小米属于谷类作物，是人们最喜爱的粮食之一，其富含碳水化合物、蛋白质、氨基酸、脂肪、矿物质、维生素等多种营养成分，且容易被消化吸收[1-2]。而产于陕北米脂县的小米是我国“四大著名小米”之一，相较于普通小米，营养成分更加丰富，脂肪和蛋白质含量高出1%～3%，含有8 种人体必需氨基酸，营养比例协调[3]。小米醋营养保健，深受大众喜爱[4-8]。徐清萍等曾研究过液化方式对小米醋酒精发酵阶段的影响[9]。于迪等[10]则根据山西老陈醋酿造工艺酿成小米醋，并对发酵过程中总酸、总酯、氨基酸态氮等理化指标进行了测定，对小米醋的挥发性香气成分进行了分析。
香菇[Lentinus edodes（Berk.）sing]又名香菌、花菇、香覃，俗称中国蘑菇，在我国具有悠久的栽培历史，也是世界第二大食用菌。其肉质脆嫩，香气浓郁，含有蛋白质、多种矿物质和维生素，具有很高的食药用价值[11-14]。随着人们生活水平的提高，由香菇制成的食品、药品和保健品等越来越受到人们的青睐[15-16]。目前，我国有一些学者研究过香菇醋的酿造工艺[17-19]。肖玲玲等[20]以废弃香菇柄为原材料，经纤维素酶酶解处理后发酵酿制香菇醋，并通过对酶水解条件的优化，确定了最佳参数。魏登和王柳以香菇和薏米为原料，并在传统食醋酿造方法的基础上研制出一种新型保健醋[21]。
如果将香菇和小米相结合，可以制得兼具二者营养和风味的香菇小米醋。目前有关于香菇枣醋、香菇桃醋、香菇薏米醋、香菇糯米醋等的报道，但还未见对香菇小米醋的研究报导。以香菇和陕北特有的米脂小米为原料进行复合醪发酵，从而提高糖度，制造出一款融合两种原料风味和特色的成品保健醋，获得符合市场需求的产品配方与生产工艺。可以提高两种农产品的综合利用价值，为相关企业开发保健醋等复合发酵饮品提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
优质陕北米脂小米和马铃薯购自延安华润万家超市；香菇菌种和沪酿1.01 醋酸菌由延安大学生命科学学院食用菌研究室提供；液化酶（α-淀粉酶，酶活力24 000 U/mL）、糖化酶（葡萄糖淀粉酶，酶活力150 000 U/mL）：无锡赛德生物技术有限公司；酿酒活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。
1.2 仪器与设备
生化培养箱（LRH-70）：苏州江东精密仪器有限公司；台式恒温振荡器（THZ-D）：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；电热恒温干燥箱（TH70-101-2A）：北京中西远大科技有限公司；高速万能粉碎机（FS）：广州雷迈机械设备有限公司；10L 不锈钢普通发酵罐（BLBIO-10SJV）：连云港百仑生化科技有限公司；酸度计（HI8424）：南通沃特环保科技有限公司；手持式测糖仪（ZG004）：深圳市纵观百汇科技有限公司。
1.3 生产工艺流程
陕北风味香菇小米发酵醋的生产工艺流程：
1.3.1 香菇糖化醪的制备
将马铃薯液态培养基装入发酵罐中，121 ℃灭菌20 min，降至室温（25 ℃）后接入香菇孢子，于 25 ℃，115 r/min 搅拌培养3 d，将获得的香菇菌丝体液过滤，加糖化酶进行糖化，充分糖化后用测糖仪测得香菇糖化醪的糖度为6%。
1.3.2 小米糖化醪的制备
选择优质陕北米脂小米，电烤箱150 ℃烘焙1.5 h。用粉碎机将烘焙过的小米粉碎，加水放入恒温培养箱，再加液化酶60 ℃保持1 h，充分液化后放入120 ℃，111.4 kPa 条件下的高压锅内蒸煮30 min，冷却至室温（25 ℃）后加糖化酶进行糖化，糖化充分后用测糖仪测得小米糖化醪的糖度为39%。小米经过烘焙最后得到的产品醋会带有淡淡的焦香。
1.3.3 复合糖化醪的配制
按照酒精发酵所需的最适糖浓度范围13%～19%，将香菇糖化醪和小米糖化醪按质量比1 ∶1 进行配比，然后加水稀释至混合液糖浓度分别为14 %、16 %、18 %，这样可以使产品醋兼具香菇和小米的营养成分，二者营养价值得到充分的利用。
1.3.4 酒精发酵
将干酵母预先在2%糖浓度下活化1 h 后，加入不同稀释浓度的复合糖化醪中。在各设定的条件下进行酒精发酵72 h，通过正交试验得出最佳因素配比，并在最佳因素配比下进行重复酒精发酵试验得出发酵后的酒精浓度。
1.3.5 醋酸发酵
将醋酸菌于32 ℃活化20 h 后，转入盛醋酸菌活化培养基三角烧瓶中，用纱布封口，于32 ℃、转速180 r/min 条件下活化培养24 h（总酸度＞1%）。活化后的醋酸菌液接入酒精发酵液中，并用通气泵持续通入气体，保持空气流量为1 ∶0.2（发酵液与空气的体积比），在各设定条件下进行醋酸发酵7 d 左右，通过正交试验得出醋酸发酵所需的最佳因素配比，并在最佳因素配比下进行重复醋酸发酵试验测出醋酸浓度。
