储备液至50.00 mL 容量瓶中,甲醇定容,配制成10.00 mg/L 的EC 工作液。

称取0.10 g 氨基甲酸丙酯(内标物)于100.00 mL容量瓶中,用甲醇溶液定容,配制成1 000.00 mg/L 的储备液;再移取0.50 mL 储备液至50.00 mL 容量瓶中,甲醇定容,配制成10.00 mg/L 的nPC 工作液。

1.3.3.2 样品前处理

移取0.50 mL 配制好的氨基甲酸丙酯内标工作液于10.00 mL 容量瓶中,用酒样定容后混匀。取10.00 mL的正己烷于固相萃取柱上活化,接着移取3.00 mL 制备好的酒样于固相萃取柱上,流速为5 滴/min 左右,缓慢过柱使存留在小柱中的正己烷流干,静置10 min 使酒样充分吸附后,弃去流出液。再用2.00 mL 的正己烷洗柱,弃去流出液。最后用10.00 mL 二氯甲烷洗脱,并用氮吹仪专用瓶收集洗脱液,直至洗脱液流干,将收集液用氮吹仪30 ℃下氮吹至1.00 mL,转移至色谱样品瓶,待进样分析[10]

1.3.3.3 色谱-质谱条件

气相色谱条件:色谱柱为DB-WAX 毛细管色谱柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm),升温程序:60 ℃保持 5 min,以4 ℃/min 的升温速度升至150 ℃,保持2 min,以10 ℃/min 的升温速度升至200 ℃,保持2 min。载气为He(99.999%),体积流量为 3 mL/min,进样口温度为250 ℃,不分流进样。

质谱条件为:电子电离源(electronic ionization,EI)电子能量为70 eV,灯丝电流为0.20 mA。检测器电压为350 V。扫描范围为20 m/z~450 m/z,离子源温度200 ℃。

1.3.3.4 定性定量分析

利用美国国家标准技术研究所107 标准谱库自动检索各组分质谱数据。使用EC 工作液分别用二氯甲烷制成 1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 μg/L 浓度的 EC 溶液,每一份EC 溶液中加入浓度为10.00 mg/mL 的nPC 0.75 mL,以 EC 浓度为横坐标,EC 和 nPC 的峰面积比值为纵坐标制作标准曲线。将处理好的试样加入内标进样分析的结果,利用标准曲线回归方程(2)计算出试样中EC 含量。

2 结果与分析

2.1 不同陈酿方式处理对干化葡萄酒中挥发性物质的影响

2.1.1 不同处理的干化葡萄酒挥发性物质GC-MS 分析总离子流色谱图

干化葡萄酒挥发性物质GC-MS 分析总离子流色谱图见图1。

图1 不同处理的干化葡萄酒挥发性物质GC-MS 分析总离子流色谱图
Fig.1 Total ion chromatogram of aroma compounds of dry wine under different treatments analysis by GC-MS

2.1.2 干化葡萄酒中挥发性物质分析

两种陈酿方式下干化葡萄酒中挥发性物质成分及相对含量见表1。

表1 两种陈酿方式下干化葡萄酒中挥发性物质成分及相对含量
Table 1 The components and relative contents of volatile matters in dry wine under two vinification methods