1.3.6 成熟加盐
为提高发酵醋的风味及色泽，在醋酸发酵完全的发酵液中加入质量分数1.0%食盐以抑制醋酸菌活性和防止其它细菌滋生，静置1 d 澄清后过滤，将上清液用巴氏消毒法进行灭菌后，即制得香菇小米发酵醋成品。
1.4 生产工艺的确定
1.4.1 酒精发酵正交试验设计
选取影响复合糖化醪酒精发酵的3 个主要因素发酵温度、酵母液添加量、发酵糖度及设置空列，进行四因素三水平的正交试验设计，因素和水平见表1。发酵72 h 后测量酒精浓度。
表1 酒精发酵正交试验因素水平表
Table 1 Orthogonal experiment factor level table of alcohol fermentation
水平 A 发酵温度/℃B 酵母液添加量/%C 发酵糖度/% D 空列1 27 5 14 2 30 7 16 3 33 9 18
1.4.2 醋酸发酵正交试验设计
通风发酵可缩短发酵时间，以转速150 r/min 为通气条件，以酒精发酵阶段产生的酒精量为前提，选取影响醋酸发酵的3 个主要因素发酵温度、醋酸菌使用量和起始pH 值及设置空列，进行四因素三水平的正交试验设计，因素和水平见表2。发酵7 d 后测量醋酸浓度。
表2 醋酸发酵正交试验因素水平表
Table 2 Orthogonal experiment factor level table of acetic fermentation
水平 A 发酵温度/℃B 醋酸菌使用量/%C 起始pH 值 D 空列1 30 5 5.5 2 32 7 6.0 3 34 9 6.5
1.5 品质检测
根据酒精发酵和醋酸发酵正交试验结果确定的香菇小米醋的最佳工艺参数进行酿造，对最终成品醋进行品质检测。
1.5.1 理化指标检测
还原糖（以葡萄糖计）：斐林氏法；总酸（以醋酸计）：滴定法；氨基酸态氮：甲醛法[22]。
1.5.2 微生物指标检测
采用多管发酵法检测成品中大肠菌群的数量，采用固体平板划线法检测成品中的细菌总数。
1.5.3 感官质量评定标准
挑选20 岁～70 岁不同年龄段50 位受试者对香菇小米醋进行感官鉴定，感官指标评定标准见表3。
表3 香菇小米醋感官质量评定标准
Table 3 Standard for sensory quality evaluation of Lentinus edodes millet vinegar
项目 标准 分值色泽 棕褐色 20气味 有小米和香菇特有的香味及浓郁的醋香 20口感 酸味柔和、微甜、味美质鲜 40体态 晶莹透明、有光泽、无悬浮、无浑浊、无沉淀 20综合评价 色泽清亮、香味和谐、质地均匀、酸味柔和纯正、无异味100
2 结果与分析
2.1 酒精发酵正交试验结果
酒精发酵正交试验结果见表4。
表4 酒精发酵正交试验表
Table 4 Orthogonal experiment table of alcohol fermentation
试验号 因素 酒精浓度/%A B C D 1 1 1 1 1 4.1 2 1 2 2 2 7.0 3 1 3 3 3 5.9 4 2 1 2 3 6.5 5 2 2 3 1 7.8 6 2 3 1 2 6.1 7 3 1 3 2 4.5 8 3 2 1 3 5.2 9 3 3 2 1 6.4 K1 17.0 15.1 15.4 18.3 K2 20.4 20.0 19.9 17.6 K3 16.1 18.4 18.2 17.6 k1 5.67 5.03 5.13 6.1 k2 6.8 6.67 6.63 5.87 k3 5.37 6.13 6.07 5.87 R 1.43 1.64 1.5 0.23最优水平 A2 B2 C2
由表4 可知，酒精发酵的发酵温度、酵母液用量和发酵糖度的不同，对发酵液的影响很大。从极差R 值的大小看，酵母液用量的极差最大，其次是发酵糖度，发酵温度的极差最小，但都与空列有很大差异，说明酵母液用量是影响酒精发酵的主要因素，发酵糖度是影响酒精发酵的次要因素，而发酵温度对其影响最小。依据正交试验结果得出的最佳酒精发酵条件为A2B2C2，即发酵温度为30 ℃，酵母液用量为7%，发酵糖度为16%，而从设计的9 组试验得出的最佳条件是A2B2C3，即发酵温度为30 ℃，酵母液用量为7%，发酵糖度为18%。为避免试验结果的偶然误差，对A2B2C2和A2B2C3 进行了重复试验，得出两种条件下酒精浓度分别为7.91%和7.75%。因此，酒精发酵阶段的最佳条件是A2B2C2，即发酵温度为30 ℃，酵母液用量为7%，发酵糖度为16%，得出的酒精浓度最大为7.91%。
2.2 醋酸发酵正交试验结果
醋酸发酵正交试验结果见表5。
表5 醋酸发酵正交试验表
Table 5 Orthogonal experiment table of acetic fermentation
试验号 因素 醋酸浓度/%A B C D 1 1 1 1 1 3.99 2 1 2 2 2 4.97 3 1 3 3 3 4.74 4 2 1 2 3 5.12 5 2 2 3 1 5.43 6 2 3 1 2 5.27 7 3 1 3 2 4.16 8 3 2 1 3 4.20 9 3 3 2 1 5.23 K1 13.7 13.27 13.46 14.65 K2 15.82 14.6 15.32 14.4 K3 13.59 15.24 14.33 14.06 k1 4.57 4.42 4.49 4.88 k2 5.27 4.87 5.11 4.8 k3 4.53 5.08 4.78 4.69 R 0.74 0.66 0.54 0.19最优水平 A2 B3 C2
由表5 可知，醋酸发酵的发酵温度、醋酸菌用量和起始pH 值的不同，对发酵液的影响很大。从极差R 值的大小看，发酵温度的极差最大，其次是醋酸菌用量，起始pH 值的极差最小，但都与空列有很大差异，说明发酵温度是影响醋酸发酵的主要因素，醋酸菌用量是影响醋酸发酵的次要因素，而起始pH 值对其影响最小。依据正交试验结果得出的最佳醋酸发酵条件为A2B3C2，即发酵温度为32 ℃，醋酸菌用量为9%，起始pH 值为6.0，而从设计的9 组试验得出的最佳条件是A2B2C3，即发酵温度为32 ℃，醋酸菌用量为7%，起始pH 值为6.5。为避免试验结果的偶然误差，对A2B3C2和A2B2C3 进行了重复试验，得出两种条件下醋酸浓度分别为5.45%和5.36%。因此，醋酸发酵阶段的最佳条件是A2B3C2，即发酵温度为32 ℃，醋酸菌用量为9%，起始pH 值为6.0，得出的醋酸浓度最大为5.45%。
2.3 产品品质检测结果
2.3.1 理化指标
经检测，香菇小米醋成品中还原糖的含量是1.4 g/100 mL，还原糖主要来源于原料的糖化，后在多种酶的作用下转化为酒精其含量会逐渐降低；总酸达到5.9 g/100 mL，虽未经陈酿，但和普通酿造食醋总酸含量3.5 g/100 mL 相比，产品的酸度提高了40.68%，酸度较高可抑制醋中微生物的生长，防止其腐败变质；氨基酸态氮的含量是0.15 g/100 mL，氨基酸的存在增加了醋的营养，同时对醋的提鲜增香也有较明显的效果。
2.3.2 卫生指标
香菇小米醋成品中微生物检测结果为大肠菌群2.1 MPN/g，菌落总数42 CFU/g；未检出沙门氏菌属、志贺氏菌属、链球菌、葡萄球菌等致病菌。微生物指标检测符合国家相关规定。
2.3.3 感官评价
对50 位受试感官评价者的各项打分进行平均：色泽 18 分、气味 19 分、口感 36 分、体态 18 分，综合评价为91 分。90%以上的评价者认为香菇小米醋成品口感纯正，风味独特，适应市场和消费者的需求。
3 结论与讨论
食醋是日常生活中的一种重要调味品，随着人们健康意识的增强，开发具有保健功能的醋已成为主流趋势。而香菇是具有较高营养及药用价值的真菌，将其引入小米醋，既充分利用了我国的香菇资源，又迎合了营养保健的饮食理念。相较于普通小米酒，试验采用了陕北特有的米脂小米，使制备的香菇小米醋具有独特的陕北风味。
通过对陕北风味香菇小米醋的酿造工艺路线进行探索，采用对酒精发酵和醋酸发酵两阶段的L9（34）正交试验确定了最佳的原料配比及生产条件。得出在酒精发酵过程最佳的发酵温度为30 ℃，酵母液用量为7 %，发酵糖度为16 %；在醋酸发酵过程中最佳的发酵温度为32 ℃，醋酸菌用量为9%，起始pH 值为6.0。在最佳条件下对原料进行发酵试验得出酒精度为7.91%，醋酸浓度为5.45%的香菇小米醋。由于香菇糖化醪是以香菇菌种为原料进行液态深层发酵，相较于子实体更能获得大量具有生理活性的真菌多糖发酵醪，再经酒精发酵和醋酸发酵而成，又融合了小米发酵所得的醋酸，所以产品营养价值均高于单纯的香菇醋和小米醋。
在进行感官品评时，选取了50 位具代表性的不同年龄段受试者的品评意见，能够在一定程度上说明人们对陕北风味香菇小米发酵醋的接受程度，但产品若想走向市场还需进行更加充足的试验性数据检测与产品工艺筛选，以进一步提高产品的品质。该研究结果可为保健醋的开发提供参考。
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