注:-表示未查询到资料或未检出。

序号化合物名称感官描述香气阈值/(mg/kg)相对含量/%橡木桶 不锈钢罐酯类1甲酸己酯 苹果、未成熟梅子香气 - 0.26 0.33 2辛酸乙酯 白兰地酒气 0.100[11] 26.44 14.57 3癸酸乙酯 梨子香气 0.490[11] 7.16 6.73 4庚酸乙酯 菠萝香气 0.170[11] 0.19 -5壬酸乙酯 强烈葡萄气 1.200[11] 3.60 7.32 6正己酸乙酯 水果香气 0.001[12] 8.29 3.00 7丙位壬内酯 浓甜椰子气 0.065[11] 0.12 0.09 8 反式-4-癸烯酸乙酯 梨子香气 - 0.34 0.13 9十四酸乙酯 椰子、康乃馨香气 - 0.56 0.12 10 酞酸二甲酯 微具芳香气味 - 11.11 4.94 11 乙酸异戊酯 香蕉香气 1.000[11] - 0.32 12 棕榈酸乙酯 朗姆酒香气 1.500[11] - 0.40 13 油酸乙酯 花香和果香香气 3.500[11] - 0.54 14 乙酸戊酯 香蕉香气 0.050[11] 0.15 0.38 15 乙酸-2-甲基丁酯 香蕉、苹果香气 - 0.32 0.39 16 乙酰乙酸异戊酯 草药香气 - 0.41 -17 3-甲基戊酸乙酯 菠萝、蓝莓香气 - 0.96 3.00 18 丁二酸二乙酯 水果、花香气 353.193[13] 4.81 4.23 19 丁位十一内酯 甜香、乳香气 - - 0.09 20 丁位十二内酯 浓甜桃子果香气 - 0.20 0.06 21 2-甲基戊酸甲酯 浆果、菠萝蜜热带水果香气 - 8.29 -22 辛酸甲酯 桔子或葡萄香气 0.500[11] 0.44 -23 壬酸甲酯 葡萄香气 1.200[11] 0.43 -24 十二烷基异戊酯 微弱油和脂香气 - - 0.30 25 乙酸苯乙酯 甜蜜香气 0.020[11] 0.11 -26 威士忌内酯 威士忌香气 0.080[11] 0.12 -27 己酸异戊酯 苹果和菠萝香气 0.900[11] 0.14 -28 异戊酸异戊酯 苹果和香蕉等水果香气 - 0.16 -29 辛酸-3-甲基丁酯 呈水果香气,稀释后呈白兰地酒香 - 0.17 -30 酞酸二乙酯 微具芳香气味 - 4.79 0.54羰基类31 壬醛 甜橙香气 0.015[11] 0.10 -32 十二醛 强烈紫罗兰香气 0.011[11] 0.20 -33 肉豆蔻醛 脂肪、牛奶香气 0.060[11] - 0.19 34 十六醛 花和蜡的弱香气 - - 0.25 35 癸醛 柑橘皮香气 0.007[11] 0.27 -36 苯乙醛 浓郁玉簪花香气 0.040[11] 3.76 -37 5-羟基-4-辛酮 奶油和豆蔻香气 - - 0.82 38 紫罗兰酮 甜花香、松木香、紫罗兰香 0.002[11] 0.15 -醇类39 苯乙醇 玫瑰花香气 14.000[11] 3.76 0.46羧酸类40 壬酸 脂肪和椰子香气 1.500[11] - 0.12 41 9-癸烯酸 果香和乳香气 - 0.34 -

由表1 可以得出,两种方式下陈酿的干化葡萄酒中共同拥有的挥发性物质16 种。橡木桶陈酿后的干化葡萄酒中有32 种挥发性物质,其中,庚酸乙酯、2-甲基戊酸甲酯、辛酸甲酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、酞酸二甲酯等,构成了干化葡萄酒的菠萝、梨、桔子、香蕉、椰子、葡萄等水果香气,使得葡萄酒的果香浓郁,口感圆润,具有了不同的风味和口感。不锈钢罐酿后的干化葡萄酒中有25 种挥发性物质,特有的十四酸乙酯、乙酸异戊酯、肉豆蔻醛、5-羟基-4-辛酮等,为干化葡萄酒提供了牛奶的乳脂和油脂气味。这是由于不锈钢罐比橡木桶拥有更多的空留空间,存留大量空气,而酒中酚类物质的氧化产物醌可以与相应的高级醇或者氨基酸反应生成脂族醛类等物质[14-16]。橡木桶比不锈钢罐增加更多的是橡木中的物质,在陈酿过程中,橡木中的顺式橡木內酯、4-乙基愈创木酚、香草醛、糠醇等物质融入酒中,其中的酚类物质会发生改变[17],使橡木桶所提供的杏仁气味部分转变成类似草药的气味。橡木桶陈酿下高聚单宁含量较高[18],有利于葡萄酒粗糙感降低,橡木桶对于柔化粗糙单宁感作用优于不锈钢罐,使干化葡萄酒挥发性物质更加复杂富有结构感。

2.1.3 干化葡萄酒主体风味分析

根据表1 中的部分化合物的阈值及相对含量可以得出,橡木桶和不锈钢罐陈酿后,辛酸乙酯在两种不同陈酿方式下相对含量最高,将辛酸乙酯的ROAV 值设为100,算出其他挥发性物质的ROAV 值如表2所示。

表2 两种陈酿方式下干化葡萄酒中挥发性物质的相对气味活度值
Table 2 Relative odor activity value of volatile matters in dry wines under two vinification methods

序号 化合物名称 感官描述 ROAV橡木桶 不锈钢罐1 癸酸乙酯 梨子香气 5.527 0 9.427 4 2 庚酸乙酯 菠萝香气 0.423 4 -3 壬酸乙酯 强烈葡萄气 1.134 5 41.865 0 4 正己酸乙酯 水果香气 3135 2 059 5 丙位壬内酯 浓甜椰子气 0.692 3 0.953 9 6 辛酸甲酯 桔子或葡萄香气 0.332 0 -7 壬酸甲酯 葡萄香气 0.135 8 -8 乙酸苯乙酯 甜蜜香气 2.100 0 -9 威士忌内脂 威士忌香气 0.562 5 -10 壬醛 甜橙香气 2.533 3 -11 十二醛 强烈紫罗兰香气 6.909 1 -12 癸醛 柑橘皮香气 14.571 4 -13 苯乙醛 浓郁玉簪花香气 35.550 0 -14 紫罗兰酮 甜花香、松木香、紫罗兰香28.500 0 -

续表2 两种陈酿方式下干化葡萄酒中挥发性物质的相对气味活度值
Continue table 2 Relative odor activity value of volatile matters in dry wines under two vinification methods

注:-表示未查询到资料。

序号 化合物名称 感官描述ROAV橡木桶 不锈钢罐15 苯乙醇 玫瑰花香气 0.101 0 -16 乙酸异戊酯 香蕉香气 - 0.219 6 17 棕榈酸乙酯 朗姆酒香气 - 0.183 4 18 油酸乙酯 花香和果香香气 - 0.106 1 19 乙酸戊酯 香蕉香气 - 5.220 0 20 肉豆蔻醛 牛奶脂肪香气 - 2.166 7

橡木桶陈酿方式独有的癸醛、苯乙醛和紫罗兰酮(ROAV>10),主要表现为柑橘皮、玉簪花、松木香、紫罗兰香的特征,有些物质虽然含量少,但是物质含量大小与风味特征没有直接的关系,有些物质需要很高浓度才能引起嗅觉反应,有些含量很少就可以被感知,例如,不锈钢罐陈酿方式独有的乙酸戊酯、肉豆蔻醛虽然含量低(10>ROAV>1),但香气贡献大,使酒体具有脂肪香气。

2.2 不同陈酿方式处理对干化葡萄酒中氨基甲酸乙酯的影响

2.2.1 氨基甲酸乙酯标准品内标法测定

由图2 得出标准品氨基甲酸乙酯和氨基甲酸丙酯的出峰时间分别在19.600 min 和22.400 min,通过标准品的时间来确定干化葡萄酒中的氨基甲酸乙酯和氨基甲酸丙酯的出峰时间。

图2 氨基甲酸乙酯和氨基甲酸丙酯标准物质的选择离子色谱图
Fig.2 SIM chromatogram of EC and nPC

2.2.2 不同处理的干化葡萄酒氨基甲酸乙酯GC-MS分析总离子色谱图

不同处理干化葡萄酒氨基甲酸乙酯GC-MS 分析总离子流色谱图见图3。

图3 不同处理的干化葡萄酒氨基甲酸乙酯GC-MS 分析总离子流色谱图
Fig.3 Total ion chromatogram of EC of dry wine under different treatments analysis by GC-MS

2.2.3 不同处理的干化葡萄酒中氨基甲酸乙酯分析

不同处理的干化葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量见表3。

表3 不同陈酿方式下干化葡萄酒氨基甲酸乙酯含量
Table 3 The content of ethyl carbamate in dry wine under different vinification

陈酿方式氨基甲酸乙酯含量/(μg/L)橡木桶 27.642 3不锈钢罐 36.219 0

根据表3 中数据,可以看出,不锈钢罐陈酿方式下氨基甲酸乙酯含量高于橡木桶陈酿方式,氨基甲酸乙酯含量与前体物质浓度、氧气、乙醇的含量、偏碱性的陈酿环境、避光有关。在橡木桶陈酿过程中,酒体在橡木桶中是保持充盈状态的,这就极大地降低了酒体与氧气的接触面积。橡木表面虽然看起来平滑,但是其内部具有很多微小气孔,Nevares 等[19]发现葡萄酒中的乙醇和水能够通过橡木的这些气孔到空气中,并且橡木中的多羟基酚类与乙醇竞争发生醇解反应;曾新安等[20]的结果表明,新鲜葡萄酒入桶后,酒中的溶解氧逐渐减少,3 个月后达到稳定值。这就造成了干化葡萄酒在橡木桶陈酿的过程中酒精度和氧气含量相比较不锈钢罐陈酿要低。同时有机酸含量不断下降[21],陈酿环境更偏向碱性。橡木桶通常置于地窖环境中,近无光照。资料显示,现如今我国只有GB 5009.223-2014《食品安全国家标准食品中氨基甲酸乙酯的测定》等国家标准,尚未出台有关于氨基甲酸乙酯在干化葡萄酒中限量的标准。对比国外相关标准[22],可以得出,橡木桶陈酿下的干化葡萄酒氨基甲酸乙酯含量更低,更加安全。

3 结论

通过试验得出,不同陈酿方式下的干化葡萄酒挥发性物质成分以及主体风味为癸醛、苯乙醛和紫罗兰酮提供;氨基甲酸乙酯含量方面,橡木桶优于不锈钢罐陈酿。

橡木桶中的干化葡萄酒挥发性物质更丰富,辛酸乙酯、癸醛、紫罗兰酮等构成了葡萄酒的白兰地、椰子、葡萄、香草药、玉簪花、紫罗兰等水果、花朵挥发性气味,使得干化葡萄酒果香、花香浓郁,风味独特,口感圆润。不锈钢罐中干化葡萄酒中含有的十四酸乙酯、乙酸异戊酯、肉豆蔻醛提供了似于牛奶的乳脂和油脂挥发性气味。

橡木桶的陈酿环境具有低氧、低乙醇、偏碱性、避光的特性,在一定程度上抑制了氨基甲酸乙酯的生成,在橡木桶陈酿方式下酒体中检测到的氨基甲酸乙酯含量27.642 3 μg/L,不锈钢罐陈酿方式下酒体中检测到的氨基甲酸乙酯含量36.219 0 μg/L。

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Analysis on Different Vinification on the Contents of Dry Wine

XUE Yi-xuan,WANG Jing,XIAO Shi-di,ZHANG Hui-ling*
(Ningxia Key Laboratory for Food Microbial-Applications Technology and Safety Control,School of Agricultural,Ningxia University,Yinchuan 750021,Ningxia,China)

Abstract:The dry wine made from cabernet sauvignon grapes at the eastern foothill of Helan Mountain,Ningxia,was brewed in oak barrels and stainless steel tanks for more than one year.The contents of volatile substances and ethyl carbamate of wine were measured by using the methods of solid-phase extraction(SPE)and gas chromatograph-mass spectrometer(GC-MS).As a result,in terms of aroma,the tannins and oaklactone of the oak barrels were permeated into the dry wine after brewing,and these substances contributed to the aroma and tastes of the dry wine,significantly promoting fruit aroma such as smell of coconut,fragrant herb,host flower and violet.The fragrance in the oak barrel was stronger than that in the stainless steel tank.In terms of ethyl carbamate content,the content of the ethyl carbamate of the wine produced in oak barrel was lower than that of wine made in stainless tank.

Key words:dry wine;vinification methods;volatile substances;ethyl carbamate;gas chromatograph-mass spectrometer

DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2019.12.024

作者简介:薛逸轩(1995—),男(汉),硕士研究生,研究方向:生物发酵。

*通信作者:张惠玲(1963—),女(汉),教授,研究方向:生物发酵。

引文格式:

薛逸轩,王菁,肖世娣,等.不同陈酿方式对干化葡萄酒的影响分析[J].食品研究与开发,2019,40(12):141-147

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收稿日期:2018-10-17